Аннотация результатов, полученных в 2021 году
«Революция геномного редактирования», связанная с появлением системы CRISPR/Cas9, привела к возможности прецизионного изменения генома. Значительное число исследований в мире посвящено поиску способов увеличения эффективности и точности геномного редактирования, а также подходов к регуляции молекулярно-генетических процессов, основанных на комплементарной адресации молекул-эффекторов к определенным последовательностям в геномной ДНК. Популярность системы CRISPR/Cas9 для целей геномного редактирования прежде всего связана с легкостью адресации нуклеазы Cas9 и ее производных к конкретным последовательностям генома. В стандартном варианте применения этой системы для геномного редактирования нуклеаза Cas9, связанная с направляющей РНК, вносит двуцепочечный разрыв в ДНК-мишень, содержащую протоспейсер — участок, одна из цепей которого комплементарна направляющей РНК. После этого разрыв подвергается репарации, которая может протекать либо по одному высокоошибочных путей — негомологичного соединения концов или микрогомологичного соединения концов, либо по точному пути гомологичной рекомбинации. В зависимости от пути репарации могут возникать либо инсерции и делеции, которые, как правило, инактивируют целевой ген, либо точные замены при рекомбинации с молекулой — донором генетического материала. Конкретный путь, по которому идет репарация разрывов, определяется в процессе клеточного ответа на повреждение ДНК — сложного регуляторного пути, в котором принимают участие несколько десятков белков со структурными, сигнальными и каталитическими функциями. Поскольку расщепление целевой ДНК осуществляется одним РНК-адресуемым полипептидом, Сas9 идеально приспособлен для создания модулярных белковых конструкций: он может быть легко адаптирован как платформа для адресации любого другого функционального белка. Получены многочисленные конструкции на архитектуре Cas9 с функциональными модулями для контроля транскрипции на уровне непосредственного взаимодействия с транскрипционными комплексами, эпигенетического метилирования и деметилирования ДНК, конденсации и деконденсации хроматина. Предложены варианты направляющих РНК с дополнительными элементами для сборки мультимодульных конструкций и с модификациями для улучшения функциональности. Созданы варианты геномного редактирования, которые инициируются не двуцепочечным разрывом, а направленной модификацией азотистых оснований (редактирование оснований) либо одноцепочечным разрывом с последующим синтезом ДНК по матрице РНК (прайм-редактирование). Проект направлен на получение новых фундаментальных знаний о механизмах взаимодействия систем геномного редактирования с клетками и на расширение и развитие инструментария для комплементарно адресуемой модификации геномной ДНК. В ходе проекта решаются 4 блока взаимодополняющих задач. В первом блоке работ изучается механизм действия терминальных дезоксирибонуклеотидилтрансфераз (TdT), с конечной целью разработки технологии химико-ферментативного синтеза нуклеиновых кислот, принципиально не ограниченной природой оснований и сахарофосфатного остова. В отчетном году получен экспрессионный вектор для высокоуровневой продукции TdT человека, отработана методика выделения гомогенного фермента. Проведен химический синтез ряда модифицированных нуклеозидтрифосфатов, содержащих природные и неприродные азотистые основания и заместители, и определена эффективность их включения TdT в растущую цепь. Сравнение полученных данных для разных модификаций позволило идентифицировать критические положения в NTP/dNTP, вызывающие стерические затруднения при образовании фермент-субстратного комплекса и блокирующие присоединение к растущей цепи. Проведена биохимическая характеристика свойств TdT человека, позволяющая определить оптимальные условия проведения реакции. Показано, что наибольшая степень удлинения праймера достигается при минимальных значениях ионной силы и в диапазоне pH 7.0–8.5. Показано, что для природного кофактора – ионов Mg2+ наблюдается высокая степень накопления продуктов удлинения праймера в широком диапазоне концентрации ионов. Использование Mn2+ приводило к увеличению относительного выхода продуктов реакции, а Co2+, Ni2+ и Zn2+ – к его значительному уменьшению. Анализ длин продуктов реакции позволяет сказать, что двухзарядные ионы металла играют роль «переключателя» между процессивным и дистрибутивным