КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

 

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ


Номер 18-16-00071

НазваниеГенетические основы криоустойчивости спермы животных

РуководительНикиткина Елена Владимировна, Кандидат биологических наук

Организация финансирования, регион Федеральное государственное бюджетное научное учреждение «Федеральный исследовательский центр животноводства - ВИЖ имени академика Л.К. Эрнста», г Санкт-Петербург

Период выполнения при поддержке РНФ 2021 г. - 2022 г. 

Конкурс Конкурс на продление сроков выполнения проектов, поддержанных грантами Российского научного фонда по приоритетному направлению деятельности Российского научного фонда «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований отдельными научными группами» (28).

Область знания, основной код классификатора 06 - Сельскохозяйственные науки, 06-204 - Животноводство

Ключевые словаДНК, однонуклеотидный полиморфизм, криорезистентность, геномная селекция, генофондные породы кур, крупный рогатый скот, лошади

Код ГРНТИ68.03.05


СтатусУспешно завершен


 

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ


Аннотация
Генетическая устойчивость к криоконсервации спермы – важная составляющая отбора производителей. Изучение генетической основы признаков, связанных с устойчивостью к замораживанию, может служить источником для разработки новых сред для разбавления и технологий криоконсервации клеток. В процессе работы над Проектом 2018 были изучены особенности криорезистентности спермы Gallus gallus, Bos taurus, Equus ferus caballus. В результате сравнительной характеристики генов, выявлены кандидатные гены, потенциально влияющие на сохранность сперматозоидов после заморозки-оттаивания. Найденные в процессе выполнения проекта кандидатные гены были сопоставлены с функциями ортологичных генов, по публикациям других исследователей. В результате были определены возможные сигнальные пути, нарушения или особенности функционирования которых приводят к снижению устойчивости клеток сперматозоидов к замораживанию. Важными условиями формирования сперматозоида является правильное функционирование генов, связанных с мейозом и созреванием сперматозоидов. Нарушения на этом этапе приводят к необратимым изменениям в клетке, вплоть до потери способности к оплодотворению. Работа генов отвечающих за формирование мембран и различных клеточных структур, связанных с функциями сперматозоидов, тоже важный фактор криорезистентности. Вторым важным условием функционирования сперматозоида является экспрессия генов, подготавливающих сперматозоид к оплодотворению. Это сигнальные пути энергетического обмена – для поступательного движения сперматозоида, и гены кальциевого обмена участвующие в подготовке к капацитации. Изменения в структуре белков могут приводить к преждевременной капацитации и нарушении целостности сперматозоида. Таким образом, проведенные исследования открывают широкие возможности для изучения сигнальных путей взаимодействия белков через поиск полиморфных вариантов кодирующих их генов. Полученные аллели будут включены в поиск ассоциаций с признаками изменений в сперматозоидах после криоконсервации. Таким образом, поиск казуальных молекулярно-генетических маркеров будет являться важной и высокоактуальной частью продолжения проекта по изучению влияния сверхнизких температур на качество спермы у различных видов животных. Продолжение Проекта направлено на решение фундаментальных проблем современной биологии по широкому и углубленному изучению молекулярной архитектуры локусов, связанных с генетической изменчивостью признаков криоустойчивости семени. Подобное широкомасштабное и углубленное исследование с применением современных геномных методов, проводиться впервые. В целом полногеномный поиск ассоциаций с криорезистентностью сперматозоидов соответствует мировому уровню развития современной геномной науки и представляет большой интерес как с точки зрения общего понимания генетики воспроизводства, так и для дальнейшей разработки сельскохозяйственных технологий, в частности. Сохранение ценного генетического материала ценных племенных животных и диких видов предполагает использование криобанков семени. В данном проекте будут использованы молекулярно-генетические маркеры и кандидатные гены, как обнаруженные нами, так и найденные в дальнейшем, результате анализа in silico. Также будут использованы, например данные анализа транскриптома спермы, в том числе и с оценкой различий фертильности замороженной спермы, полученных другими исследователями на разный видах животных и человеке (например, Fraser et al.,2020). Конкретной задачей, на которую направлен Проект 2018 и Проект 2021, является поиск геномных маркеров ассоциациированных с устойчивостью сперматозоидов птицы (петухов разных пород) и млекопитающих (быков и жеребцов), к повреждающему действию низких температур при криоконсервации. Поиск мутаций у различных видов животных, связанных с генетическими проблемами замораживания спермы (для сохранения редких и исчезающих видов, например), является важным и актуальным направлением генетических исследований, что подтверждается появлением множества публикаций в 2020 году на модельных животных.

