КАРТОЧКА
ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ
Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.
ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ
Номер 21-64-00018
НазваниеВторой этап развития оптогенетики: новые подходы для исследований и медицины
РуководительБорщевский Валентин Иванович, Кандидат физико-математических наук
Прежний руководитель Горделий Валентин Иванович, дата замены: 18.03.2022
Организация финансирования, регион федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Московский физико-технический институт (национальный исследовательский университет)", г Москва
Период выполнения при поддержке РНФ | 2021 г. - 2024 г. |
Конкурс№56 - Конкурс 2021 года «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований по поручениям (указаниям) Президента Российской Федерации» (генетические исследования).
Область знания, основной код классификатора 04 - Биология и науки о жизни, 04-201 - Структурная, функциональная и эволюционная геномика
Ключевые словаГенетика, оптогенетика, метагеномика, анализ геномов, родопсины, LOV домены, возбуждающие переносчики аминокислот, рецепторы связанные с G-белком, контроль органелл, фотоконвертируемые лиганды, структурная биология мембранных белков
Код ГРНТИ34.17.15
ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ
Аннотация
Открытие оптогенетических инструментов первого поколения представило принципиально новый метод для современных наук о жизни. Это открытие является выдающимся примером того, как фундаментальные исследования генетических манипуляций на клетках могут перерасти в практические приложения в клеточных системах и животных.
Оптогенетика уже оказала огромное влияние на нейронауки. До сих пор, однако, воздействие было в основном связано использованием светочувствительных ионных каналов, что ограничивало его применение стимуляцией нервных клеток. Это мешало широкому применению технологии в биологических науках и медицине.
Целью настоящего проекта является принципиальное усиление возможностей оптогенетики посредством генетических манипуляций, позволяющих выполнять оптический контроль сигнальных, биоэнергетических и метаболических путей клеток, клеточных органелл и систем животных для исследовательских и медицинских целей.
Эти цели будут достигнуты при помощи:
1) Расширения набора инструментов для оптогенетики с помощью биоинформатики и метагеномики путем поиска генов, кодирующих фотоактивные белки, которые могут иметь новые свойства, подходящие для оптогенетики - далее будет называться “Поиск генов для оптогенетического инструментария 2.0” ;
2) Экспериментальное описание и выбор наилучших оптогенетических инструментов, кодируемых заранее выбранными генами - далее будет называться “Характеризация оптогенетического инструментария 2.0” ;
3) Разработка генетических подходов, включая дизайн выбранных генов, обеспечивающих направленную экспрессию соответствующих белков в мембранах клеток и их органеллах - далее будет называться “Направленная экспрессия оптогенетического инструментария 2.0”
4) Разработка генов химер светочувствительных белков с различными интересующими белками - “Расширение оптогенетического инструментария 2.0”
-- GPCRs - далее будут называться “optoGPCRs”
-- Ионные переносчики - далее будут называться “optoTransporters”
-- Малые ГТФазы (белки Arf и Ras) - далее будут называться “optoArf и optoRas”
-- рецепторные киназы - далее будут называться “optoKinases”
-- бактериальные люциферазы - далее будут называться “Bactoluminopsin”
5) Структурные исследования оптогенетических белков для понимания механизма их функции и структурная инженерия усовершенствованных оптогенетических инструментов - далее будет называться “Оптимизация оптогенетического инструментария 2.0 на основе структурных данных”
6) Применение разработанных инструментов и подходов для управления клетками -далее будет называться “Исследование оптогенетического инструментария 2.0 в клетках”
Ожидаемые результаты
Мы поделили результаты по подпроектам:
1.5.1. Поиск генов для оптогенетического инструментария 2.0
1.5.1.1.Создание российской группы биоинформатиков и биофизиков, специализирующихся на анализе и использовании биологических геномных ресурсов путем анализа последовательностей нуклеиновых кислот
1.5.1.2.Разработка основанных на метагеномике подходов к исследованию и использованию микробного биоразнообразия
1.5.1.3.Обнаружение новых генов фотоактивных белков путем скрининга биотехнологических ресурсов, скрытых в этом биоразнообразии. В частности, идентификация новых многообещающих генов микробных родопсинов, LOV доменов и люцифераз, поскольку они могут обеспечить новые возможности как для оптогенетического контроля, так и для методов считывания
1.5.2. Характеризация оптогенетического инструментария 2.0
Мы получим биохимические, биофизические и структурные описания новых оптогенетических инструментов. Мы собираемся определить важнейшие параметры исследуемых белков. Эти параметры важны для того, чтобы рассматривать возможность применения этих белков, как подходящих для конкретных оптогенетических воздействий.