механизмам функционирования TdT. Проведен анализ аминокислотных последовательностей TdT и других ДНК-полимераз семейства X из разных организмов. Методом моделирования по гомологии и молекулярной динамики установлено, что в нуклеотид-связывающем центре фермента образуется система контактов, отличающаяся для разных нуклеотидов, что, по-видимому, является ключевым фактором, объясняющим уменьшение эффективности присоединения нуклеотидов в зависимости от азотистого основания. Во втором блоке работ создаются репортерные системы для скрининга активности и специфичности геномных редакторов. В отчетном году поставлена система сопряженной транскрипции-трансляции в системе экстрактов E. coli BL21 Star для производства небольших количеств целевых белков для быстрого анализа их функциональных свойств. Отселектированы и секвенированы 11 миссенс-мутаций в гене rpoB штаммов E.coli CC104, SIJ488, DH5a, XL1Blue и BL21(DE3), придающие устойчивость к рифампицину. Разработаны, синтезированы и клонированы последовательности единых направляющих РНК (sgРНК), позволяющие селективно направлять нуклеазу Cas9 на геномную ДНК дикого типа или мутантного типа. Отработаны методики негативной селекции в E. coli в системе sacB при росте на минимальной среде с сахарозой, оценен уровень ложноположительных результатов. Третий блок работ посвящен исследованию клеточного ответа на повреждения ДНК, вносимые адресуемыми ферментами геномного редактирования. Для выявления возможного влияния ферментов PARP1 и PARP2 на функционирование белка Cas9 в отчетном году были исследованы активность Cas9 в эндонуклеазном расщеплении и связывании ДНК-субстрата, в отсутствие и присутствии PARP1. Показана стабилизация комплекса с ДНК в присутствии sgRNA и отсутствие влияния мутаций, подавляющих эндонуклеазную активность на одной или обеих цепях ДНК, на сродство Cas9 к субстрату. PARP1 и PARP2 взаимодействуют с ДНК-субстратом Cas9 с различной эффективностью, но только в условиях, исключающих синтез PAR (в отсутствие NAD+). Эффективность образования комплекса Cas9/sgRNA с ДНК снижается в присутствии PARP1/PARP2 в отсутствие реакции PAR-илирования, что может указывать на конкуренцию между разными белками за взаимодействие с ДНК. Однако каталитическая активность Cas9/sgRNA (при тех же концентрациях белков и ДНК) сохраняется, что свидетельствует о совместном связывании Cas9/sgRNA и PARP1/2 с ДНК. Формирование такого комплекса вполне вероятно путем взаимодействия PARP с концами ДНК-дуплекса. Образование стабильного эффекторного комплекса Cas9 с sgRNA значительно снижает его сродство к PAR, что может быть обусловлено как конформационными перестройками белка в комплексе с sgRNA, так и блокированием РНК-связывающего домена. Для апо-формы белка Cas9, более активной в связывании PAR, исследовано ковалентное ADP-рибозилирование, катализируемое PARP1 или PARP2, в широком диапазоне экспериментальных условий, от которых зависит длина синтезируемого полимера и уровень автомодификации PARP1/2. Невысокая, но надежно детектируемая модификация Cas9 обнаружена в реакции, катализируемой PARP2. Исследовано влияние недавно открытого фактора PAR-илирования гистонов, HPF1, на ДНК-независимую и ДНК-зависимую активности PARP1 и PARP2 в реакциях автомодификации и гетеромодификации гистонов (в присутствии мононуклеосом). Выявлено, что фактор, модулирующий специфичность реакции ADP-рибозилирования в результате формирования общего активного центра с PARP1/2, может стимулировать активности PARP1 и PARP2. В отличие от PARP1, PARP2 в комплексе с HPF1 более активен в реакции модификации гистонов, чем в реакции автомодификации, что может указывать на специфическую роль PARP2 в модуляции структуры хроматина. Наконец, четвертый блок работ призван расширить существующий репертуар инструментов управления геномом, построенных на архитектуре Cas9. В отчетном году сформирована локальная база данных последовательностей белковых доменов, ассоциированных с функциями дезаминирования, метилирования/деметилирования и окисления/восстановления азотистых оснований, а также гидролиза N-гликозидных связей. В качестве первоочередных кандидатов на получение новых функциональных модулей, адресуемых комплексом Cas9/sgРНК, выбран каталитический модуль дезаминаз ADAR и генераторы активных форм кислорода – белки KillerRed и SOPP3. Созданы конструкции, кодирующие химерные белки, состоящие из Cas9 и функциональных модулей – ДНК-гликозилаз