Аннотация результатов, полученных в 2021 году
В соответствии с планом исследований первого года выполнения проекта исследования проводились по следующим основным направлениям: H1 Функциональная характеристика и сопоставительный анализ новых штаммов актинобактерий – деструкторов стеринов и оценка перспектив их использования для метаболической биоинженерии новых продуцентов. Секвенирование и биоинформатический анализ геномов наиболее активных штаммов Выполнен поиск штаммов актинобактерий, потенциально обладающих способностью к эффективной биодеградации растительных стеринов. Первичный отбор кандидатных штаммов из доступных коллекций микроорганизмов произведён на основании их таксономической близости с известными биотехнологически значимыми штаммами-продуцентами рода Mycolicibacterium, способными осуществлять биотрансформацию стеринов в полезные стероидные продукты такие как андростендион (АД), 9-гидроксиандростендион (9-ОН-АД). Ранее не идентифицированные изоляты отобраны на основании сходства профилей цельноклеточных масс-спектров их индивидуальных культур с таковыми у известных продуцентов. В прямых сравнительных экспериментах оценена эффективность биодеградации фитостерина культурами пяти кандидатных штаммов Mycolicibacterium в сравнении с деградативной активностью двух штаммов-продуцентов и известного штамма-деструктора M. smegmatis mc2 155. На основании высокой целевой активности три из пяти штаммов выбраны для дальнейшего изучения. Два новых активных изолята DVD-1296 и DVD-1301 были идентифицированы до вида как Mycolicibacterium fortuitum на основании гомологии генов 16S рРНК. Исследованы ростовые характеристики штаммов M. fortuitum DVD-1296 и DVD-1301 и M. smegmatis ВКМ Ac-1171 и их устойчивость к 10 антибактериальным агентам различных классов. Штаммы M. fortuitum DVD-1296 и DVD-1301 наиболее активно росли при 37 С, и были чувствительны к аминогликозидам гентамицину, канамицину и неомицину. Произведено высокопроизводительное секвенирование полных геномов двух новых штаммов M. fortuitum и штамма M. smegmatis ВКМ Ac-1171, последовательность генома которого была ранее неизвестна. Выполнена сборка и аннотирование геномов. Размеры геномов составили от 5421267 до 6988269 п.о. У всех штаммов идентифицированы ортологи ряда известных и предполагаемых генов, вовлеченных в катаболизм стероидов: гены, кодирующие ферменты окисления боковой цепи (Cyp125, fadD19, FadE26 (chsE4), FadE27 (chsE5), fadA5, fadD17, fadE34 (chsE3), FadE28 (ChsE1), FadE29 (ChsE2), Ltp2, Ltp3, Ltp4, Hsd4A, Hsd4B, EchA19, ChsH1, ChsH2), ферменты окисления колец A и B стероидного ядра (ChoD, ChoD2, Hsd, KstD, KshA, KshB, HsaA, HsaB, HsaC, HsaD, HsaE, HsaF, HsaG) и ферменты окисления колец C и D стероидного ядра (FadD3, FadE30, IpdA, IpdB, IpdC, IpdF, EchA20, FadE31, FadE32). Проведена оценка идентичности аминокислотных последовательностей белковых продуктов выявленных генов. Ключевыми ферментами деструкции стероидного ядра по 9(10)-секопути (единственному известному для актинобактерий пути деградации стероидов) являются 3-кетостероид-1-дегидрогеназа (кодируется геном kstD) и 9а-гидроксилаза, состоящая из субъединиц KshA и KshB (кодируются генами kshA и kshB, соответственно). У штамма M. smegmatis ВКМ Ac-1171 выявлено 5 кандидатных генов kstD, 2 гена kshA и 3 гена kshB. У штаммов M. fortuitum DVD-1301 и M. fortuitum DVD-1296 выявлено по 5 кандидатных генов kstD, 5 генов kshA и 3 гена kshB. При этом количество паралогов кандидатных генов у штаммов M. fortuitum DVD-1301 и M. fortuitum DVD-1296 было аналогично их количеству у M. fortuitum Ac-1817D, а у штамма M. smegmatis Ac-1171 – аналогично их количеству у M. smegmatis mc2 155. Н1 Направленный мутагенез и первичный функциональный анализ мутантных штаммов Mycolicibacterium smegmatis c инактивированными генами глубокой деградации стероидного ядра. Штамм M. smegmatis способен к полной деградации стеринов. В геноме штамма идентифицированы гены KstR2-регулона (гены fadD3, ipdA, ipdB), кодирующие ключевые этапы деградации кольца С стероидного ядра. Выполнен нокаут гена fadD3 - одиночного и в комбинации с генами ipdA одного и комбинации из трёх генов KstR2-регулона (гены fadD3, ipdA, ipdB), продукты которых вовлечены в окисление стероидных колец B и C. С применением различных методов хроматографического анализа проанализирована активность окисления холестерина пятью полученными