КАРТОЧКА ПРОЕКТА,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

 

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ


Номер 21-64-00017

НазваниеМодификация нуклеиновых кислот и репарация ДНК как источник новых инструментов управления геномами

РуководительПышный Дмитрий Владимирович, Доктор химических наук

Организация финансирования, регионФедеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт химической биологии и фундаментальной медицины Сибирского отделения Российской академии наук, Новосибирская обл

Годы выполнения при поддержке РНФ 2021 - 2024 

КонкурсКонкурс 2021 года «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований по поручениям (указаниям) Президента Российской Федерации» (генетические исследования)

Область знания, основной код классификатора 04 - Биология и науки о жизни, 04-208 - Молекулярная биология

Ключевые словагеномное редактирование, CRISPR/Cas9, репарация ДНК, повреждение ДНК, ответ на повреждение ДНК, белок-белковые взаимодействия, белок-нуклеиновые взаимодействия, поли(ADP-рибоза)полимеразы, РНК-связывающие белки, синтез нуклеиновых кислот, белковая инженерия, редакторы оснований, эпигенетические редакторы, направляющие РНК, фосфорилгуанидины

Код ГРНТИ34.15.00, 34.15.23


 

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ


Аннотация
«Революция геномного редактирования», связанная с появлением системы CRISPR/Cas9, привела к возможности прецизионного изменения генома. Значительное число исследований в мире посвящено поиску способов увеличения эффективности и точности геномного редактирования, а также подходов к регуляции молекулярно-генетических процессов, основанных на комплементарной адресации молекул-эффекторов к определенным последовательностям в геномной ДНК. Популярность системы CRISPR/Cas9 для целей геномного редактирования прежде всего связана с легкостью адресации нуклеазы Cas9 и ее производных к конкретным последовательностям генома. В стандартном варианте применения этой системы для геномного редактирования нуклеаза Cas9, связанная с направляющей РНК, вносит двуцепочечный разрыв в ДНК-мишень, содержащую протоспейсер — участок, одна из цепей которого комплементарна направляющей РНК. После этого разрыв подвергается репарации, которая может протекать либо по одному высокоошибочных путей — негомологичного соединения концов или микрогомологичного соединения концов, либо по точному пути гомологичной рекомбинации. В зависимости от пути репарации могут возникать либо инсерции и делеции, которые, как правило, инактивируют целевой ген, либо точные замены при рекомбинации с молекулой — донором генетического материала. Конкретный путь, по которому идет репарация разрывов, определяется в процессе клеточного ответа на повреждение ДНК — сложного регуляторного пути, в котором принимают участие несколько десятков белков со структурными, сигнальными и каталитическими функциями. Поскольку расщепление целевой ДНК осуществляется одним РНК-адресуемым полипептидом, Сas9 идеально приспособлен для создания модулярных белковых конструкций: он может быть легко адаптирован как платформа для адресации любого другого функционального белка. Получены многочисленные конструкции на архитектуре Cas9 с функциональными модулями для контроля транскрипции на уровне непосредственного взаимодействия с транскрипционными комплексами, эпигенетического метилирования и деметилирования ДНК, конденсации и деконденсации хроматина. Предложены варианты направляющих РНК с дополнительными элементами для сборки мультимодульных конструкций и с модификациями для улучшения функциональности. Созданы варианты геномного редактирования, которые инициируются не двуцепочечным разрывом, а направленной модификацией азотистых оснований (редактирование оснований) либо одноцепочечным разрывом с последующим синтезом ДНК по матрице РНК (прайм-редактирование). Как видно, создание новых и усовершенствование существующих направляющих нуклеиновых кислот и функциональных модулей для использования в адресуемых системах, а также понимание процессов, происходящих в клетках после действия таких систем, представляют собой магистральные пути развития технологий прецизионного управления геномами. Предлагаемый проект направлен на получение новых фундаментальных знаний о механизмах взаимодействия систем геномного редактирования с клетками и на расширение и развитие инструментария для комплементарно адресуемой модификации геномной ДНК. В первом блоке работ будет изучен механизм действия терминальных дезоксирибонуклеотидилтрансфераз (TdT) — ферментов, которые участвуют в репарации двуцепочечных разрывов в ходе V(D)J-рекомбинации и негомологичного соединения концов. На основе этих результатов будет разработана технология химико-ферментативного синтеза нуклеиновых кислот, принципиально не ограниченная природой оснований и сахарофосфатного остова. Будут созданы библиотеки канонических и модифицированных 3′-защищенных нуклеозидтрифосфатов. Будут получены и охарактеризованы ферменты TdT из разных биологических видов, и осуществлен дизайн их вариантов, способных эффективно присоединять модифицированные 3′-защищенные нуклеозидтрифосфаты. Во втором блоке работ будет создан ряд репортерных систем для высокопараллельного скрининга активности и специфичности геномных редакторов in vitro, in vivo в клетках бактерий, в клетках человека в культуре. Будет разработана универсальная система для докинга независимо экспрессируемых функциональных модулей на платформе адресующего модуля Cas9. Методы, разработанные в этом блоке, будут далее применены для решения других задач проекта. Третий блок работ посвящен исследованию клеточного ответа на повреждения ДНК, вносимые адресуемыми ферментами геномного редактирования. По отношению к клеткам человека Cas9 и другие CRISPR-ассоциированные белки, используемые в геномном редактировании, биоортогональны — на протяжении всей эволюции молекулярно-генетические системы человека никогда с ними не сталкивались. На сегодня доступно очень мало информации о том, как системы клеточного ответа, оптимизированные для репарации разрывов, вызванных постоянно идущими процессами — спонтанным повреждением ДНК, коллапсом репликативных вилок и т. п. — реагируют на разрывы, вносимые нуклеазой Cas9, и как они взаимодействуют с белками геномного редактирования. В ходе выполнения этого раздела проекта будут исследованы взаимодействия между белками Cas9 и участниками репарации ДНК и ответа на повреждение ДНК — поли(ADP-рибоза)полимеразами PARP1, PARP2, PARP3, Ku-антигеном, ник-сенсором XRCC1 и рядом РНК-связывающих белков, задействованных в ответе на разрывы ДНК. Наконец, четвертый блок работ призван расширить существующий репертуар инструментов управления геномом, построенных на архитектуре Cas9. Будет проведен поиск новых функциональных белковых модулей для направленной модификации ДНК — дезаминирования, окисления, алкилирования, которые могли бы играть роль редакторов оснований для внесения мутаций в геном без образования двуцепочечных разрывов или роль редакторов эпигенетических меток ДНК для направленной регуляции активности генов. Будет исследована эффективность и специфичность редактирования ДНК конструкциями, в которых такие функциональные модули соединены с адресующим модулем Cas9. Кроме того, будет проведено исследование нового класса аналогов направляющих РНК — фосфорилгуанидиновых производных, которые характеризуются частично нейтрализованным зарядом сахарофосфатного остова при полной сохранности комплементарных взаимодействий, что может послужить основой для более специфичной и эффективной адресации.