Ожидаемые результаты
В целом полногеномный поиск ассоциаций с криорезистентностью сперматозоидов соответствует мировому уровню развития современной геномной науки и представляет большой интерес как с точки зрения общего понимания генетики воспроизводства, так и для дальнейшей разработки сельскохозяйственных технологий, в частности. Будут получены: 1. Кандидатные гены качества сперматозоидов после криоконсервации по признаку морфология сперматозодов после замораживания-оттаивания у жеребцов 2. Кандидатные гены качества сперматозоидов после криоконсервации по признаку качество мембран сперматозодов после замораживания-оттаивания у петухов 3. Полиморфные варианты в экзонах 5 общих кандидатных генов, выбранных в результате анализа значимости SNP находящихся в этом районе у разных видов и связанных с преждевременной капацитацией акросом и состоянием мембран. 4. Полиморфные варианты в экзонах 3 общих кандидатных генов, выбранных в результате анализа значимости SNP находящихся в этом районе у всех (включенных в проект) видов по признаку уровня окислительного фосфорилирования у сперматозоидов после оттаивания. 5. Кандидатные гены качества сперматозоидов после криоконсервации по признаку дыхание после замораживания-оттаивания у петухов 7. Системы генотипирования для раннего анализа качества образцов спермы пригодной к замораживанию (отдельно по видам). 8. Новые данные по влиянию аллелей найденных SNPs на фертильность быков. Полученные новые знания по кандидатным генам и маркерным SNPs ассоциированным с признаками качества спермы и фертильностью самцов значительно повысят эффективность сохранения генетического материала ценных племенных животных и диких видов. Это произойдет за счет раннего отбора животных по криоустойчивости семени и появлению предпосылок для разработки систем криопротекторов для замораживания уникальных эякулятов. Выявленные аллели, ассоциированные с признаками изменений в сперматозоидах после криоконсервации, могут быть использованы в селекционных программах по разведению сельскохозяйственных животных. Таким образом, поиск казуальных молекулярно-генетических маркеров будет являться важной и высоко актуальной частью продолжения проекта по изучению влияния сверхнизких температур на качество спермы у различных видов животных. Поэтому, поиск мутаций у различных видов животных, связанных с генетическими проблемами замораживания спермы (для сохранения редких и исчезающих пород и видов животных, например), является важным и актуальным направлением генетических исследований, что подтверждается появлением множества публикаций в 2020 году на модельных животных.


 

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ


Аннотация результатов, полученных в 2021 году
В текущем году был продолжен поиск генетических ассоциаций с криоустойчивостью спермы петухов, жеребцов и быков. Проведена оценка 163 эякулятов 100 жеребцов и 4 образца спермы, выделенной из семенников 4 жеребцов, а также собраны 258 эякулятов от 96 петухов. Проведен поиск полногеномных ассоциаций с морфологией сперматозоидов после замораживания-оттаивания у жеребцов. Было найдено более 100 генетических ассоциаций с морфологическими повреждениями сперматозоидов жеребцов после криоконсервации. В частности, с показателем повреждения головки найдено 52 потенциальных SNP. Так, например, ген PARP11 - моно-АДФ-рибозилтрансфераза, которая опосредует моно-АДФ-рибозилирование целевых белков. Играет роль в стабильности ядерной оболочки и ядерном ремоделировании во время спермиогенеза. PARP11 является новым ферментом, важным для правильного формирования головки сперматозоидов, и идентифицирует его как потенциальный фактор, участвующий в идиопатической тератозооспермии у млекопитающих. Другие найденные гены в результате нашего исследования были связаны с формированием мембран или поддержания осмоса клеток сперматозоидов. Проведен поиск полногеномных ассоциаций с подвижностью клеток, качеством мембран и окислительным фосфорилированием сперматозоидов после замораживания-оттаивания у петухов. Например, полиморфизм, наблюдаемый в гене PHF14 может служить причиной нестойкости мембран сперматозоидов к замораживанию-оттаиванию у петухов. Найдены 28 потенциальных SNP ассоциированных с окислительным фосфорилированием сперматозоидов после замораживания-оттаивания у петухов. Так, найденные значимые SNP подтверждают связь полиморфных вариантов гена RAG2 с реакцией сперматозоидов на блокировку производства АТФ с помощью 2,4-ДНФ. По результатам полногеномного анализа были отобраны потенциальные гены-кандидаты для дальнейшего детального анализа и поиска казуальных SNPs методом секвенирования по Сенгеру. Были выбраны наиболее информативные локусы в аннотированных генах, подобраны специфические праймеры, оптимизированы условия проведения амплификации, и проведено секвенирование экспериментальных групп жеребцов, петухов и быков контрастных по изучаемому признаку - криорезистентности спермы. Было выявлено несколько полиморфных вариантов в каждом из анализируемых локусов аннотированных генов. Экспериментальные данные секвенирования будут обработаны и проанализированы для выявления их ассоциации с фенотипическими признаками качества замороженной спермы. Опубликована 1 работа в журнале Journal of animal science ( Q1), принята к публикации 1 работа в журнале Reproduction in domestic animals, на рецензии 2 работы: в журналах Veterinary Science (Q1) и Animal Bioscience (Q1). Подготовлены 2 работы к публикации. Результаты проекта доложены в 6 докладах на 5 международных конференциях в России и за рубежом. У проекта есть свой инстаграм аккаунт - rscf_cryosemen_grant.