Исследование будет разделено на несколько взаимосвязанных пунктов:
1.5.2.1. Базовое функциональное описание выбранных генов для понимания их общих свойств. Широкомасштабный скрининг позволит выявить несколько мишеней для дальнейшей оптимизации и разработки новых оптогенетических инструментов.
1.5.2.2. Углубленное описание выбранных генов с помощью соответствующих биохимических, биофизических и электрофизиологических методов.
1.5.2.3. Подробное описание разработанных в пункте 1.5.4 вариантов оптогенетических средств (1.5.4 описан ниже).
1.5.3. Направленная экспрессия оптогенетического инструментария 2.0
Оптогенетика органелл позволит создать платформу для воздействия на работоспособность и физиологическое состояние клеток. Эта платформа может быть применена для исследования патогенеза старения и многих заболеваний, таких как нейродегенерация, и, наконец, внести вклад в разработку оптогенетических вмешательств. Направленная экспрессия новых оптогенетических инструментов в различных субклеточных компартментах создаст возможность управлять клеточными и тканевыми процессами.
1.5.3.1. В результате выполнения данной части проекта будет проведена разработка установки и протоколов для оптогенетического контроля физиологических параметров органелл: митохондриального мембранного потенциала, рН лизосом и других. Направленная экспрессия родопсинов в митохондриях обеспечит эффективный контроль митохондриальных параметров (мембранный потенциал, гомеостаз ионов кальция) с помощью света. Направленная экспрессия родопсинов в лизосомах приведет к эффективному подкислению лизосом и оттоку кальция.
1.5.4.Расширение оптогенетического инструментария 2.0
1.5.4.1. optoGPCRs: Будут разработаны фотоактивные лиганды, направленные на модуляцию активности GPCR и концептуальный дизайн средств оптоконтроля активации GPCR
1.5.4.2. optoTransporters: Разработанная платформа для функционального анализа транспортеров с использованием фотоактивируемых лигандов
1.5.4.3. optoArf и optoRas: В конце проекта мы предполагаем исследовать возможность модуляции активности малых GTPase светом in vitro с использованием слитных белков малых ГТФаз и родопсинов. Кроме того, эти слитые белки будут структурно и функционально охарактеризованы.
1.5.4.4. optoKinases:
1.5.4.4.1. Мы планируем предложить и экспрессировать новые генетические конструкции на основе родопсинов и доменов рецепторных киназ для создания и изучения регуляции светом химерных рецепторных киназ;
1.5.4.4.2. Мы проведем функциональные тесты по активации и регуляции работы цитоплазматических частей рецепторных киназ под действием света и изучим структурные особенности химерных белков, чтобы изучить механизм передачи и регуляции сигнала в системах in vitro и in vivo.
1.5.4.5. Bactoluminopsin: Бактериальные клетки, экспрессирующие ген химерного белка бактолюминопсина (трансляционно слитые бактериальный родопсин и люцифераза). Результаты проверки способности бактолюминопсина к поддержанию мембранного потенциала клетки и комплементации основной дыхательной цепи.
1.5.5. Оптимизация оптогенетического инструментария 2.0 на основе структурных данных
1.5.5.1. Структуры высокого разрешения новых оптогенетических инструментов: микробных родопсинов, найденных в процессе биоинформатического поиска; функциональные мутанты известных и новых оптогенетических инструментов; сконструированные в ходе проекта белки. Данные будут получены с помощью белковой рентгеновской кристаллографии.
1.5.5.2. Структуры высокого разрешения новых оптогенетических инструментов после их активации светом.
1.5.5.3. Структурные данные о форме и олигомерном состоянии белковых комплексов инструментов оптогенетики второго поколения. Данные будут получены с помощью малоуглового рассеяния рентгена и нейтронов (МУРР, МУРН), а также с помощью первичных исследований больших белковых комплексов с помощью криоэлектронной микроскопии.
1.5.6. Исследование оптогенетического инструментария 2.0 в клетках
1.5.6.1. Будут проведены тесты соответствующих генов в электрически активных клетках (например, первичных нейронах).
1.5.6.2. Родопсины, избирательно экспрессировавшиеся в внутриклеточных органеллах, будут проверены на влияние на митохондриальные и лизосомные процессы в иммортализованных и смертных культурах клеток человека.
1.5.6.3. В случае успешной разработки новых белков, упомянутых в части 1.5.4. они будут протестированы на культурах клеток человека.