мутантами. Показано, что мутанты способны конвертировать холестерин с накоплением в качестве основного метаболита изомеризующегося полярного продукта неполного окисления холестерина, предположительно, представляющего собой изопреноид инданового ряда. Начаты работы по его выделению, очистке и идентификации H1 Изучение особенностей катаболизма стеринов у термофильной актинобактерии Saccharopolyspora hirsuta ВКМ Ас-666 Ранее нами впервые была выявлена способность термофильной актинобактерии S. hirsuta ВКМ Ас-666 к эффективной модификации ряда стероидных субстратов (Lobastova et al., 2020). Особенностью окисления стеринов данным штаммом является накопление 26-гидроксистероидной кислоты с 3-гидрокси-5-ен-структурой, что не характерно для мезофильных актинобактерий и впервые выявлено для термофильной актинобактерии. Выделены и идентифицированы 3-оксо-4-ен- и 3-гидрокси-5-ен-стероидные интермедиаты, образующиеся на начальных этапах окислительной деградации боковой цепи стерина S. hirsuta. Соединения были определены как холест-4-ен-3-он, холеста-1,4-диен-3-он, 26-гидроксихолест-4-ен-3-он, 3-оксохолест-4-ен-26-овая кислота, 3-оксохолеста-1,4-диен-26-овая кислота, 26-гидроксихолест-5-ен-3-ол и 3-гидроксихолест-5-ен-26-еновая кислота. Структуры выделенных соединений были подтверждены методами ВЭЖХ, масс-спектрометрии, H1- и C13-ЯМР-спектроскопии. В геноме S.hirsuta нами выявлены кластеры генов, ортологов известных генов окисления боковой цепи стеринов, колец А/B и C/D стероидного ядра (Lobastova et al., 2021, Microorganisms (IF 4.127)). Изучены особенности роста S. hirsuta ВКМ Ас-666 при различных температурах, выявлены условия, способствующие накоплению 26-гидроксихолестерина. Получены препараты тотальной РНК клеток, выращенных в различных условиях индукции (при температурах 30 и 50 С, в присутствии холестерина и при его отсутствии в среде). Осуществлено высокопроизводительное секвенирование полных транскриптомов и получены результаты, свидетельствующие о почти двукратном превалировании количества генов, изменяющих экспрессию при температуре 50 С. Проводятся исследования, направленные на уточнение данных по изменению уровня экспрессии набора специфических генов катаболизма стеринов у S. hirsuta на основе идентификации дифференциально экспрессирующихся в присутствии холестерина генов различных этапов катаболизма стероидов. С целью выявления других термофильных/термотолерантных штаммов, окисляющих стерины, осуществлен поиск ключевых генов, относящихся к 9,10-секо-катаболическому пути стеринов среди 52 доступных геномов термофильных штаммов. Только у семи штаммов актинобактерий: Thermomonospora curvata DSM 43183, Amycolatopsis granulosa DSM 45669, Amycolatopsis methanolba 50.9b, Amycolatopsis methanolica 239T, Thermocatellispora tengchongensis DSM 45615, Amycolatopsis ruanii 49.3e и Microbispora siamensis NBRC 104113 выявлены белки 41,6-64,2%-ным сходством с референсными ферментами M. tuberculosis H37Rv. Для термофильных штаммов G. kaustophilus и P. thermoglucosidasius, способных осуществлять некоторые модификации стероидных соединений (6-гидроксилирование, восстановление 17/20-кетогруппы или 4(5)-двойной связи, отщепление C3-фрагмента боковой цепи по C17-C20) поиск более 20 ферментов катаболизма стероидов с помощью программы BLAST+ позволил выявить предполагаемые белки, которые на 47% и 45% схожи с референсным FadA5, соответственно; а также ферменты P. thermoglucosidasius, которые схожие с HsaF и HsaE из M. tuberculosis H37Rv на 48% и 41% соответственно. Результаты свидетельствуют о том, что способность к полному окислению стеринов не характерна для термофильных штаммов, т.е. найденный нами в результате экспериментального скрининга штамм S. hirsuta 666 является достаточно уникальным. H2 Создание мутантного гена cyp102A1-LG23 (дизайн и практическое осуществление стратегии химического синтеза гена или сайт-направленного мутагенеза), изучение экспрессии гена в составе полученных конструкций в E. coli и функциональное тестирование in vitro синтезированных белковых продуктов. Спроектированы и синтезированы четыре варианта кодирующей ДНК последовательности мутантного цитохрома CYP102A1-LG23, который известен как наиболее эффективный бактериальный (Bacillus megatherium) фермент, осуществляющий стереоспецифическое гидроксилирование стероидных субстратов. На основе этих ДНК последовательностей созданы плазмидные