Аннотация результатов, полученных в 2021 году
1.5.1. Поиск генов для оптогенетического инструментария 2.0 В первом отчетном году мы произвели масштабный поиск генов, которые могут представлять интерес для оптогенетики. Были произведены поиски генов микробных родопсинов первого и третьего типов, LOV-доменов и люцифераз. Результатом работы является обнаружение большого количества генов, включая не исследованные ранее, из которых для дальнейших экспериментальных исследований отобрано 14 генов микробных родопсинов типа-1, 9 генов родопсинов типа-3, 4 гена LOV-доменов и 2 гена бактериальных люцифераз. 1.5.2. Характеризация оптогенетического инструментария 2.0 В рамках первого года работы по проекту мы собрали 58 генетических конструкций с микробными родопсинами. Эти конструкции будут использоваться для оптимизации экспрессии микробных родопсинов в различных экспрессионных системах, таких как бактериальная E. coli, эукариотическая LEXSY и также клетки млекопитающих для функциональных исследований. Также подготовлены генетические конструкции для экспрессии 4 новых LOV-доменов и 2 новых бактериальных люцифераз в E. coli. Помимо этого, глубоко охарактеризованы два ранее известных LOV-домена из бактерий Chloroflexus aggregans и Chloroflexus islandicus, результаты работ опубликованы. 1.5.3. Направленная экспрессия оптогенетического инструментария 2.0 Были получены генетические конструкции для направленной экспрессии родопсинов в митохондриях и лизосомах с целью оптогенетического контроля метаболизма клетки. 1.5.4. Расширение оптогенетического инструментария 2.0 1.5.4.1. optoGPCRs Подготовлена необходимая инфраструктура для проведения экспериментальной части проекта и разработаны детальные планы и стратегии проведения экспериментов . Генно-инженерные конструкции целевых GPCR клонированы и готовы к экспрессии. 1.5.4.2. optoTransporters Были собраны конструкции нескольких аминокислотных транспортёров различного происхождения, а также была протестирована экспрессия этих белков в различных экспрессионных системах. 1.5.4.3. optoArf and optoRas В ходе работ по проекту были определены наиболее перспективные кандидаты среди родопсинов и ГТФаз, а именно сенсорный родопсин NpSRII и ГТФазы Arf1, K-Ras4a и K-Ras4b, соответственно. Возможность оптогенетического контроля этих ГТФаз откроет новые возможности для науки и медицины. Был проведен дизайн конструкций слитных белков между NpSRII и выбранными ГТФазами, были выбраны несколько линкеров различной длинны и жесткости для разных ГТФаз, и все запланированные генетические конструкции были получены. Для слитного белка NpSRII-Arf1 было проведено крупнозернистое моделирование белков с различными линкерами. Оказалось, что при более коротких линкерах между NpSRII и Arf1, в активном состоянии NpSRII Arf1 проводит меньше времени над белком, т.е. конструкции с более короткими линкерами в слитном белке благоприятствуют оптогенетическому применению ГТФаз, и при дальнейших исследованиях на более короткие конструкции будет обращено более пристальное внимание. 1.5.4.5. Bactoluminopsin В экспериментах с клетками Escherichia coli, экспрессирующими гены бактериальных люцифераз и родопсиновых помп, показано, что при смешивании двух культур: интенсивно светящихся клеток и продуцирующих ген родопсина, - бактериальные люциферазы способны активировать родопсиновые помпы. Данный эффект проявляется также в условиях коэкспрессии в одной клетке генов люцифераз и гена родопсиновой помпы. Молекулярное моделирование показало возможность получения химерных белков PR-Lux и MacR-Lux со средним расстоянием между кофактором люциферазы ФМН и ретиналем родопсина порядка 5-6 нанометров. 1.5.5 Оптимизация оптогенетического инструментария 2.0 на основе структурных данных В 2021 году были проведены структурные исследования нескольких оптогенетических инструментов. Была получена структура высокого разрешения эукариотической протонной помпы LR1/Mac, активно используемой в оптогенетике. Было показано, что данный тип белков наиболее похож на архейные протонные помпы, нежели на бактериальные. Кроме того, были проведены первичные кристаллизационные тесты обратной протонной помпы BcXeR, получены первые кристаллы, продемонстрировавшие дифракцию до 2 А. Было показано, что белок функционально активен в данных кристаллах. Также, было показано, что уникальная протонная помпа SpaR формирует тримеры в функциональной форме. 1.5.6. Исследование оптогенетического инструментария 2.0 в клетках Оптимизированы протоколы мониторинга клеточных процессов (жизнеспособность, состояние митохондрий и лизосом, уровень активных форм кислорода, протекание аутофагии, митофагии, длина теломер и вход в сенесцентное состояние), что в дальнейшем будет использовано для проверки качества клеток, использующихся в оптогенетических экспериментах. Кроме того, оптогенетические воздействия на транспорт ионов могут влиять на состояние клеток, что будет выявлено отработанными методами. Встроенные оптогенетические средства в митохондрии и лизосомы, возможно, позволят управлять митохондриальным трансмембранным потенциалом, pH лизосом, что, согласно современной научной литературе, может изменять жизнеспособность клеток (Tkatch et al. 2017, Ernst et al. 2019, Berry et al. 2020).