MutY E. coli, TDG человека, MBD4 человека и ROS1 табака. Химерные белки выделены в рекомбинантном виде. Показано, что химерный белок Cas9-MutY при «закреплении» в конкретном локусе ДНК при помощи sgРНК способен с некоторой эффективностью удалять A из нормальных пар A:T. Таким образом, MutY представляет собой потенциальный активный модуль для недавно предложенной стратегии направленного мутагенеза in vivo, основанной на образовании неинструктивных повреждений – апурин-апиримидиновых сайтов. Показано, что химерный белок Cas9-ROS1 эффективно расщепляет ДНК по соседствующим с протоспейсером метилированным CpG-сайтам. Синтезированы олигонуклеотиды, несущие фосфорилгуанидиновые (ФГ) группировки, которые содержали ДНК/РНК-химерную протоспейсерную область. Проведена оценка активности комплексов Cas9 с ФГ-модифицированными РНК на плазмидном ДНК субстрате и флуоресцентно меченых протяженных ДНК субстратах in vitro. Показано, что комплексы белка Cas9 с ФГ-химерными crРНК с достаточно высокой эффективностью расщепляют оба субстрата in vitro. Критическим положением фосфорилгуанидиновой модификации является 4 положение с 5’-конца.

Аннотация результатов, полученных в 2022 году
«Революция геномного редактирования», связанная с появлением системы CRISPR/Cas9, привела к возможности прецизионного изменения генома. Значительное число исследований в мире посвящено поиску способов увеличения эффективности и точности геномного редактирования, а также подходов к регуляции молекулярно-генетических процессов, основанных на комплементарной адресации молекул-эффекторов к определенным последовательностям в геномной ДНК. Популярность системы CRISPR/Cas9 для целей геномного редактирования прежде всего связана с легкостью адресации нуклеазы Cas9 и ее производных к конкретным последовательностям генома. В стандартном варианте применения этой системы для геномного редактирования нуклеаза Cas9, связанная с направляющей РНК, вносит двуцепочечный разрыв в ДНК-мишень, содержащую протоспейсер — участок, одна из цепей которого комплементарна направляющей РНК. После этого разрыв подвергается репарации, которая может протекать либо по одному высокоошибочных путей — негомологичного соединения концов или микрогомологичного соединения концов, либо по точному пути гомологичной рекомбинации. В зависимости от пути репарации могут возникать либо инсерции и делеции, которые, как правило, инактивируют целевой ген, либо точные замены при рекомбинации с молекулой — донором генетического материала. Конкретный путь, по которому идет репарация разрывов, определяется в процессе клеточного ответа на повреждение ДНК — сложного регуляторного пути, в котором принимают участие несколько десятков белков со структурными, сигнальными и каталитическими функциями. Поскольку расщепление целевой ДНК осуществляется одним РНК-адресуемым полипептидом, Сas9 идеально приспособлен для создания модулярных белковых конструкций: он может быть легко адаптирован как платформа для адресации любого другого функционального белка. Получены многочисленные конструкции на архитектуре Cas9 с функциональными модулями для контроля транскрипции на уровне непосредственного взаимодействия с транскрипционными комплексами, эпигенетического метилирования и деметилирования ДНК, конденсации и деконденсации хроматина. Предложены варианты направляющих РНК с дополнительными элементами для сборки мультимодульных конструкций и с модификациями для улучшения функциональности. Созданы варианты геномного редактирования, которые инициируются не двуцепочечным разрывом, а направленной модификацией азотистых оснований (редактирование оснований) либо одноцепочечным разрывом с последующим синтезом ДНК по матрице РНК (прайм-редактирование). Проект направлен на получение новых фундаментальных знаний о механизмах взаимодействия систем геномного редактирования с клетками и на расширение и развитие инструментария для комплементарно адресуемой модификации геномной ДНК. В ходе проекта решаются 4 блока взаимодополняющих задач. В первом блоке работ изучается механизм действия терминальных дезоксирибонуклеотидилтрансфераз (TdT), с конечной целью разработки технологии химико-ферментативного синтеза нуклеиновых кислот, принципиально не ограниченной природой оснований и сахарофосфатного остова. В отчетном году для TdT человека получены модели тройного предкаталитического TdT-ДНК-dNTP и бинарного посткаталитического комплекса