конструкции для экспрессии этих генов в бактериях Escherichia coli. Созданные на основе экспрессионного вектора pET28 конструкции, несущие гены мутантного цитохрома CYP102A1-LG23, экспрессированы в клетках E. сoli. Показан высокий уровень экспрессии оптимизированного для бактерий M. smegmatis mc2 155 гена cyp102A1-LG23 в клетках E. сoli, при этом продукция цитохрома CYP102A1-LG23 и его растворимость не зависели от мутации 211N/AAC (211T/ACC). Функциональное тестирование in vitro с экспрессированными в E. coli белковыми продуктами показало высокую эффективность и селективность 7β-гидроксилирования андростендиона (АД) гетерологическим цитохромом с образованием 7β-OH-AД (82 - 91% моль/моль) уже в первые часы инкубации. Наличие мутации 211N/AAC не влияло на скорость и уровень образования 7β-OH-AД. 7β-Гидроксипроизводные были также основными продуктами при трансформации других 3-оксостероидов, таких как андростадиендион (АДД), тестостерон и 9а-гидроксиандростендион. При этом АДД являлся менее предпочтительным, в сравнении с АД, субстратом для CYP102A1-LG23. При использовании в качестве субстрата дегидроэпиандростендиона (ДГЭА), отличающегося наличием 3-гидрокси-5-ен-структуры, стереоспецифичность реакции гидроксилирования снижается: обе формы CYP102A1-LG23 (мутантная 211N/AAC и LG23 дикого типа) конвертируют ДГЭА в смесь 7α-, так и 7β- эпимеров (7α-OH-ДГЭА + 7β-OH-ДГЭА) с превалированием 7α-формы. Выявлено также образование 7-кето-ДГЭА. Созданный синтетический цитохром может проявляет активность также в отношении других стероидных соединений, таких как эстрон и литохолевая кислота. Таким образом, за прошедший первый год проекта нами были спроектированы и синтезированы четыре варианта кодирующей последовательности мутантного цитохрома CYP102A1-LG23. На основе этих ДНК последовательностей были созданы плазмидные конструкции для экспрессии этих генов в бактериях Escherichia coli. Проведенное функциональное тестирование in vitro с экспрессированными в E. coli белковыми продуктами показало, что при использовании в качестве субстратов 3-оксо-4-ен-стероидов ряда андростана происходит их конверсия с образованием С7β- гидроксилированных андростанов, а 3-гидрокси-5-ен-стероиды могут трансформироваться с образованием соответствующих аллильных 7а- и 7b-спиртов. H2 Модификация стероидов андростанового ряда биотехнологически значимым штаммом мицелиального гриба Drechslera sp. F-34. Транскриптомный анализ мицелия, выращенного в различных условиях индукции, выявление генов новых стероидных цитохром-P450 монооксигеназ и оксидоредуктаз. Штамм Drechslera sp. Ph F-34 был выявлен как один из наиболее эффективных на этапе предварительного широкого скрининга мицелиальных грибов, представляющих отделы Ascomycota и Zygomycota. В ходе настоящей работы была изучена модификация стероидов андростанового ряда: андроста-1,4-диен-3,17-диона (АДД), андрост-4-ен-17β-ол-3-она (тестостерон, ТС) и андрост-5-ен-3β,17β-диола (дегидроэпиандростерона, ДГЭА) отмытым мицелием Drechslera sp. Ph F-34. В качестве потенциальных индукторов стероид трансформирующей активности клеток мицелия оценивали стероиды андростанового (андростендион (АД), АДД, ДГЭА), прегнанового (прогестерон, прегненолон) и холанового ряда (литохолевая кислота (ЛХК)), а также β-ситостерин. Ингибиторный анализ проводили с использованием циклогексимида (ЦГ) и хлорамфеникола (ХФЛ). Структура стероидных метаболитов была подтверждена с использованием методов ТСХ, ВЭЖХ, масс-спектрометрии (МС), 1Н и 13С ЯМР спектроскопии. С использованием ингибиторного анализа (с использованием циклогексимида, ЦГ) подтвержден конститутивный характер 17β-гидроксистероиддегидрогеназы (17β-ГСД) Drechslera sp., осуществляющей восстановление 17-кетогруппы АДД и ДГЭА с образованием 1(2)-дегидротестостреона (дгТС) и андростендиола, соответственно, и индуцибельность 7-гидроксилазной ферментативной системы, ответственной за проведение реакций 7-гидроксилирования. Выявлено, что 17β-ГСД Drechslera sp. Более активна в отношении 3-оксо-1,4-диенстероидов (АДД), чем в отношении 3β-ол-5-енстероидов (ДГЭА). Произведена оценка стероидов андростанового (андростендион (АД), АДД, ДГЭА), прегнанового (прогестерон, прегненолон) и холанового ряда (литохолевая кислота, ЛХК), а также β-ситостерина в качестве индукторов синтеза 7-гидроксилазы в клетках мицелия Drechslera sp. Максимальный индуцирующий эффект выявлен