Белки, которые показали свой значительный потенциал для оптогенетических применений, в будущем могут быть предоставлены потенциальным партнёрам для экспериментов на животных. Может быть проверено влияние на градиенты концентрации ионов, передачу сигналов, производимое с помощью новых оптогенетических средств, на здоровье, активность и продолжительность жизни C. elegans.
ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ
Аннотация результатов, полученных в 2021 году
1.5.1. Поиск генов для оптогенетического инструментария 2.0
В первом отчетном году мы произвели масштабный поиск генов, которые могут представлять интерес для оптогенетики. Были произведены поиски генов микробных родопсинов первого и третьего типов, LOV-доменов и люцифераз. Результатом работы является обнаружение большого количества генов, включая не исследованные ранее, из которых для дальнейших экспериментальных исследований отобрано 14 генов микробных родопсинов типа-1, 9 генов родопсинов типа-3, 4 гена LOV-доменов и 2 гена бактериальных люцифераз.
1.5.2. Характеризация оптогенетического инструментария 2.0
В рамках первого года работы по проекту мы собрали 58 генетических конструкций с микробными родопсинами. Эти конструкции будут использоваться для оптимизации экспрессии микробных родопсинов в различных экспрессионных системах, таких как бактериальная E. coli, эукариотическая LEXSY и также клетки млекопитающих для функциональных исследований. Также подготовлены генетические конструкции для экспрессии 4 новых LOV-доменов и 2 новых бактериальных люцифераз в E. coli. Помимо этого, глубоко охарактеризованы два ранее известных LOV-домена из бактерий Chloroflexus aggregans и Chloroflexus islandicus, результаты работ опубликованы.
1.5.3. Направленная экспрессия оптогенетического инструментария 2.0
Были получены генетические конструкции для направленной экспрессии родопсинов в митохондриях и лизосомах с целью оптогенетического контроля метаболизма клетки.
1.5.4. Расширение оптогенетического инструментария 2.0
1.5.4.1. optoGPCRs
Подготовлена необходимая инфраструктура для проведения экспериментальной части проекта и разработаны детальные планы и стратегии проведения экспериментов . Генно-инженерные конструкции целевых GPCR клонированы и готовы к экспрессии.
1.5.4.2. optoTransporters
Были собраны конструкции нескольких аминокислотных транспортёров различного происхождения, а также была протестирована экспрессия этих белков в различных экспрессионных системах.
1.5.4.3. optoArf and optoRas
В ходе работ по проекту были определены наиболее перспективные кандидаты среди родопсинов и ГТФаз, а именно сенсорный родопсин NpSRII и ГТФазы Arf1, K-Ras4a и K-Ras4b, соответственно. Возможность оптогенетического контроля этих ГТФаз откроет новые возможности для науки и медицины. Был проведен дизайн конструкций слитных белков между NpSRII и выбранными ГТФазами, были выбраны несколько линкеров различной длинны и жесткости для разных ГТФаз, и все запланированные генетические конструкции были получены.
Для слитного белка NpSRII-Arf1 было проведено крупнозернистое моделирование белков с различными линкерами. Оказалось, что при более коротких линкерах между NpSRII и Arf1, в активном состоянии NpSRII Arf1 проводит меньше времени над белком, т.е. конструкции с более короткими линкерами в слитном белке благоприятствуют оптогенетическому применению ГТФаз, и при дальнейших исследованиях на более короткие конструкции будет обращено более пристальное внимание.
1.5.4.5. Bactoluminopsin
В экспериментах с клетками Escherichia coli, экспрессирующими гены бактериальных люцифераз и родопсиновых помп, показано, что при смешивании двух культур: интенсивно светящихся клеток и продуцирующих ген родопсина, - бактериальные люциферазы способны активировать родопсиновые помпы. Данный эффект проявляется также в условиях коэкспрессии в одной клетке генов люцифераз и гена родопсиновой помпы.
Молекулярное моделирование показало возможность получения химерных белков PR-Lux и MacR-Lux со средним расстоянием между кофактором люциферазы ФМН и ретиналем родопсина порядка 5-6 нанометров.
1.5.5 Оптимизация оптогенетического инструментария 2.0 на основе структурных данных
В 2021 году были проведены структурные исследования нескольких оптогенетических инструментов. Была получена структура высокого разрешения эукариотической протонной помпы LR1/Mac, активно используемой в оптогенетике. Было показано, что данный тип белков наиболее похож на архейные протонные помпы, нежели на бактериальные. Кроме того, были проведены первичные кристаллизационные тесты обратной протонной помпы BcXeR, получены первые кристаллы, продемонстрировавшие дифракцию до 2 А. Было показано, что белок функционально активен в данных кристаллах. Также, было показано, что уникальная протонная помпа SpaR формирует тримеры в функциональной форме.