Ожидаемые результаты
Результаты проекта носят как фундаментальный, так и прикладной характер. В фундаментальном плане будут получены новые знания о взаимодействии естественного жизненно важного клеточного процесса — репарации ДНК — с чужеродными для клеток человека белками геномного редактирования и с продуктами их действия на клеточный геном. Такая постановка вопроса, насколько нам известно, не имеет аналогов в мире: до сих пор активно изучались механизмы действия ферментов геномного редактирования на ДНК, и было понятно, что конечными эффекторами фиксации изменений в геноме служат процессы репарации разрывов, но между этими двумя точками существует «черный ящик», о событиях в котором почти ничего не известно. В этой части проект не просто находится на передовой границе исследований, но способен сам задать мировой уровень. Полученные данные определят критические точки вмешательства, влияя на которые, можно управлять результатом редактирования генома. Кроме того, в ходе проекта будут получены подробные знания о механизмах действия ряда ферментов репарации ДНК, которые впоследствии найдут применение в разработках новых инструментов генетических технологий на основе этих белков. В прикладном плане в ходе проекта будут разработаны несколько технологий, которые имеют возможность войти в стандартный инструментарий работ в области геномной инженерии и синтетической биологии и обладают значительным потенциалом коммерциализации. Во-первых, будет разработана технология химико-ферментативного синтеза нуклеиновых кислот, принципиально не ограниченная природой оснований и сахарофосфатного остова. Такие технологии в настоящее время рассматриваются как альтернатива традиционному химическому синтезу, имеющая потенциал превзойти его в точности и способности получать разнообразные функционализированные олиго- и полинуклеотиды. Области применения синтетических нуклеиновых кислот обширны — это прежде всего медицинская диагностика и терапия, но также и синтетическая биология, и новые способы записи и хранения цифровой информации. Технология, которую планируется создать, найдет свое применение во всех этих сферах. Во-вторых, будет создана линейка геномных и эпигеномных редакторов с новыми, патентно чистыми функциональными модулями и направляющими нуклеиновыми кислотами. Это позволит облегчить выполнение и расширить круг возможных операций по изменению генома человека, сельскохозяйственных животных и растений, биотехнологических продуцентов. Новые инструменты редактирования генома, полученные в ходе проекта, представляют значительную ценность для зарождающегося сектора экономики РФ, основанного на современных генетических технологиях.