для ДГЭА и снижается в ряду ДГЭА>прогестерон>АД>ТС>АДД>прегненолон>ЛХК. β-Ситостерин не является индуктором синтеза стероидной 7-гидроксилазы в клетках Drechslera sp.. Ингибирующий эффект ЦГ и отсутствие влияния ХФЛ на синтез стероидной 7-гидроксилазы в клетках мицелия указывает на иную, чем митохондриальную природу 7-монооксигеназы. Показана зависимость стереоположения вводимой гидроксильной группы от структуры стероида. Присутствие 1,2-двойной связи (АДД) или 3β-гидроксильной группы в сочетании с 5(6)-двойной связью (ДГЭА) способствует введению гидроксильной группы клетками отмытого мицелия Drechslera sp. преимущественно в положение 7β, в то время как присутствие 17β-восстановленной группы в структуре стероида (дгТС, андростендиол) смещает положение введения гидроксильной группы в сторону C7α. Проведено высокопроизводительное секвенирование и транскриптомный анализ клеток мицелия гриба Drechslera sp., выращенных в различных условиях индукции дегидроэпиандростероном. Выделены и секвенированы мРНК клеток контрольного и индуцированного ДГЭА мицелия Dreshslera sp., осуществлена сборка транскриптома de novo и его аннотация. На основании анализа дифференциальной экспрессии выявлено 15 генов, уровень экспрессии которых в большей степени возрастал в ответ на индукцию клеток мицелия стероидным субстратом. Среди них идентифицированы дифференциально экспрессирующиеся гены цитохром-Р450-монооксигеназ, предположительно связанные с 7-гидроксилированием стероидов андростанового ряда в клетках культуры гриба. Среди транскриптов штамма гриба Drechslera sp. с использованием поиска по консервативным доменам выявлен ген cpr (ORF 2091 п.о.), предположительно кодирующий синтез НАДФН-цитохром Р450 редуктазы (CPR), уровень экспрессии которого в клетках контрольного и индуцированного ДГЭА мицелия Drechslera sp. был сопоставим, что свидетельствует в пользу конститутивной природы НАДФН-цитохром Р450 редуктазы. H2 Конструирование плазмидных генетических конструкций, способных к автономной репликации в клетках модельных штаммов бактерий и кодирующих гены актинобактериальных цитохромов P450 стероид-С26-гидроксилаз как одиночно, так и совместно с кДНК редокс-партнеров в составе полицистронных искусственных оперонов. 27-Гидроксихолестерин (26-гидроксихолестерин), начальный интермедиат окисления холестерина актинобактериями, образуется за счет активности белков суперсемейства P450-монооксигеназ. В клетках M. smegmatis функционируют как минимум две стероид-C26-гидроксилазы этого семейства: CYP125A3 и CYP142A2 , ортологичные Р450-монооксигеназам, обнаруженным в других актинобактериях (Rosłoniec et al., 2009; Capyk et al., 2009). В ходе работ отчетного периода сконструированы плазмидные генетические конструкции, кодирующие гены цитохромов P450 стероид-С26-гидроксилаз CYP125A3 и CYP142A2. ДНК-последовательности генов MSMEG_5995 и MSMEG_5918, кодирующих две бактериальные цитохромы P450 стероид-C26-монооксигеназы CYP125A3 и CYP142A2 были амплифицированы с хромосомной матрицы штамма Mycolicibacterium smegmatis mc2155. Полученные ампликоны были клонированы по рестрикционным сайтам NdeI и HindIII в плазмидном векторе pET28a под контролем индуцибельного промотора фага T7 с образованием рекомбинантных плазмид pETA3 и pETA2 для последующей экспрессии генов cyp125A3 и cyp142A2 соответственно в клетках E.coli. В результате переноса исследуемых ДНК-последовательностей в челночный плазмидный вектор pMVT61 под контроль индуцибельного ацетамидазного промотора были получены генетические конструкции pVA3 и pVA2, позволяющие при необходимости осуществлять контролируемую экспрессию генов монооксигеназ в клетках миколицибактерий. Для обеспечения транспорта электронов к гетерологичным цитохромам P450 были использованы «суррогатные» окислительно-восстановительные партнеры: адренодоксин (Adx) и адренодоксинредуктазу (AdR) коры надпочечников быка. кДНК-фрагменты редокс-партнеров Adx-AdR с рибосомсвязывающими сайтами [RBS_Adx_RBS_AdR] были интегрированы по сайту рестрикции HindIII в плазмиды pETA3, pETA2, pVA3 и pVA2 с получением конструкций pETA3AA, pETA2AA, pVA3AA и pVA2AA, несущих трицистронные опероны клонированных генов. Сконструированные на основе векторов pET28a и pMVT61 рекомбинантные плазмиды были валидированы секвенированием и перенесены соответственно в клетки E. coli BL21(DE3) и M. smegmatis groEL1ΔC для последующей (ко-)экспрессии