Аннотация результатов, полученных в 2021 году
В рамках первого года проекта РНФ № 21-65-00004 «Инновационная Т клеточная терапия солидных опухолей» был отработан протокол ретровирусной трансдукции для получения Т-лимфоцитов человека, экспрессирующих Т-клеточный рецептор (TCR), специфичный к эпитопу опухоль-ассоциированного антигена NY-ESO-1 (подход 1), химерный антигенный рецептор (CAR), специфичный к опухоль-ассоциированному антигену GD-2 (подход 2), TCR-подобный CAR-рецептор, специфичный к эпитопу опухоль-ассоциированного антигена MAGE-A4 (подход 3). При это выявлена относительно высокая эффективность трансдукции ретровирусами, кодирующими анти-GD2 CAR-рецептор и анти-MAGE-A4 TCR-подобный CAR-рецептор (61,6±5,39% и 37,35±4,09% от всех CD3-лимфоцитов, соответственно, средняя и стандартная ошибка средней) и относительно низкая эффективность трансдукции для ретровируса, кодирующего анти-NY-ESO-1 TCR (4,2±1,42%, средняя и стандартная ошибка средней). Согласно цитометрическому анализу все 3 типа полученных трансдуцированных клеток включали в себя CD4 и CD8 лимфоциты, обладали преимущественно наивным фенотипом и несли небольшое количество маркеров активации и истощения, что считается свойствами, способствующими увеличению эффективности противоопухолевой клеточной терапии. Оценка цитотоксичности полученных трансдуцированных культур в условиях in vitro выявила, что культуры, трансдуцированные CAR-рецептором, специфичным к GD-2 и TCR-подобным CAR-рецептором, специфичными к эпитопу MAGE-A4, оказывают значимо больший цитотоксический эффект на опухолевые клетки-мишени, несущие целевые антигены GD-2 и MAGE-A4, соответственно, чем нетрансдуцированные клетки, при этом не вызывая выраженной цитотоксичности при сокультивировании с контрольными опухолевыми линиями, не несущими целевых антигенов. Культуры, содержащие TCR-T-клетки, специфичные к эпитопу опухоль-ассоциированного антигена NY-ESO-1, не проявили выраженной цитотоксичности против релевантных опухолевых клеток, несущих NY-ESO-1 антиген, что согласовывалось с низкой эффективностью трансдукции для данного вида клеток. Оценка экспрессии маркеров активации и цитотоксичности на поверхности получаемых генно-модифицированных клеток после культивирования с клетками опухолевых линий, экспрессирующих целевой антиген, показала статистически значимое повышение содержания CD40L+ клеток в популяциях NY-ESO-1-специфичных TCR-T-клеток в ответ на культивирование с MAGE-A4+NY-ESO-1+ опухолевой линией SK-Mel-37; значимо возрастал процент CD69+ и 4-1BB+ клеток в популяциях GD2-специфичных CAR-T-клеток в ответ на культивирование с GD2+ опухолевой линией S6; также значимо более высокий процент CD69+ и 4-1BB+ клеток был показан в популяциях MAGE-A4-специфичных TCR-подобных CAR-T-клеток, культивированных с MAGE-A4+NY-ESO-1+ опухолевой линией SK-Mel-37, по сравнению с группами клеток, культивированными без опухолевых клеток или в присутствии опухолевой линии HCT-116, негативной по экспрессии MAGE-A4. Показана тенденция к повышению процента FasL+ клеток в популяциях генно-модифицированных клеток в ответ на культивирование в присутствии соответствующих антиген-экспрессирующих опухолевых линий для всех трех подходов. Оценка цитокин-продуцирующей функции исследуемых генно-модифицированных клеток показала увеличение экспрессии провоспалительных цитокинов, таких как IFN-γ, IL-2, TNF-α, в ответ на совместное культивирование с клетками опухолевых линий, экспрессирующих соответствующий по специфичности антиген. Для дальнейшего изучения противоопухолевой активности полученных генетически модифицированных клеток в условиях in vivo были отработаны мышиные модели ксенографтных опухолей. В частности, были поставлены модели ксенографтных опухолей человека на иммунодефицитных мышах линий NRG и SCID с использованием опухолевых линий человека SW620 (аденокарцинома толстой кишки человека, MAGE-A4+NY-ESO-1+) и U-87MG (эпителиальная опухоль головного мозга человека, GD2+), выявлены оптимальные дозы введения опухолевых клеток для получения ксенорафтной опухоли и изучена динамика роста ксенографтов. Разработаны генетические конструкции, кодирующие, эпитопы опухоль-ассоциированных антигенов, выбранных в качестве целевых для получения TCR-T-клеток на последующих годах работы по проекту (HER2/neu, MAGE-A3, PRAME, MART-1).