TdT-ДНК. Установлено, что пуриновые нуклеотиды теряют сеть водородных связей с нуклеотидом после его присоединения к праймеру, тогда как для пиримидиновых нуклеотидов количество и время жизни водородных связей в посткаталитическом комплексе увеличиваются. Полученные данные объясняют предпочтения использования различных dNTP ферментом TdT, обнаруженные ранее. Кроме того, полученные модели позволили отобрать потенциально важные аминокислотные остатки активного, ДНК-связывающего и dNTP-связывающего центров фермента, замены которых изменяют специфичность связывания ДНК-праймера и/или dNTP и потенциально повышают термостабильность фермента. Предложен новый принцип контроля присоединения одного нуклеотида к растущей цепи на уровне контроля заряда межнуклеотидной фосфатной группы праймера при присоединении очередного звена. Для этого был разработан химический метод синтеза производных 2′-нуклеозидтрифосфатов на основе иминомонофосфатов и показано, что тимидин-5′-(1,3-диметилимидазолидин-2-илиден)-трифосфат (ррр(DMI)T) может служить субстратом для TdT человека, но после его присоединения к праймеру присоединение следующих нуклеотидов заблокировано. Во втором блоке работ создаются репортерные системы для скрининга активности и специфичности геномных редакторов. В отчетном году получена коллекция штаммов E. coli на основе SIJ488 и DH5α, несущих мутации в гене rpoB и совместимые по ориджину репликации плазмиды, кодирующие либо Cas9, либо sgРНК. Данную систему можно использовать для селекции вариантов Cas9 или sgРНК с повышенной точностью узнавания мишеней. Получена коллекция тех же штаммов E. coli на основе SIJ488 и DH5α, несущих плазмиды, кодирующие флуоресцентные белки eGFP и RFP для дальнейшей трансформация совместимыми плазмидами с вариантами Cas9 и sgРНК. Получена серия векторов для продукции в E. coli рекомбинантных белков, биотинилированных внутри клетки, и серия векторов для продукции в E. coli рекомбинантных белков, слитых с мономерным гибридным белком стрептавидин/ризавидин. Третий блок работ посвящен исследованию клеточного ответа на повреждения ДНК, вносимые адресуемыми ферментами геномного редактирования. На текущем этапе исследовано возможное влияние на эндонуклеазную активность Cas9 ДНК-зависимых ферментов PARP1 и PARP2, обусловленное их специфическим взаимодействием с продуктами расщепления. Аналогичные эксперименты выполнены с вариантами nCas9 D10A и nCas9 H840А, проявляющими никазную активность. Изменений активности Cas9 и мутантных форм в присутствии PARP1 (PARP2) не обнаружено, что может быть объяснено неспособностью PARP1/PARP2 эффективно конкурировать с Cas9 за взаимодействие с разрывами. Показано, что преимущественная активность PARP1 в автомодификации (по сравнению с гетеромодификацией гистонов) не зависит от наличия повреждения в нуклеосомной ДНК, корректируемого системой эксцизионной репарации оснований ДНК (BER). PARP2 более активен в гетеромодификации гистонов, чем в автомодификации, и это различие выражено сильнее в присутствии поврежденной ДНК. Полученные результаты указывают на возможные функциональные различия PARP1 и PARP2 в процессе репарации ДНК в контексте хроматина. Впервые показано сильное влияние контекста ДНК на абортивное лигирование разрывов, от которого зависит эффективность BER. Сравнительный анализ влияния PARP1 на активность ДНК-полимераз λ и β в репарационном синтезе показал, что активность этих ДНК-полимераз может модулироваться белками PARP1 и RPA. Наконец, четвертый блок работ призван расширить существующий репертуар инструментов управления геномом, построенных на архитектуре Cas9. В отчетном году показано, что белки tdKillerRed и SOPP3, производящие активные формы кислорода, могут вносить в ДНК разрывы и окислять основания вблизи от сайта связывания sgРНК. На основе конструкций с адресующим модулем dCas9 и функциональным модулем – UNG человека с заменами Y147A и N204D получены принципиально новые гликозилазные редакторы оснований, не требующие повреждающих ДНК модулей и работающие за счет способности удалять из ДНК нормальные основания. Проведена оценка специфичности комплексов Cas9 с химерными направляющими crРНК, содержащими различное количество фосфорилгуанидиновых групп, и показано, что включение как единичных, так и нескольких таких группировок в PAM-дистальном районе направляющих РНК позволяет контролировать активность и повышать специфичность системы CRISPR/Cas9 in vitro.