1.5.6. Исследование оптогенетического инструментария 2.0 в клетках
Оптимизированы протоколы мониторинга клеточных процессов (жизнеспособность, состояние митохондрий и лизосом, уровень активных форм кислорода, протекание аутофагии, митофагии, длина теломер и вход в сенесцентное состояние), что в дальнейшем будет использовано для проверки качества клеток, использующихся в оптогенетических экспериментах. Кроме того, оптогенетические воздействия на транспорт ионов могут влиять на состояние клеток, что будет выявлено отработанными методами. Встроенные оптогенетические средства в митохондрии и лизосомы, возможно, позволят управлять митохондриальным трансмембранным потенциалом, pH лизосом, что, согласно современной научной литературе, может изменять жизнеспособность клеток (Tkatch et al. 2017, Ernst et al. 2019, Berry et al. 2020).
Публикации
1. Гончаров И.М., Смоленцева А., Семёнов О., Натаров И., Назаренко В.В., Юденко А., Ремеева А., Гущин И. High-resolution structure of a naturally red-shifted LOV domain Biochemical and Biophysical Research Communications, Volume 567, 27 August 2021, Pages 143-147 (год публикации - 2021) https://doi.org/10.1016/j.bbrc.2021.06.046
2. Забельский Д., Дмитриева Н., Волков О., Шевченко В. Structure-based insights into evolution of rhodopsins Communications Biology, volume 4, issue 1, pages 1-12 (год публикации - 2021) https://doi.org/10.1038/s42003-021-02326-4
3. Смоленцева А., Гончаров И.М., Юденко А., Богородский А., Семёнов О., Назаренко В.В., Борщевский В., Фонин А.В., Ремеева А., Егер К.-Э., Краусс У., Горделий В., Гущин И. Extreme dependence of Chloroflexus aggregans LOV domain thermo- and photostability on the bound flavin species Photochemical & Photobiological Sciences, Photochem Photobiol Sci 20, 1645–1656 (год публикации - 2021) https://doi.org/10.1007/s43630-021-00138-3
4. Харо-Морено Х., Лопез-Перез М., Родригез-Валера Ф. Enhanced Recovery of Microbial Genes and Genomes From a Marine Water Column Using Long-Read Metagenomics frontiers in microbiology, volume 12, pages 2410 (год публикации - 2021) https://doi.org/10.3389/fmicb.2021.708782
Аннотация результатов, полученных в 2022 году
Во втором отчетном году мы произвели поиск генов, которые могут представлять интерес для оптогенетики. Были произведены поиски генов микробных родопсинов третьего типа (гелиродопсины), LOV-доменов и люцифераз. Усилия по родопсинам были сконцентрированы на гелиородопсинах, как на объектах с наибольшей новизной. Результатом работы является обнаружение новых генов, не исследованных ранее, из которых для дальнейших экспериментальных исследований отобрано 6 генов гелиородопсинов. Среди генов LOV-доменов и люцифераз интересных объектов для дальнейших исследований не обнаружено.
В рамках характеризации потенциальных оптогенетических инструментов новые микробные родопсины были экспрессированы в различных экспресссионных системах, а именно, в бактериальной E. Coli, эукариотической LEXSY, и в клетках млекопитающих. Проведён первоначальный скрининг свойств новых микробных родопсинов. Разработана панель вариантов флавин-связывающего белка с уникальными свойствами для флуоресцентной микроскопии в нескольких каналах. Найдена и охарактеризована необычная гомодимерная бактериальная люцифераза из бактерии Enhygromyxa salina.
Отработан протокол трансфекции нескольких линий клеток человека. Получена экспрессия в митохондриях канального родопсина 2, обратной протонной помпы и вирусного родопсина. Показана локализация в лизосомах для родопсина - обратной протонной помпы. Разработана установка для оптогенетического воздействия на светочувствительные белки, в частности на родопсины для изменения pH лизосом.
С целью расширения оптогенетического инструментария были проведены следующие исследования.
В рамках работ по разработке фотопереключаемых лигандов и химер optoGPCR были проэкспрессированы рецепторы-мишени с помощью бакуловирусной системы экспрессии в клетках насекомых. Путем структурного моделирования малых молекул, способных переключать целевой рецептор между активным и неактивным состояниями, разработаны фотопереключаемые лиганды для GPCR. Кроме того, был произведён синтез данных фотоактивных веществ.