целевых генов. Осуществлен биоинформатический поиск белковых партнеров, нативно функционирующих совместно с CYP125A3 и CYP142A2 в клетках M. smegmatis. Выявлены ДНК-последовательности генов, кодирующих ферредоксины FdxD и FdxE, а также ферредоксинредуктазы FdrA и FprA, ортологичные известным белкам других актинобактерий. Амплифицированные с хромосомы M. smegmatis mc2155 ДНК-фрагменты, несущие гены fdxD (MSMEI_5744), fdxE (MSMEI_2499), fdrA (MSMEI_ 1381) и fprA (MSMEI_2039), были поодиночно клонированы в векторе pET28a. Полученными конструкциями pETD, pETE, pETFd и pETFp были трансформированы клетки E. coli BL21(DE3). Таким образом, были получены рекомбинантные бактериальные штаммы, позволяющие осуществлять экспрессию генов стероид-C26-монооксигеназ CYP125A3 и CYP142A2 как одиночно, так и совместно с генами «суррогатных» редокс-партнеров, а также осуществлять биосинтез белков M. smegmatis, осуществляющих перенос электронов к цитохромам P450. Результаты проведенных исследований опубликованы в виде статей, а также обнародованы на научных конференциях.

Аннотация результатов, полученных в 2022 году
В соответствии с заявленным планом работы проводились по трем основным направлениям (Н1, Н2, Н3). H1 - Выбраны перспективные штаммы миколицибактерий для введения направленных мутаций. Получена серия генетических конструкций, необходимых для нокаута целевых генов, вовлечённых в деградацию боковой цепи стеринов на уровне C24-C22-интермедиатов. Оптимизирован протокол введения рекомбинантной ДНК в клетки M. fortuitum Ac-1817D. Получены мутанты Ac-1817D с нокаутом гена 3-кетостероид-1-дегидрогеназы - ksdD (G155_04625). Получен мутантный штамм M. neoaurum B-3805ΔkstDΔfadA5 с нокаутом гена ацетил-КоА ацетилтрансферазы fadA5. Показано, что у M. neoaurum B-3805 продукт гена fadA5 играет основную роль в перенаправлении катаболического потока в сторону преимущественного накопления C24-стероидов при деградации фитостеринов. Сконструированы мутантные штаммы M. neoaurum B-3805ΔkstDΔopccR с нокаутом гена opccR ацил-КоА редуктазы и 21-оксостероид редуктазы и M. neoaurum B-3805ΔkstDΔhsd4A с нокаутом гена hsd4A β-гидроксиацил-КоА дегидрогеназы. Установлено, что продукт гена opccR не является определяющим в образовании 20-гидроксиметилпрегненона (20-ГМП) у M. neoaurum B-3805, в то время как нокаут hsd4A позволяет перенаправить метаболический поток в сторону накопления 20-ГМП, выход которого в оптимизированных условиях достигает 95% (мольн.). Результаты отличаются от ранее опубликованных данных о ключевой роли opccR в повышении выхода 20-ГМП [Peng et al. 2020]. - Основные продукты биотрансформации фитостерина мутантным штаммом M. smegmatis mc2 155ΔfadD3 выделены и очищены до кристаллического состояния. Их структуры идентифицированы методами масс-спектрометрии и ЯМР-спектроскопии как, 3aα-H-4α(3'-пропаноат)-7aβ-метилгексагидро-1,5-индандион (ГИП) и 4аα-гидрокси-6аβ-метилдекагидроциклопента-[f]хромен-7(8H)-он (4a-ГМДЦ). Разработан лабораторный метод биотрансформации фитостерина в ГИП на уровне культуральных колб с применением мутантного клона M. smegmatis mc2 155ΔfadD3. Метод обеспечивает высокий выход целевого стероида при высоких (до 40 г/л) нагрузках фитостерина и перспективен для практического применения. H1.2 Осуществлено высокопроизводительное секвенирование полных транскриптомов культур термофильной актинобактерии Saccharopolyspora hirsuta, выращенных в различных условиях индукции холестерином. Результаты валидированы с помощью метода RT-PCR. Выявлены гены, увеличивающие экспрессию в присутствии холестерина, в том числе, гены, связанные с С26-гидроксилированием холестерина (cyp125) и его дальнейшим окислением (kstD3, kshA, ipdF, fadE30). Степень активации транскрипции генов коррелировала с низкой скоростью конверсии холестерина и образования интермедиатов окисления боковой цепи. Получены данные, свидетельствующие о том, что гены стероидного катаболизма у этой термофильной актинобактерии связаны функционально, но не на уровне регуляции транскрипции. Н2.1 Сконструированы комплекты рекомбинантных плазмид для гетерологической экспрессии генов мутантного бациллярного цитохрома CYP102A1-LG23 в бактериальных хозяевах: E. coli и M. smegmatis, а также генов, кодирующие глюкозодегидрогеназу PmGDH и глюкозо-6-фосфатдегидрогеназу MtG6PDH2. Для обоих бациллярных белков CYP102A1-LG23 и PmGDH смоделированы и синтезированы два