Аннотация результатов, полученных в 2022 году
Во втором отчетном году мы произвели поиск генов, которые могут представлять интерес для оптогенетики. Были произведены поиски генов микробных родопсинов третьего типа (гелиродопсины), LOV-доменов и люцифераз. Усилия по родопсинам были сконцентрированы на гелиородопсинах, как на объектах с наибольшей новизной. Результатом работы является обнаружение новых генов, не исследованных ранее, из которых для дальнейших экспериментальных исследований отобрано 6 генов гелиородопсинов. Среди генов LOV-доменов и люцифераз интересных объектов для дальнейших исследований не обнаружено. В рамках характеризации потенциальных оптогенетических инструментов новые микробные родопсины были экспрессированы в различных экспресссионных системах, а именно, в бактериальной E. Coli, эукариотической LEXSY, и в клетках млекопитающих. Проведён первоначальный скрининг свойств новых микробных родопсинов. Разработана панель вариантов флавин-связывающего белка с уникальными свойствами для флуоресцентной микроскопии в нескольких каналах. Найдена и охарактеризована необычная гомодимерная бактериальная люцифераза из бактерии Enhygromyxa salina. Отработан протокол трансфекции нескольких линий клеток человека. Получена экспрессия в митохондриях канального родопсина 2, обратной протонной помпы и вирусного родопсина. Показана локализация в лизосомах для родопсина - обратной протонной помпы. Разработана установка для оптогенетического воздействия на светочувствительные белки, в частности на родопсины для изменения pH лизосом. С целью расширения оптогенетического инструментария были проведены следующие исследования. В рамках работ по разработке фотопереключаемых лигандов и химер optoGPCR были проэкспрессированы рецепторы-мишени с помощью бакуловирусной системы экспрессии в клетках насекомых. Путем структурного моделирования малых молекул, способных переключать целевой рецептор между активным и неактивным состояниями, разработаны фотопереключаемые лиганды для GPCR. Кроме того, был произведён синтез данных фотоактивных веществ. По направлению оптогенетической регуляции транспортёров проведен виртуальный скрининг модификаций лигандов с докингом в сайт связывания. Кандидаты с наивысшими скорами были отобраны для последующего синтеза. Было синтезировано 10 лигандов для последующей оценки связывания в in vitro. В части проекта, касающейся optoArf, мы получили препарат гомогенного слитного белка сенсорного родопсина и малой ГТФазы. Спектр белка продемонстрировал, что ГТФаза не оказывает значительного влияния на сенсорный родопсин. С полученным белком был проведен широкий перебор кристаллизационных условий, однако, на настоящий момент кристаллов не было получено. С целью поиска других кандидатов для кристаллизации было решено попробовать протеородопсин, сшитый с ГТФазой. На данный момент проведена тестовая экспрессия и очистка нового слитного белка. Нами были предложены несколько генетических конструкций для фотоактивируемого тирозинкиназного рецептора HER1 и HER2, на основе светочувствительного домена LOV или его аналогов. Внеклеточный лиганд-связывающий домен рецептора был заменен на светочувствительный, оставив без изменений трансмембранный и внутриклеточный домены, для того чтобы рецептор активировался светом в отсутствие каких-либо лигандов. С помощью программы AlphaFold были получены модели для оптимизации конструкций. Для отработки условий будущей экспрессии конструкций рецепторов в системе LEXSY нами были разработаны методы экспрессии и очистки светочувствительных белков, на примере гелиородопсинов, в количествах необходимых для проведения структурно-функциональных исследований. Получены конструкции химерного белка BR-Lux на основе бактериородопсина из Halobacterium salinarum и бактериальной люциферазы из P. luminescens. С целью проведения структурных исследований была проведена экспрессия и очистка химерного белка. Проведены эксперементы по малоугловому рентгеновскому рассеянию. Проведены структурные исследования бактериального ксенородопсина BcXeR и получена его структура высокого разрешения, обнаружившая уникальное внутреннее устройство белка. Также получены первые структурные данные по промежуточным состояниям белка. Кроме этого, начаты исследования нового инструмента оптогенетики - гелиородопсина Cv06, получены первые его кристаллы. Подготовлены образцы протонной и натриевой помп для экспериментов по малоугловому рассеянию и криоэлектронной микроскопии, соответственно. В этом году были отработаны различные методики оценки состояния клетки, что необходимо при дальнейшей оценке работоспособности оптогенетических инструментов. Отработаны методики наблюдения на цитозольным кальцием, что позволит изучать сигнализацию клеток при оптогенетических воздействиях. Освоены методы детекции энергетического стресса (недостатка АТФ и высокого соотношения NADH/NAD+), активности mTORС1, активации экспрессии фактора роста TFEB, что в целом позволит следить за изменениями метаболизма (состояния анаболизма, катаболизма) при оптогенетических воздействиях. Применение оптогенетики при разных метаболических состояниях клетки может иметь разный эффект, что нужно учитывать. Также возможно, сами оптогенетические воздействия смогут сдвинуть метаболизм клетки в сторону катаболизма или анаболизма. Оценка состояния клеток (сенесцентное, кризисное состояние, онкотрансформация, апоптоз) позволит определить возможности воздействия изменения ионного баланса клетки с помощью новых оптогенетических инструментов. Результаты проекта опубликованы в 12 статьях, в том числе в высокоуровневых журналах Nature Structural & Molecular Biology и Nature Communications, Communications Biology.