 

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ


Аннотация результатов, полученных в 2021 году
«Революция геномного редактирования», связанная с появлением системы CRISPR/Cas9, привела к возможности прецизионного изменения генома. Значительное число исследований в мире посвящено поиску способов увеличения эффективности и точности геномного редактирования, а также подходов к регуляции молекулярно-генетических процессов, основанных на комплементарной адресации молекул-эффекторов к определенным последовательностям в геномной ДНК. Популярность системы CRISPR/Cas9 для целей геномного редактирования прежде всего связана с легкостью адресации нуклеазы Cas9 и ее производных к конкретным последовательностям генома. В стандартном варианте применения этой системы для геномного редактирования нуклеаза Cas9, связанная с направляющей РНК, вносит двуцепочечный разрыв в ДНК-мишень, содержащую протоспейсер — участок, одна из цепей которого комплементарна направляющей РНК. После этого разрыв подвергается репарации, которая может протекать либо по одному высокоошибочных путей — негомологичного соединения концов или микрогомологичного соединения концов, либо по точному пути гомологичной рекомбинации. В зависимости от пути репарации могут возникать либо инсерции и делеции, которые, как правило, инактивируют целевой ген, либо точные замены при рекомбинации с молекулой — донором генетического материала. Конкретный путь, по которому идет репарация разрывов, определяется в процессе клеточного ответа на повреждение ДНК — сложного регуляторного пути, в котором принимают участие несколько десятков белков со структурными, сигнальными и каталитическими функциями. Поскольку расщепление целевой ДНК осуществляется одним РНК-адресуемым полипептидом, Сas9 идеально приспособлен для создания модулярных белковых конструкций: он может быть легко адаптирован как платформа для адресации любого другого функционального белка. Получены многочисленные конструкции на архитектуре Cas9 с функциональными модулями для контроля транскрипции на уровне непосредственного взаимодействия с транскрипционными комплексами, эпигенетического метилирования и деметилирования ДНК, конденсации и деконденсации хроматина. Предложены варианты направляющих РНК с дополнительными элементами для сборки мультимодульных конструкций и с модификациями для улучшения функциональности. Созданы варианты геномного редактирования, которые инициируются не двуцепочечным разрывом, а направленной модификацией азотистых оснований (редактирование оснований) либо одноцепочечным разрывом с последующим синтезом ДНК по матрице РНК (прайм-редактирование). Проект направлен на получение новых фундаментальных знаний о механизмах взаимодействия систем геномного редактирования с клетками и на расширение и развитие инструментария для комплементарно адресуемой модификации геномной ДНК. В ходе проекта решаются 4 блока взаимодополняющих задач. В первом блоке работ изучается механизм действия терминальных дезоксирибонуклеотидилтрансфераз (TdT), с конечной целью разработки технологии химико-ферментативного синтеза нуклеиновых кислот, принципиально не ограниченной природой оснований и сахарофосфатного остова. В отчетном году получен экспрессионный вектор для высокоуровневой продукции TdT человека, отработана методика выделения гомогенного фермента. Проведен химический синтез ряда модифицированных нуклеозидтрифосфатов, содержащих природные и неприродные азотистые основания и заместители, и определена эффективность их включения TdT в растущую цепь. Сравнение полученных данных для разных модификаций позволило идентифицировать критические положения в NTP/dNTP, вызывающие стерические затруднения при образовании фермент-субстратного комплекса и блокирующие присоединение к растущей цепи. Проведена биохимическая характеристика свойств TdT человека, позволяющая определить оптимальные условия проведения реакции. Показано, что наибольшая степень удлинения праймера достигается при минимальных значениях ионной силы и в диапазоне pH 7.0–8.5. Показано, что для природного кофактора – ионов Mg2+ наблюдается высокая степень накопления продуктов удлинения праймера в широком диапазоне концентрации ионов. Использование Mn2+ приводило к увеличению относительного выхода продуктов реакции, а Co2+, Ni2+ и Zn2+ – к его значительному уменьшению. Анализ длин продуктов реакции позволяет сказать, что двухзарядные ионы металла играют роль «переключателя» между процессивным и дистрибутивным механизмам функционирования TdT. Проведен анализ аминокислотных последовательностей TdT и других ДНК-полимераз семейства X из разных организмов. Методом моделирования по гомологии и молекулярной динамики установлено, что в нуклеотид-связывающем центре фермента образуется система контактов, отличающаяся для разных нуклеотидов, что, по-видимому, является ключевым фактором, объясняющим уменьшение эффективности присоединения нуклеотидов в зависимости от азотистого основания. Во втором блоке работ создаются репортерные системы для скрининга