По направлению оптогенетической регуляции транспортёров проведен виртуальный скрининг модификаций лигандов с докингом в сайт связывания. Кандидаты с наивысшими скорами были отобраны для последующего синтеза. Было синтезировано 10 лигандов для последующей оценки связывания в in vitro.
В части проекта, касающейся optoArf, мы получили препарат гомогенного слитного белка сенсорного родопсина и малой ГТФазы. Спектр белка продемонстрировал, что ГТФаза не оказывает значительного влияния на сенсорный родопсин. С полученным белком был проведен широкий перебор кристаллизационных условий, однако, на настоящий момент кристаллов не было получено. С целью поиска других кандидатов для кристаллизации было решено попробовать протеородопсин, сшитый с ГТФазой. На данный момент проведена тестовая экспрессия и очистка нового слитного белка.
Нами были предложены несколько генетических конструкций для фотоактивируемого тирозинкиназного рецептора HER1 и HER2, на основе светочувствительного домена LOV или его аналогов. Внеклеточный лиганд-связывающий домен рецептора был заменен на светочувствительный, оставив без изменений трансмембранный и внутриклеточный домены, для того чтобы рецептор активировался светом в отсутствие каких-либо лигандов. С помощью программы AlphaFold были получены модели для оптимизации конструкций. Для отработки условий будущей экспрессии конструкций рецепторов в системе LEXSY нами были разработаны методы экспрессии и очистки светочувствительных белков, на примере гелиородопсинов, в количествах необходимых для проведения структурно-функциональных исследований.
Получены конструкции химерного белка BR-Lux на основе бактериородопсина из Halobacterium salinarum и бактериальной люциферазы из P. luminescens. С целью проведения структурных исследований была проведена экспрессия и очистка химерного белка. Проведены эксперементы по малоугловому рентгеновскому рассеянию.
Проведены структурные исследования бактериального ксенородопсина BcXeR и получена его структура высокого разрешения, обнаружившая уникальное внутреннее устройство белка. Также получены первые структурные данные по промежуточным состояниям белка. Кроме этого, начаты исследования нового инструмента оптогенетики - гелиородопсина Cv06, получены первые его кристаллы. Подготовлены образцы протонной и натриевой помп для экспериментов по малоугловому рассеянию и криоэлектронной микроскопии, соответственно.
В этом году были отработаны различные методики оценки состояния клетки, что необходимо при дальнейшей оценке работоспособности оптогенетических инструментов. Отработаны методики наблюдения на цитозольным кальцием, что позволит изучать сигнализацию клеток при оптогенетических воздействиях. Освоены методы детекции энергетического стресса (недостатка АТФ и высокого соотношения NADH/NAD+), активности mTORС1, активации экспрессии фактора роста TFEB, что в целом позволит следить за изменениями метаболизма (состояния анаболизма, катаболизма) при оптогенетических воздействиях. Применение оптогенетики при разных метаболических состояниях клетки может иметь разный эффект, что нужно учитывать. Также возможно, сами оптогенетические воздействия смогут сдвинуть метаболизм клетки в сторону катаболизма или анаболизма. Оценка состояния клеток (сенесцентное, кризисное состояние, онкотрансформация, апоптоз) позволит определить возможности воздействия изменения ионного баланса клетки с помощью новых оптогенетических инструментов.
Результаты проекта опубликованы в 12 статьях, в том числе в высокоуровневых журналах Nature Structural & Molecular Biology и Nature Communications, Communications Biology.