 

Публикации

1. Крутикова А.А., Дементьева Н.В., Никиткина Е.В., Кудинов А.А, Позовникова М.В., Косач Е., Атрощенко М.М., Митрофанова О.В., Племяшов К.В. Promising loci and genes for cryoresistance of spermatozoa identified by a Genome-Wide Association Study in horses Reproduction in domestic animals, - (год публикации - 2021)

2. Никиткина Е.В., Дементьева Н.В., Щербаков Ю.С., Крутикова А.А., Мусидрай А.А., Плешанова Н.В., Самойлов О.И. 501 Late-Breaking: Search for Genomic Associations with Cryo-resistance of Sperm in Animals Journal of Animal Science, Volume 99, Issue Supplement_3, November 2021, Pages 25–26 (год публикации - 2021) https://doi.org/10.1093/jas/skab235.043


Аннотация результатов, полученных в 2022 году
В отчетном году продолжилась оценка спермы жеребцов и быков после криоконсервации. Особое внимание было уделено оценке сохранности окислительного фосфорилирования, методом измерения изменения дыхания сперматозоидов после добавления 2,4 ДНФ и сохранности мембран клеток, оцененных проточной цитометрией с помощью красителя пропидиум иодида. Стимуляция дыхания 2,4 ДНФ у жеребцов варьировала от 1,00 до 5,61 раз, у быков от 1,00 до 2,69 раз. Сохранность мембран у жеребцов была от 17 до 68%, у быков 42 до 69%. Проведена оценка оплодотворяющей способности быков в 20 хозяйствах Ленинградской области, проанализированы данные по 60000 осеменённых коров. Оплодотворяющая способность варьировала от 27,3 до 86%. В результате поиска геномных ассоциаций с окислительным фосфорилированием сперматозоидов после замораживания-оттаивания у жеребцов было найдено 23 значимых полиморфизма, выбрано 14 кандидатных генов - перспективными для подробного изучения являются гены RXFP1, TMEM 144, QRFPR. У быков было найдено 1 значимый полиморфизм, выбрано 2 кандидатных гена - перспективными для подробного изучения являются гены OR7H3 и OR7D2. В результате поиска геномных ассоциаций с признаком процент поврежденных мембран сперматозоидов после замораживания-оттаивания у жеребцов было найдено 4 предположительно значимых полиморфизма, выбрано 3 кандидатных гена, а у быков было найдено 4 значимых полиморфизма, выбрано 4 кандидатных гена. Поиск полногеномных ассоциаций с оплодотворяющей способностью криоконсервированной спермы быков выявил предположительно 3 значимых SNP. Была выявлена достоверная связь генов NAV2 и PDE со стимуляцией дыхания 2,4ДНФ и количеством поврежденных мембран после оттаивания, гена RAG2 со стимуляцией дыхания 2,4-ДНФ после оттаивания у петухов. Выявлена достоверная связь гена GRM8 со всеми показателями качества спермы после оттаивания у жеребцов, гена NME7 на количество повреждений в области хвоста и шейки сперматозоидов и количество нормальных сперматозоидов после оттаивания у быков, гена ESR 665 с набухшими акросомами после криоконсервации у быков. Разработаны 3 тест-системы для генотипирования быков, 2 тест-системы для генотипирования жеребцов и 5 тест-систем для генотипирования петухов. Результаты гранта опубликованы в 3 изданиях (Q1), представлены на 5 конференциях в России и за рубежом.

 

Публикации

1. Нииткина Е.В., Шапиев И.Ш.,Мусидрай А.А., Крутикова А.А., Племяшов К.В., Богданова С.С., Лейбова В.Б., Ширяев Г.В., Турлова Ю.Г. Assessment of Semen Respiratory Activity of Domesticated Species before and after Cryopreservation: Boars, Bulls, Stallions, Reindeers and Roosters Veterinary Sciences, №9(10) стр.513 (год публикации - 2022) https://doi.org/10.3390/vetsci9100513

2. Никиткина Е.В., Дементьева Н.В., Щербаков Ю.С., Атрощенко М.М., Кудинов А.А., Самойлов О.И,, Позовникова М.В, Дысин А.П., Крутикова А.А., Мусидрай А.А., Митрофанова О.В., Племяшов К.В., Гриффин Д.К., Романов М.Н. Genome-wide association study for frozen-thawed sperm motility in stallions across various horse breeds Animal Bioscience, № 35 (12) (год публикации - 2022) https://doi.org/10.5713/ab.21.0504

3. Никиткина Е.В., Мусидрай А.А., Дементьева Н.В., Плешанов Н.В., Шербаков Ю.С., Племяшов К.В. Genome‐wide Association Study of Oxidative Phosphorylation in Cocks Semen after Freezing The FASEB Journal, № 36 (год публикации - 2022) https://doi.org/10.1096/fasebj.2022.36.S1.L7749


Возможность практического использования результатов
не указано