Аннотация результатов, полученных в 2023 году
В рамках работы над проектом по созданию, характеризации и применению новых оптогенетических инструментов в 2023 году нами были выполнены следующие работы. Клонированы гены lux-оперона подмосковного изолята люминесцентных почвенных бактерий P. temperata в клетках E. coli, определена термостабильность кодируемой ими люциферазы. Показана люминесценция in vitro для рекомбинантной очищенной гомодимерной люциферазы EsLuxA E. salina. В рамках темы направленной экспрессии новые родопсины, прямая протонная помпа и две обратных протонных помпы, были направленно экспрессированы в митохондриях клеток человека. В рамках темы по разработке фотопереключаемых лигандов и химер optoGPCR получены очищенные и стабилизированные образцы каннабиноидных рецепторов CB2. Проанализирована их однородность и стабильность методами аналитической гель-фильтрационной хроматографии и анализа термического сдвига. Был получен достаточный для дальнейших исследований выход чистого препарата белка, также был показан стабилизирующий эффект от связывания с лигандом. При исследовании оптоТранспортёров была произведена выборка синтезированных соединений с наибольшей аффинностью к белку-транспортеру посредством изотермической калориметрии для последующей кристаллизаций. Получены кристаллы с лимитом дифракции около 4 ангстрем. Обработка данных подтвердила связывание лигандов в карманах связывания, однако для более точного моделирования потребуются данные более высокого разрешения. Дополнительно было доказано, что транспортер обладает ионной проводимостью, не связанной с транспортом основного субстрата, но проявляющейся только при движении транспортных доменов. В части проекта, касающейся optoArf, мы получили препарат нового гомогенного слитного белка протеородопсина и малой ГТФазы. В рамках этого года удалось зыкристаллизовать данный белок и получить дифракционные картины. Кроме того, проведен дизайн функционального анализа малой ГТФазы в липосомах в слитых белках. Нами были предложены несколько генетических конструкций для фотоактивируемого тирозинкиназного рецептора HER1, HER2 и TrkA, на основе светочувствительного домена CRY2 и PhyB. Внеклеточный лиганд-связывающий домен рецептора был заменен на светочувствительный, а трансмембранный и внутриклеточный домены были оставлены без изменений, для того чтобы рецептор активировался светом в отсутствие каких-либо лигандов. Были сделаны экспрессионные конструкции для системы LEXSY, однако уровень экспрессии они показали незначительный. Проводится работа по оптимизации условий экспрессии с использованием модифицированных генноинженерных конструкций с добавлением сигнальных последовательностей и анализ уровня экспрессии с целью наработки белков в количествах, достаточных для проведения структурно-функциональных исследований. Функциональные исследования ранее сконструированного химерного белка BR-Lux показали, что и родопсин и люцифераза в его составе функциональны и порядка 10-20% испускаемого света поглощается родопсином, однако эффективности комплекса недостаточно для детекции люминесцентно-индуцированного переноса протона с помощью pH-метрии внеклеточного раствора. Сконструирован новый ген химерного белка BR-Lux на основе ксантородопсина, обладающего дополнительной антенной, и люциферазы. В 2023 году получены структуры промежуточных состояний белка BcXeR с высоким разрешением и на их основе впервые определен механизм переноса протона внутрь клетки под воздействием света. Получена структура нового гелиородопсина Cv06, обнаружившая отличия от ранее опубликованных структур белков этого семейства. Продолжены исследования олигомерных состояний белка MacR в различных условиях с помощью методов малоуглового рассеяния. Получена структура высокого разрешения светочувствительной натриевой помпы XA63 нового типа с помощью криоэлектронной микроскопии в физиологической форме. В результате выполнения проекта достигнута возможность проведения оптогенетических экспериментов в полуавтоматическом режиме, с миллисекундными/минутными периодическими освещениями, в том числе в течение длительного времени, с полуавтоматической обработкой результатов. Были показаны принципиальная возможность оптогенетического влияния на уровень свободных радикалов, оптогенетическое изменение рН матрикса митохондрий, воздействие на энергетическое состояние клетки (истощение АТФ), а также оптогенетическое изменение концентрации кальция в цитозоле клеток человека. На основании отработанного протокола оптогенетической регуляции pH лизосом достигнута возможность влияния на аутофагию клеток человека. Результаты проекта опубликованы в 9 статьях, в том числе в высокоуровневых журналах первого квартиля (Q1), таких как Nature Structural & Molecular Biology.