Публикации
1. Алексеев А.А., Горделий В.И., Эрнст Б. Rhodopsin-Based Optogenetics: Basics and Applications Methods in Molecular Biology, Том 2501, Страницы 71 - 100 (год публикации - 2022) https://doi.org/10.1007/978-1-0716-2329-9_3
2. Асташкин Р., Ковалёв К.В., Бухдрукер С., Ваганова С., Кузьмин А.С., Алексеев А.А., Баландин Т., Забельский Д.В., Гущин И.Ю., Роянт А., Волков Д., Буренков Г., Кунин Е., Энгельгард М., Эрнст Б., Горделий В.И. Structural insights into light-driven anion pumping in cyanobacteria Nature Communications, Том 13, Выпуск 1 (год публикации - 2022) https://doi.org/10.1038/s41467-022-34019-9
3. Баландин Т., Волков Д., Алексеев А.А., Ковалёв К.В., Братанов Д. E. coli expression and purification of microbial and viral rhodopsins Methods in Molecular Biology, Том 2501, Страницы 109 - 124 (год публикации - 2022) https://doi.org/10.1007/978-1-0716-2329-9_5
4. Борщевский В.И., Ковалёв К.В., Раунд А., Ефремов Р., Асташкин Р., Буренков Г., Братанов Д., Баландин Т., Чижов И.В., Баекен К., Гущин И.Ю., Кузьмин А.С., Алексеев А.А., Рогачев А.В., Вильбольд Д., Энгельгард М., Эрнст Б., Бюльдт Г., Горделий В.И. True-atomic-resolution insights into the structure and functional role of linear chains and low-barrier hydrogen bonds in proteins Nature Structural & Molecular Biology, Том 29, Выпуск 5, Страницы 440 - 450 (год публикации - 2022) https://doi.org/10.1038/s41594-022-00762-2
5. Горделий В.И., Ковалёв К.В., Асташкин Р., Горделий В.И., Черезов В.Г. Crystallization of Microbial Rhodopsins Methods in Molecular Biology, Том 2501, Страницы 125 - 146 (год публикации - 2022) https://doi.org/10.1007/978-1-0716-2329-9_6
6. Горделий В.И., Ковалёв К.В., Эрнст Б., Родригес-Валера Ф., Зиновьев Е.В., Забельский Д.В., Алексеев А.А., Росселли Р., Гущин И.Ю., Охрименко И.С. Microbial Rhodopsins Methods in Molecular Biology, Том 2501, Страницы 1 - 5 (год публикации - 2022) https://doi.org/10.1007/978-1-0716-2329-9_1
7. Мельников И., Орехов Ф., Рулев М., Ковалёв К.В., Асташкин Р., Братанов Д., Рижиков Ю.Л., Баландин Т., Бухдрукер С., Охрименко И.С., Борщевский В.И., Буренков Г., Мюллер-Дикманн К., Ван дер Линден П., Карпентиер Ф., Леонард Г., Горделий В.И., Попов А. High-pressure crystallography shows noble gas intervention into protein-lipid interaction and suggests a model for anaesthetic action Communications Biology, Том 5, Порядковый номер 360 (год публикации - 2022) https://doi.org/10.1038/s42003-022-03233-y
8. Муругова Т.Н., Иванков О.И., Рижиков Ю.Л., Соловьёв Д., Ковалёв К.В., Скачкова Д.В., Раунд А., Баекен К., Ищенко А.В., Волков Д., Рогачев А.В., Власов А.В., Куклин А.И., Горделий В.И. Mechanisms of membrane protein crystallization in ‘bicelles’ Scientific Reports, Том 12, Выпуск 1 (год публикации - 2022) https://doi.org/10.1038/s41598-022-13945-0
9. Ремеева А.А., Юденко А.Н., Назаренко В.В., Семенов О.Ю., Смоленцева А.А., Богородский А.О., Маслов И.В., Борщевский В.И., Гущин И.Ю. Development and Characterization of Flavin-Binding Fluorescent Proteins, Part I: Basic Characterization Methods in Molecular Biology, Том 2564, Страницы 121 - 141 (год публикации - 2023) https://doi.org/10.1007/978-1-0716-2667-2_6
10. Родригес-Валера Ф., Пушкарев А., Росселли Р., Бежа О. Searching Metagenomes for New Rhodopsins Methods in Molecular Biology, Том 2501, Страницы 101 - 108 (год публикации - 2022) https://doi.org/10.1007/978-1-0716-2329-9_4
11. Рокицкая Т.И., Маляр Н., Силецкий С.А., Горделий В.И., Антоненко Ю.Н. Electrophysiological Characterization of Microbial Rhodopsin Transport Properties: Electrometric and ΔpH Measurements Using Planar Lipid Bilayer, Collodion Film, and Fluorescent Probe Approaches Methods in Molecular Biology, Том 2501, Страницы 259 - 275 (год публикации - 2022) https://doi.org/10.1007/978-1-0716-2329-9_12
12. Соловьёв Д., Борщевский В.И., Чижов И.В. Time-resolved UV-VIS spectroscopy of microbial rhodopsins Methods in Molecular Biology, Том 2501, Страницы 169 - 179 (год публикации - 2022) https://doi.org/10.1007/978-1-0716-2329-9_8
13. - Ученые МФТИ пролили свет на перенос ионов живыми клетками Сетевое издание Научно-информационный портал «Поиск», - (год публикации - )
14. - Ученые МФТИ пролили свет на перенос ионов живыми клетками РНФ, - (год публикации - )
15. - Биофизики обнаружили «протонные провода» в клетке За Науку, - (год публикации - )
16. - Ученые МФТИ пролили свет на перенос ионов живыми клетками За Науку, - (год публикации - )
Аннотация результатов, полученных в 2023 году
В рамках работы над проектом по созданию, характеризации и применению новых оптогенетических инструментов в 2023 году нами были выполнены следующие работы.