активности и специфичности геномных редакторов. В отчетном году поставлена система сопряженной транскрипции-трансляции в системе экстрактов E. coli BL21 Star для производства небольших количеств целевых белков для быстрого анализа их функциональных свойств. Отселектированы и секвенированы 11 миссенс-мутаций в гене rpoB штаммов E.coli CC104, SIJ488, DH5a, XL1Blue и BL21(DE3), придающие устойчивость к рифампицину. Разработаны, синтезированы и клонированы последовательности единых направляющих РНК (sgРНК), позволяющие селективно направлять нуклеазу Cas9 на геномную ДНК дикого типа или мутантного типа. Отработаны методики негативной селекции в E. coli в системе sacB при росте на минимальной среде с сахарозой, оценен уровень ложноположительных результатов. Третий блок работ посвящен исследованию клеточного ответа на повреждения ДНК, вносимые адресуемыми ферментами геномного редактирования. Для выявления возможного влияния ферментов PARP1 и PARP2 на функционирование белка Cas9 в отчетном году были исследованы активность Cas9 в эндонуклеазном расщеплении и связывании ДНК-субстрата, в отсутствие и присутствии PARP1. Показана стабилизация комплекса с ДНК в присутствии sgRNA и отсутствие влияния мутаций, подавляющих эндонуклеазную активность на одной или обеих цепях ДНК, на сродство Cas9 к субстрату. PARP1 и PARP2 взаимодействуют с ДНК-субстратом Cas9 с различной эффективностью, но только в условиях, исключающих синтез PAR (в отсутствие NAD+). Эффективность образования комплекса Cas9/sgRNA с ДНК снижается в присутствии PARP1/PARP2 в отсутствие реакции PAR-илирования, что может указывать на конкуренцию между разными белками за взаимодействие с ДНК. Однако каталитическая активность Cas9/sgRNA (при тех же концентрациях белков и ДНК) сохраняется, что свидетельствует о совместном связывании Cas9/sgRNA и PARP1/2 с ДНК. Формирование такого комплекса вполне вероятно путем взаимодействия PARP с концами ДНК-дуплекса. Образование стабильного эффекторного комплекса Cas9 с sgRNA значительно снижает его сродство к PAR, что может быть обусловлено как конформационными перестройками белка в комплексе с sgRNA, так и блокированием РНК-связывающего домена. Для апо-формы белка Cas9, более активной в связывании PAR, исследовано ковалентное ADP-рибозилирование, катализируемое PARP1 или PARP2, в широком диапазоне экспериментальных условий, от которых зависит длина синтезируемого полимера и уровень автомодификации PARP1/2. Невысокая, но надежно детектируемая модификация Cas9 обнаружена в реакции, катализируемой PARP2. Исследовано влияние недавно открытого фактора PAR-илирования гистонов, HPF1, на ДНК-независимую и ДНК-зависимую активности PARP1 и PARP2 в реакциях автомодификации и гетеромодификации гистонов (в присутствии мононуклеосом). Выявлено, что фактор, модулирующий специфичность реакции ADP-рибозилирования в результате формирования общего активного центра с PARP1/2, может стимулировать активности PARP1 и PARP2. В отличие от PARP1, PARP2 в комплексе с HPF1 более активен в реакции модификации гистонов, чем в реакции автомодификации, что может указывать на специфическую роль PARP2 в модуляции структуры хроматина. Наконец, четвертый блок работ призван расширить существующий репертуар инструментов управления геномом, построенных на архитектуре Cas9. В отчетном году сформирована локальная база данных последовательностей белковых доменов, ассоциированных с функциями дезаминирования, метилирования/деметилирования и окисления/восстановления азотистых оснований, а также гидролиза N-гликозидных связей. В качестве первоочередных кандидатов на получение новых функциональных модулей, адресуемых комплексом Cas9/sgРНК, выбран каталитический модуль дезаминаз ADAR и генераторы активных форм кислорода – белки KillerRed и SOPP3. Созданы конструкции, кодирующие химерные белки, состоящие из Cas9 и функциональных модулей – ДНК-гликозилаз MutY E. coli, TDG человека, MBD4 человека и ROS1 табака. Химерные белки выделены в рекомбинантном виде. Показано, что химерный белок Cas9-MutY при «закреплении» в конкретном локусе ДНК при помощи sgРНК способен с некоторой эффективностью удалять A из нормальных пар A:T. Таким образом, MutY представляет собой потенциальный активный модуль для недавно предложенной стратегии направленного мутагенеза in vivo, основанной на образовании неинструктивных повреждений – апурин-апиримидиновых сайтов. Показано, что химерный белок Cas9-ROS1 эффективно расщепляет ДНК по соседствующим с протоспейсером метилированным CpG-сайтам. Синтезированы олигонуклеотиды, несущие фосфорилгуанидиновые (ФГ) группировки, которые содержали ДНК/РНК-химерную протоспейсерную область. Проведена оценка активности комплексов Cas9 с ФГ-модифицированными РНК на плазмидном ДНК субстрате и флуоресцентно меченых протяженных ДНК субстратах in vitro. Показано, что комплексы белка Cas9 с ФГ-химерными crРНК с достаточно высокой эффективностью расщепляют оба субстрата in vitro. Критическим положением фосфорилгуанидиновой модификации является 4 положение с 5’-конца.