Аннотация результатов, полученных в 2022 году
В рамках второго года проекта РНФ № 21-65-00004 «Инновационная Т клеточная терапия солидных опухолей» был проведен транскриптомный анализ Т-клеток, трансдуцированных ретровирусными конструкциями, кодирующими Т-клеточный рецептор, распознающий опухоль-ассоциированные белки NY-ESO-1, GD2, MAGE-A4. Сравнение транскриптомов культур клеток проводилось с использованием панели NanoString Human Immunology V2 (579 целевых генов, 15 генов домашнего хозяйства, 8 позитивных и 6 негативных контролей). Обнаружено, что стимуляция анти-CD3 Т-клеток приводит к up-регуляции ключевых генов Т-эффекторов — GZMB, IFNG, IL2RA и TFRC и к активации путей, связанных с продукцией TNF-alpha. После взаимодействия эффекторных Т-клеток, трансдуцированных ретровирусом, несущим анти-GD2/MAGE-A4/NY-ESO1 и клеток опухолевой линии SK-Mel-37 в течении 2 часов обнаружены сигнатуры позитивной регуляции клеточной пролиферации и относительное повышение экспрессии гена IFNG у клеток несущих рецептор к MAGE-A4, и сигнатуры негативной регуляции пролиферации и активации Т-клеток для клеток с рецептором, распознающим GD2/NY-ESO1. Таким образом, получены эффекторные Т-клетки, у которых после трансдукции ретровирусными векторами, кодирующими антиген-специфические рецепторы распознающие MAGE-A4, в течение первых же часов взаимодействия с опухолевыми клетками происходит антиген-специфическая активация эффекторных функций Т-клеток и реализация цитотоксического ответа с экспрессией транскриптомного маркера — IFNG. Для эффекторных Т-клеток, трансдуцированных конструкциями, кодирующими рецептор, распознающий GD2 / NY-ESO1, взаимодействие эффекторов с опухолевыми клетками приводит к временной негативной регуляции пролиферации и активации Т-клеток. Однако цитотоксический эффект против опухолевых клеток реализуется для всех типов генетически-модифицированных Т-клеток, что говорит о разной временной активации генов регуляции иммунного ответа в зависимости от целевого антигена и рецептора. Для индукции in vitro популяций цитотоксических Т-лимфоцитов (ЦТЛ), специфичных к эпитопам двух опухоль-ассоциированных антигенов нами был разработан протокол с использованием дендритных клеток, нагруженных пептидами и подобраны условии для максимально эффективной индукции и культивирования цитотоксических Т-лимфоцитов. Анализ и сортировка антигенспецифических клеток проводилась с использованием гибкой системы Flex-T™ (Biolegend). Полученный протокол позволил увеличить число антиген специфических клеток против эпитопов белка HER2/neu и MAGE-A3 с 0,02% до 8% и получить фракцию клеток после сортировки с чистотой от 60 до 82%. Таким образом, при использовании данного протокола генерации антиген-специфических Т-клеток происходит более чем 150-кратное увеличение содержания целевых клеток в популяции CD8 клеток. Полученные клетки были затем использованы для приготовления библиотек экспрессии генов иммунного транскриптома (397 генов), мультиплексирования образцов и оценки полных последовательностей альфа- и бета-цепей Т-клеточных рецепторов единичных клеток. После полного цикла протокола выделения антиген-специфических Т-клеток было получено 3 образца, специфичных для эпитопа KVA антигена MAGE A3 и 2 образца специфичных для эпитопа KIF антигена HER 2/neu. Полученные клетки загружены в картридж BD Rhapsody и подготовлены финальные библиотеки при помощи трёх раундов полу-гнездовых ПЦР. В настоящее время проводится