Клонированы гены lux-оперона подмосковного изолята люминесцентных почвенных бактерий P. temperata в клетках E. coli, определена термостабильность кодируемой ими люциферазы. Показана люминесценция in vitro для рекомбинантной очищенной гомодимерной люциферазы EsLuxA E. salina.
В рамках темы направленной экспрессии новые родопсины, прямая протонная помпа и две обратных протонных помпы, были направленно экспрессированы в митохондриях клеток человека.
В рамках темы по разработке фотопереключаемых лигандов и химер optoGPCR получены очищенные и стабилизированные образцы каннабиноидных рецепторов CB2. Проанализирована их однородность и стабильность методами аналитической гель-фильтрационной хроматографии и анализа термического сдвига. Был получен достаточный для дальнейших исследований выход чистого препарата белка, также был показан стабилизирующий эффект от связывания с лигандом.
При исследовании оптоТранспортёров была произведена выборка синтезированных соединений с наибольшей аффинностью к белку-транспортеру посредством изотермической калориметрии для последующей кристаллизаций. Получены кристаллы с лимитом дифракции около 4 ангстрем. Обработка данных подтвердила связывание лигандов в карманах связывания, однако для более точного моделирования потребуются данные более высокого разрешения. Дополнительно было доказано, что транспортер обладает ионной проводимостью, не связанной с транспортом основного субстрата, но проявляющейся только при движении транспортных доменов.
В части проекта, касающейся optoArf, мы получили препарат нового гомогенного слитного белка протеородопсина и малой ГТФазы. В рамках этого года удалось зыкристаллизовать данный белок и получить дифракционные картины. Кроме того, проведен дизайн функционального анализа малой ГТФазы в липосомах в слитых белках.
Нами были предложены несколько генетических конструкций для фотоактивируемого тирозинкиназного рецептора HER1, HER2 и TrkA, на основе светочувствительного домена CRY2 и PhyB. Внеклеточный лиганд-связывающий домен рецептора был заменен на светочувствительный, а трансмембранный и внутриклеточный домены были оставлены без изменений, для того чтобы рецептор активировался светом в отсутствие каких-либо лигандов. Были сделаны экспрессионные конструкции для системы LEXSY, однако уровень экспрессии они показали незначительный. Проводится работа по оптимизации условий экспрессии с использованием модифицированных генноинженерных конструкций с добавлением сигнальных последовательностей и анализ уровня экспрессии с целью наработки белков в количествах, достаточных для проведения структурно-функциональных исследований.
Функциональные исследования ранее сконструированного химерного белка BR-Lux показали, что и родопсин и люцифераза в его составе функциональны и порядка 10-20% испускаемого света поглощается родопсином, однако эффективности комплекса недостаточно для детекции люминесцентно-индуцированного переноса протона с помощью pH-метрии внеклеточного раствора. Сконструирован новый ген химерного белка BR-Lux на основе ксантородопсина, обладающего дополнительной антенной, и люциферазы.
В 2023 году получены структуры промежуточных состояний белка BcXeR с высоким разрешением и на их основе впервые определен механизм переноса протона внутрь клетки под воздействием света. Получена структура нового гелиородопсина Cv06, обнаружившая отличия от ранее опубликованных структур белков этого семейства. Продолжены исследования олигомерных состояний белка MacR в различных условиях с помощью методов малоуглового рассеяния. Получена структура высокого разрешения светочувствительной натриевой помпы XA63 нового типа с помощью криоэлектронной микроскопии в физиологической форме.
В результате выполнения проекта достигнута возможность проведения оптогенетических экспериментов в полуавтоматическом режиме, с миллисекундными/минутными периодическими освещениями, в том числе в течение длительного времени, с полуавтоматической обработкой результатов. Были показаны принципиальная возможность оптогенетического влияния на уровень свободных радикалов, оптогенетическое изменение рН матрикса митохондрий, воздействие на энергетическое состояние клетки (истощение АТФ), а также оптогенетическое изменение концентрации кальция в цитозоле клеток человека. На основании отработанного протокола оптогенетической регуляции pH лизосом достигнута возможность влияния на аутофагию клеток человека.