 

Публикации

1. Абросимова Л.А., Кузнецов Н.А., Астафурова Н.А., Самсонова А.Р., Карпов А.С., Перевязова Т.А., Оретская Т.С., Федорова О.С., Кубарева Е.А. Kinetic Analysis of the Interaction of Nicking Endonuclease BspD6I with DNA Biomolecules, VТ. 11. – №. 10. – P. 1420. (год публикации - 2021).

2. Бобрикова Е.Н., Чубаров А.С., Дмитриенко Е.В. The Effect of pH and Buffer on Oligonucleotide Affinity for Iron Oxide Nanoparticles Magnetochemistry, 7(9), 128 (год публикации - 2021).

3. Красикова Ю.С., Речкунова Н.И., Лаврик О.И. Nucleotide Excision Repair: From Molecular Defects to Neurological Abnormalities International Journal of Molecular Sciences, V. 22, No.12, p. 6220 (год публикации - 2021).

4. Кургина Т.А., Моор Н.А., Кутузов М.М., Науменко К.Н., Украинцев А.А., Лаврик О.И. Dual function of HPF1 in the modulation of PARP1 and PARP2 activities Communications Biology, V. 4, No. 1, p. 1259 (год публикации - 2021).

5. Попова В.К., Полетаева Ю.Е., Пышная И.А., Пышный Д.В., Дмитриенко Е.В. Designing pH-Dependent Systems Based on Nanoscale Calcium Carbonate for the Delivery of an Antitumor Drug Nanomaterials, V. 11., №. 11., P. 2794 (год публикации - 2021).