Аннотация результатов, полученных в 2023 году
«Революция геномного редактирования», связанная с появлением системы CRISPR/Cas9, привела к возможности прецизионного изменения генома. Значительное число исследований в мире посвящено поиску способов увеличения эффективности и точности геномного редактирования, а также подходов к регуляции молекулярно-генетических процессов, основанных на комплементарной адресации молекул-эффекторов к определенным последовательностям в геномной ДНК. Популярность системы CRISPR/Cas9 для целей геномного редактирования прежде всего связана с легкостью адресации нуклеазы Cas9 и ее производных к конкретным последовательностям генома. В стандартном варианте применения этой системы для геномного редактирования нуклеаза Cas9, связанная с направляющей РНК, вносит двуцепочечный разрыв в ДНК-мишень, содержащую протоспейсер – участок, одна из цепей которого комплементарна направляющей РНК. После этого разрыв подвергается репарации либо по одному высокоошибочных путей – негомологичного соединения концов или микрогомологичного соединения концов, либо по точному пути гомологичной рекомбинации. В зависимости от пути репарации могут возникать либо инсерции и делеции, которые, как правило, инактивируют целевой ген, либо точные замены при рекомбинации с молекулой – донором генетического материала. Конкретный путь, по которому идет репарация разрывов, определяется в процессе клеточного ответа на повреждение ДНК – сложного регуляторного пути, в котором принимают участие несколько десятков белков со структурными, сигнальными и каталитическими функциями. Поскольку расщепление целевой ДНК осуществляется одним РНК-адресуемым полипептидом, Сas9 идеально приспособлен для создания модулярных белковых конструкций: он может быть легко адаптирован как платформа для адресации любого другого функционального белка. Получены многочисленные конструкции на архитектуре Cas9 с функциональными модулями для контроля транскрипции на уровне непосредственного взаимодействия с транскрипционными комплексами, эпигенетического метилирования и деметилирования ДНК, конденсации и деконденсации хроматина. Созданы варианты геномного редактирования, которые инициируются не двуцепочечным разрывом, а направленной модификацией азотистых оснований (редактирование оснований) либо одноцепочечным разрывом с последующим синтезом ДНК по матрице РНК (прайм-редактирование). Проект направлен на получение новых фундаментальных знаний о механизмах взаимодействия систем геномного редактирования с клетками и на расширение и развитие инструментария для комплементарно адресуемой модификации геномной ДНК. В ходе проекта решаются 4 блока взаимодополняющих задач. В первом блоке работ изучается механизм действия терминальных дезоксирибонуклеотидилтрансфераз (TdT) с конечной целью разработки технологии химико-ферментативного синтеза нуклеиновых кислот, принципиально не ограниченной природой оснований и сахарофосфатного остова. В отчетном году проведено молекулярное моделирование процессов, происходящих в тройном каталитическом фермент-субстратном комплексе и посткаталитическом комплексе. На основании результатов можно заключить, что эффективность присоединения нуклеотидов к растущей цепи определяется прежде всего сетью контактов между входящим dNTP и аминокислотными остатками в кармане активного центра фермента. Проведен анализ архитектуры dNTP-связывающего кармана нуклеотидилтрансфераз из 469 организмов, что позволило выявить ряд потенциально важных остатков. Получены рекомбинантные варианты ферментов TdT, несущие замены в ДНК-связывающем и dNTP-связывающем центрах, которые могут оказать влияние на специфичность TdT по отношению к природным и модифицированным dNTP. Экспериментально показано, что нейтрализация заряда и увеличение внутреннего объема активного центра при заменах E456N или D395N/E456N приводят к переходу в процессивный режим и значительному увеличению активности в присутствии ионов Mg2+. Эти результаты