варианта генов: дикого типа и оптимизированного для экспрессии в микобактериях. При использовании моноцистронных конструкций в клетках E. coli наблюдался высокий уровень экспрессии обоих генов cyp102a1-LG23 и gdh223. При коэкспрессии cyp102a1-LG23 и gdh223 в клетках снижался уровень синтеза как GDH, так и BM3-LG23, по сравнению с рекомбинантами, где эти гены представлены индивидуально. Оба синтезированных белка в клетках E. coli были представлены растворимыми формами и не отличались по целевой активности. Ген цитохрома с кодирующей последовательностью дикого типа не экспрессировался в клетках микобактерий, в отличие от высокого уровня синтеза этого белка с ДНК, оптимизированной для M. smegmatis. Присутствие ДНК фрагмента, кодирующего на N-конце CYP102A1-LG23 20-аминокислотного экстрапептида с 6xHis-tag обусловливало перевод значительной части синтезированного в микобактериях белкa этого цитохрома в нерастворимую форму. Удаление данного фрагмента способствовало повышению растворимости CYP102A1-LG23. Рекомбинантные штаммы M. smegmatis mc2155 Δ(kshB, kstD), гетерологически экспрессирующие бациллярный цитохром, осуществляли 7β-гидроксилирование АД, с максимальным выходом, отмеченным для штаммов, коэкспрессирующих цитохром P450 CYP102a1-LG23 с MtG6PDH. H2.2 Выявленный в ходе полнотрансриптомного анализа гриба Drechslera sp. кандидатный ген (cyp1) 7β-гидроксилазы (цитохром P450-монооксигеназы) и ген его редокс-партнера - НАДФН-цитохром Р450 редуктазы (CPR) были экспрессированы в бактериях E. сoli BL 21 DE(3). Функциональный анализ активности рекомбинантных ферментов in vitro подтвердил способность CYP1 к осуществлению гидроксилирования ДГЭА в положениях 7β и 7α. - Изучена биокаталитическая активность гриба Backusella lamprospora ВКМ F-944 в отношении 3-гидрокси-5-ен-стероидов. С помощью ингибиторного анализа подтвержден индуцибельный характер 7α-гидроксилазы и ее иная, чем митохондриальная, внутриклеточная локализация. ДГЭА оказывал максимальный индуцирующий эффект среди 9 протестированных потенциальных индукторов . Наряду с целевой гидроксилазной активностью штамм проявлял 17β-гидроксистероиддегидрогеназную (17-ГСД) активность. Подтвержден конститутивный характер 17-ГСД. Основными продуктами трансформации прегненолона B. lamprospora являлись 11α-ОН-прегненолон (18-20%) и 7α,11α-диОН-прегненолон (до 5%). - Аскомицет Gibberella zeae VKM F-2600 способен к образованию ценной урсодеоксихолевой кислоты (УДХК) за счет 7β-гидроксилирования литохолевой кислоты (ЛХК). С целью улучшения продуктивности гриба оптимизирована процедура протопластирования и мутагенеза. Найдены условия, обеспечивающие максимальный выход протопластов и их эффективную регенерацию . Получен мутантный штамм, по продуктивности образования УДХК превосходящий все известные аналоги. H2.3 Получены результаты, свидетельствующие о том, что гетерологическая экспрессия генов, кодирующих цитохромы P450 стероид-26-монооксигеназы CYP125A3 и CYP142A2 у миколицибактерий в клетках E.coli BL21(DE3) как одиночно, так и совместно с генами “суррогатных” редокс-партнеров – адренодоксина и адренодоксинредуктазы млекопитающих не обеспечивает образование С26-гидроксихолестерина в клетках E.coli BL21(DE3). Рекомбинантные гидроксилазы CYP125A3 и CYP142A2 очищены с помощью аффинной хроматографии. Осуществлена гетерологическая экспрессия генов, кодирующих нативные редокс партнеры у миколицибактерий. Получены гомогенные белковые препараты ферредоксина FdxE и двух ферредоксинредуктаз: NADH-зависимой FdrA и NADPH-зависимой FprA, подтверждена их функциональность в экспериментах in vitro. H3 Разработан эффективный метод ВЭЖХ с градиентной элюцией для профилирования и количественного анализа C19 - С24 стероидов - продуктов окисления боковой цепи стеринов. Метод адаптирован для автоматизированного микропрепаративного выделения очищенных фракций стероидов. Разработаны методы ВЭЖХ с изократической элюцией для профилирования и рутинного анализа изопреноидных продуктов биотрансформации и для микропрепаративного разделения инданов – продуктов глубокого окисления стеринов. Разработаны методы анализа С26-гидроксистероидов с 3-кето и 3-гидроксиструктурой, а также гидроксипроизводных с различным положением и стереоориентацией гидроксильных групп в стероидном ядре. Структуры ряда стероидных соединений подтверждены с помощью методов масс-спектрометрии и ямр-спектроскопии.