Результаты проекта опубликованы в 9 статьях, в том числе в высокоуровневых журналах первого квартиля (Q1), таких как Nature Structural & Molecular Biology.
Публикации
1. Власова А.Д., Полякова А., Громова А., Долотова С., Бухалович С.М., Багаева Д., Богородский А.О., Цыбров Ф.М., Ковалёв К.В., Михайлов А.Э., Сидоров Д.В., Богородский А.О., Ильинский Н.C., Куклин А.И., Власов А.В., Борщевский В.И., Иванович В. Optogenetic cytosol acidification of mammalian cells using an inward proton-pumping rhodopsin International Journal of Biological Macromolecules, Том 242, часть 3 (год публикации - 2023) https://doi.org/10.1016/j.ijbiomac.2023.124949
2. Ковалёв К.В., Цыбров Ф.М., Алексеев А.А., Горделий В.И. Mechanisms of inward transmembrane proton translocation Nature Structural & Molecular Biology, Том 30 (год публикации - 2023) https://doi.org/10.1038/s41594-023-01020-9
3. Лиу Х., Лиу В.В., Харо-Морено Х.М., Xу Б., Женг Я., Лиу Й., Тиан Й., Жанг X.Х., Жоу Н.Ю., КЬЮин Л., Жу Ю., Родригес-Валера Ф., Жанг Ч. A moderately thermophilic origin of a novel family of marine group II euryarchaeota from deep ocean iScience, Том 26, Выпуск 9 (год публикации - 2023) https://doi.org/10.1016/j.isci.2023.107664
4. Николаев А., Тропина Е.В., Болдырев К.Н., Максимов Е.Г., Борщевский В.И., Мишин А.В., Юденко А.Н., Кузьмин А.С., Кузнецова Е.А., Семенов О.Ю., Ремеева А.А., Гущин И.Ю. Two distinct mechanisms of flavoprotein spectral tuning revealed by low-temperature and time-dependent spectroscopy Protein Science, e4851 (год публикации - 2023) https://doi.org/10.1002/pro.4851
5. Николаев А., Юденко А.Н., Смоленцева А.А., Богородский А.О., Цыбров Ф.М., Борщевский В.И., Бухалович С.М., Назаренко В.В., Кузнецова Е.А., Семенов О.Ю., Ремеева А.А., Гущин И.Ю. Fine spectral tuning of a flavin-binding fluorescent protein for multicolor imaging Journal of Biological Chemistry, Том 299, выпуск 3 (год публикации - 2023) https://doi.org/10.1016/j.jbc.2023.102977
6. Охрименко И.С., Ковалёв К.В., Петровская Л.Е., Ильинский Н.C., Алексеев А.А., Марьин Е., Рокицкая Т.И., Антоненко Ю.Н., Силецкий С.А., Попов А., Загрядская Ю.А., Соловьёв Д., Чижов И.В., Забельский Д.В., Рижиков Ю.Л., Власов А.В., Куклин А.И., Богородски Mirror proteorhodopsins Communications Chemistry, Том 6 (год публикации - 2023) https://doi.org/10.1038/s42004-023-00884-8
7. Рокицкая Т.И., Алексеев А.А., Цыбров Ф.М., Бухалович С.М., Антоненко Ю.Н., Горделий В.И. Retinal-Based Anion Pump from the Cyanobacterium Tolypothrix campylonemoides Biochemistry Moscow, Том 88 (год публикации - 2023) https://doi.org/10.1134/S0006297923100127
8. Фомин В.В., Баженов С.В., Конончук О.В., Матвеева В.О., Зарубина А.П., Спиридонов С.Е., Манухов И.В. Photorhabdus lux-operon heatshock-like regulation Heliyon, Том 9, выпуск 3 (год публикации - 2023) https://doi.org/10.1016/j.heliyon.2023.e14527
9. - УЧЕНЫЕ ИЗ МФТИ СОЗДАЛИ АЛЬТЕРНАТИВНУЮ ПАЛИТРУ ФЛУОРЕСЦЕНТНЫХ БЕЛКОВ ДЛЯ ВИЗУАЛИЗАЦИИ КЛЕТОЧНЫХ ПРОЦЕССОВ Электронное периодическое издание «Научная Россия», - (год публикации - )
10. - Альтернативная палитра флуоресцентных белков для визуализации клеточных процессов Журнал «За науку», - (год публикации - )