позволили уточнить подходы к модификации dNTP для контролируемого пошагового присоединения к растущей цепи ферментами TdT. Предложено использовать для этого два альтернативных подхода: синтез dNTP с реверсивной защитой 3′-OН группы и синтез имидо-трифосфатов, модифицированных по α-фосфату различными бензоазольными группами. Для проверки субстратных свойств модифицированных dNTP синтезирован ряд dNTP и олигонуклеотидов с предложенными модификациями. Во втором блоке работ создаются репортерные системы для скрининга активности и специфичности геномных редакторов. В отчетном году показано, что человеческие клетки моноцитарного происхождения THP-1 могут быть использованы для детекции событий геномного редактирования в гене PIGA, кодирующем каталитическую субъединицу фермента фосфатидилинозитол-N-ацетилглюкозаминилтрансферазы. Разработана и протестирована система сборки гетеродимеров из нуклеазы Cas9 и функциональных модулей, основанная на взаимодействии мономерного стрептавидина и биотин-акцепторный домен из транскарбоксилазы Propionibacterium shermanii, который биотинилируется прямо в клетке при продукции белка. Третий блок работ посвящен исследованию клеточного ответа на повреждения ДНК, вносимые адресуемыми ферментами геномного редактирования. В отчетном году исследовано модулирующее действие ДНК-лигазы I (LigI), сенсора разрывов Ku70/80, белка RPA, дестабилизирующего структуру ДНК-дуплекса, и ДНК/РНК-связывающего белка YB1 как потенциальных конкурентов за взаимодействие с субстратами и продуктами Cas9. Установлено, что Cas9 эффективно маскирует вносимые им разрывы от LigI и Ku70/80. RPA модулирует активность Cas9, но только на субстратах, для которых возможно расплетание ДНК с помощью RPA. YB1 не вытесняет sgРНК из заранее сформированного эффекторного комплекса с Cas9 и не препятствует формированию тройного комплекса Cas9/sgРНК-ДНК. Также была исследована деградация продуктов Cas9-катализируемого расщепления ДНК белками экстрактов клеток человека HEK293 дикого типа и нокаутных по гену, кодирующему поли(ADP-рибоза)полимеразу 1 (PARP1) и показано, что защитное влияние Cas9 не зависит от наличия PARP1 в экстракте. В целом, можно сказать, что стабильное взаимодействие Cas9 с продуктами расщепления ДНК препятствует взаимодействию одно- и двцепочечных разрывов с другими узнающими их белками для вовлечения в известные пути репарации. Проведено сравнительное исследование ДНК-лигаз LigI и LigIIIα в процессинге интермедиата длиннозаплаточной эксцизионной репарации оснований ДНК (LP BER). Обнаружено, что при нарушении координированного действия белков-участников этого процесса из-за отсутствия флэп-эндонуклеазы 1 (FEN1), удаляющей свисающую структуру в процессе синтеза, возможно образование необычных АП-сайт-содержащих ДНК-структур с выпетливанием, которые очень плохо расщепляются АП-эндонуклеазой 1 (АРЕ1). Эффективность лигирования расщепленного АП-сайта почти не зависит от наличия 3′-мисматчей в разрыве, что увеличивает вероятность мутагенного действия таких продуктов. Лигирование в присутствии ДНК-полимеразы β и FEN1 полностью исключает образование продуктов с выпетливанием, плохо репарируемых в повторных циклах. Таким образом, основной вклад в эффективность LP BER вносит LigI, функционирующая в клетке в комплексе с FEN1. Наконец, четвертый блок работ призван расширить существующий репертуар инструментов управления геномом, построенных на архитектуре Cas9. В отчетном году исследованы свойства белков эндонуклеазы V и экзонуклеазы TatD E. coli и ДНК-полимеразы X вируса африканской чумы свиней как потенциальных функциональных модулей в комплементарно адресуемых геномных редакторах. Проанализированы кинетические аспекты расщепления субстратов нуклеазой Cas9 с направляющими РНК, несущими фосфорилгуанидиновые группы в разных позициях, и определены позиции, в которых модификация снижает скорость гидролиза ДНК-субстратов, и в которых она позволяет достичь высокой эффективности расщепления мишеней.