Аннотация результатов, полученных в 2023 году
Н1. Перспективный для промышленного использования штамм M. fortuitum VKM Ac-1817Д наряду с целевой 9α-гидроксилазной активностью проявляет нежелательную остаточную 3-кетостероид-1(2)-дегидрогеназную (3-КСД) активность, что обусловливает снижение выхода целевых 9α-гидроксистероидов. В геноме штамма VKM Ac-1817Д ранее обнаружено пять генов-паралогов с различным уровнем гомологии к известным генам kstD миколицибактерий, предположительно кодирующих 3-КСД. На основе нуклеотидной гомологии и дифференциальной экспрессии данных генов-паралогов kstD, три из них были выбраны в качестве перспективных мишеней для нокаута. Созданы генетические конструкции для нокаута трех паралогов гена kstD и выполнен комплекс исследований по их функциональному анализу. На основании сравнительной оценки активности кодируемых ими белков in vivo выявлена 3-КСД, обусловливающая нежелательную активность, приводящую к деструкции кольца B стероидного ядра при биотрансформации фитостерина у штамма M. fortuitum Ас-1817Д. - Перспективными стероидными синтонами для синтеза широкого ряда кортикостероидов являются С17(20)-дегидростероиды. С целью изучения возможности их биотехнологического получения из фитостеринов сконструирован мутантный штамм Mycolicibacterium neoaurum B-3805ΔkstDΔltp2 c инактивированным геном ltp2 (MyAD_24015) альдоль-лиазы, являющейся компонентом еноил-КоА гидратазного-ретроальдолазного комплекса ChsH1-ChsH2-Ltp2, который катализирует завершающие реакции деградации боковой цепи стеринов при C17. Установлено, что делеция ltp2 приводит к инактивации всего еноил-КоА гидратазного-ретроальдолазного комплекса, в результате чего полученные мутантные штаммы приобрели способность накапливать 3-оксопрегна-4,17(20)-диен-20-карбоксилат (ОПДК) и соответствующий метиловый эфир МОПДК, молекулы которых содержат С17(20) ненасыщенную связь. В отличие от известных бактерий, способных к образованию (М)ОПДК, полученные штаммы практически не продуцируют С19 стероиды, что свидетельствует о перспективности их использования для селективной продукции целевых С17(20)-дегидростероидов. Н2.1 Полученный методом направленной эволюции высокоактивный мутантный вариант цитохрома P450 из Bacillus megaterium – CYP102A1-BM3-LG23 с 14 мутациями в геме является высокоактивным растворимым белком, который способен эффективно осуществлять гидроксилирование стероидов ряда андростана в положении 7β (Li et al., 2020). Нами ранее был получен мутантный штамм Mycolicibacterium smegmatis BD с делециями в генах kshB и kstD, способный к эффективному окислению боковой цепи фитостерина. Этот штамм был использован в качестве микробной платформы для экспрессии генов CYP102A1-BM3. Для этого синтезировали гены мутантного цитохрома, оптимизированные для экспрессии в E.coli и ГЦ-богатых актинобактериях M. smegmatis, а также генов глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (zwf2 M. tuberculosis) и глюкозодегидрогеназы (gdh Priestia megaterium) для регенерации восстановленного НАД(Ф)H. Созданы наборы генетических конструкций для индуцируемой и конститутивной коэкспрессии генов бациллярного цитохрома cyp102A1-LG23 совместно с gdh и/или zwf2, и получены рекомбинантные штаммы E.coli и M. smegmatis, способные осуществлять целевую реакцию 7β-гидроксилирования андростендиона. Установлены преимущества использования ацетамидазного промотора в сравнении с конститутивным промотором Phs60. Использованиие в качестве микробной платформы мутантного штамма M. smegmatis BD обеспечивало более высокий выход целевого 7β-гидроксиандростендиона (7 β-OH-АД) в сравнении с E.coli и Mycolicibacterium neoaurum. Максимальный выход 7β -OH-АД достигнут с применением штамма M. smegmatis BD с плазмидой pVP2, несущей гены cyp102A1-LG23 и zwf2, и составил 37.7% (мольн.). Наряду с гидроксилированием в экваториальном положении 7β, рекомбинантный цитохром осуществлял также гидроксилирование в положении 1β и дигидроксилирование (в положениях 1β,7β). Структура образующихся моно- и дигидроксилированных стероидов подтверждена методами ТСХ, ВЭЖХ, масс-спектроскопии и ямр-спектроскопии. Результаты расширяют представления о гидроксилировании стероидных соединений бактериальными цитохромами. Разработанная методология может быть применена для получения ценных гидроксистероидов с применением уникального бактериального цитохрома P450-BM3. H2.2 На предыдущих этапах исследований нами была открыта способность мицелиального гриба Curvularia sp. ВКМ F-3040 (syn.Drechslera sp.) осуществлять эффективное 7β-гидроксилирование андростадиендиона (АДД). Нами был идентифицирован ген новой грибной 7-гидроксилазы, осуществлена его гетерологическая экспрессия и оценена функциональность рекомбинантного цитохрома в отношении стероидных соединений. На полнотранскриптомного анализа основании анализа полных транскриптомов гриба, выращенного в разных условиях индукции, выявлены дифференциально-экспрессирующиеся гены, среди которых отмечены кандидатные гены потенциальной P450-монооксигеназы (P450cur ) и ее нативного редокс-партнера – НАД(Ф)H цитохром P450 редуктазы (CPR). Уровень активации транскрипции кандидатного гена P450cur в присутствии дегидроэпиандростерона (ДГЭА) увеличивался более, чем в 300 раз. Создана генетическая конструкция, несущая гены P450cur и cpr, и использована для создания рекомбинантного штамма дрожжей Pichia pastoris. Функциональную активность рекомбинантного цитохрома оценивали in vivo в отношении стероидов андростанового ряда. Новая грибная гидроксилаза катализирует преимущественно 7β-гидроксилирование АДД, ДГЭА и андростендиола, в то время как 1-дегидротестостерон гидроксилируется этим ферментом преимущественно в положении C7-Hα. Структуры стероидов подтверждены методами ТСХ, ВЭЖХ, масс-спектрометрии и ямр-спектроскопии. Результаты расширяют представления о разнообразии грибных гидроксилаз, способных к селективной оксифункционализации стероидов и являются основой для практического применения в тонком органическом синтезе терапевтических стероидов. Н2.3 Cтероид-26-монооксигеназы принадлежат суперсемейству цитохромов P450 и функционируют в составе трехкомпонентных систем совместно с ферредоксинами и ферредоксинредуктазами, обеспечивающими электронный транспорт. С целью выявления редокс-партнеров стероидных 26-монооксигеназ у Mycolicibacterium smegmatis mc2155 клонированы и экспрессированы в клетках E.coli гены, кодирующие миколицибактериальные ферредоксины (FdxD и FdxE) и ферредоксинредуктазы (FdrA и FprA). Разработана схема выделения и очистки синтезируемых рекомбинантных белков и получены электрофоретически гомогенные препараты. Показано, что FdxD, FdxE, FdrA и FprA могут выступать компонентами транспорта электронов от восстановительных эквивалентов НАД(Ф)Н. Сконструированы наборы генетических конструкций для коэкспрессии белков 26-гидроксилаз (CYP125, CYP124) cовместно с ферредоксинами и ферредоксинредуктазами. Получены рекомбинантные штаммы M.smegmatis, способные к образованию целевого 26-гидроксихолестерина, и выявлены условия, способствующие его максимальному накоплению. Результаты могут быть использованы для разработки способов получения 26-гидроксихолестерина и его производных, для которых показана противовирусная активность (Lembo et al., 2013, Marcello et al., 2020). H3 Разработан метод биотрансформации фитостерина в лабораторных биореакторах с рабочим объёмом 1,5 л и нагрузкой субстрата 40 г/л в изопреноидный синтон 3aα-H-4α(3'-пропаноат)-7aβ-метилгексагидро-1,5-индандион (ГИП) с использованием штамма-продуцента M. smegmatis mc2 155ΔfadD3. Метод позволяет получать целевой продукт с высокой селективностью и мольным выходом (более 82%) в течение 96 часов биоконверсии. Разработан препаративный метод выделения и очистки целевого продукта с получением кристаллического ГИП высокой степени чистоты. Метод превосходит все известные аналоги и может быть рекомендован для получения ГИП – ценного синтона, стартовой молекулы в синтезе ряда гестагенов.