анализ библиотеки в компании «Евроген». Также нами были проведены предварительные эксперименты по получению клеток специфичных к эпитопам белков PRAME и MART-1 из клеток четырех HLA-A02-позитивных доноров. Максимальный уровень количества антиген-специфических клеток был достигнут 0,5%, что после сортировки позволило получить 20тыс. цитотоксических лимфоцитов. Для подбора эффективной ксенографтной модели для оценки эффективности формирования эффективного противоопухолевого иммунного ответа в условиях in vivo нами были отработаны 3 модели. В качестве модельной была выбрана линия иммунодефицитных мышей NRG (NOD.Cg-Rag1tm1Mom Il2rgtm1Wjl/SzJ), которым подкожно в область правой лопатки вводили 100 мкл суспензии опухолевых клеток. Нами проведены эксперименты по срокам развития опухолевого узла при подкожном введении мышам NRG опухолевых клеток SK-MEL-37, NW-MEL-38 и S6 в дозах 1млн/мышь, 3 млн/мышь и 5 млн/мышь по 5 мышей в каждой группе. Для опухолевых клеточных линий SK-MEL-37, NW-MEL-38 был характерен устойчивый рост опухолевого узла в дозах 3млн/мышь и 5 млн/мышь. Доза 1 млн/мышь, в обоих случаях показала значимо меньшую эффективность формирования опухолевого узла. Введение мышам клеток линии S6 не позволило сформировать ксенографтную модель ни в одной из исследуемых доз. В качестве первого эксперимента в задел следующего года была проведена экспериментальная терапия анти-GD2 CAR-T клетками ксенографтных опухолей линии SK-Mel-37. Мышам линии NRG было выполнено подкожное введение клеток линии SK-Mel-37 в дозе 5млн/мышь и по достижении среднего объема опухоли 100мм3 начата терапия с внутривенным и внутриопухолевым введением анти-GD2 CAR-T клеток в дозе 8млн/мышь, После однократного введения клеток человека проводился мониторинг размера опухоли 3 раза в неделю за каждой мышкой отдельно. В первые 2 недели после введения клеток человека группы с внутривенным и внутриопухолевым введением CAR-T GD2 клеток показали тенденцию к снижению объема опухоли по сравнению с группами контроля. На следующем этапе работы будет продолжен набор материала и повторение экспериментов. Таким образом, на данном этапе работы была проверена эффективность развития ксенографтных опухолей на экспериментальных иммунодефицитных мышах линии NRG, и подобраны 2 эффективные модели с клеточными линиями SK-Mel-37 и NW-Mel-38, которые в дозах 3 и 5 млн/мышь позволили получить стабильно растущие гетеротопические ксенографты у иммунодефицитных мышей линии NRG. Полученные результаты позволят провести на следующем этапе доклинические исследования in vivo генно-инженерных Т-клеток, в том числе при совмещении терапии против разных антигенов. Были выполнены эксперименты по предварительному анализу метаболизма антигенспецифических клеток при реализации цитотоксического ответа. Для отработки методологии метаболического анализа эксперименты проводили с использованием 3D модели клеточного сфероида из клеток опухолевой линии SK-MEL-37. Для определения характера метаболизма антиген-специфичных Т-клеток во время со-культивирования со сфероидами линии SK-MEL-37 использовали анализатор внеклеточного потока Seahorse XFp analyzer для измерения скорости потребления кислорода (OCR) и скорости внеклеточного закисления (ECAR) и показано, что интенсивность процессов гликолиза и окислительного фосфорилирования у антиген-специфичных Т-клеток, трансдуцированных ретровирусными векторами кодирующими рецепторы, распознающие NY-ESO-1, MAGE-A4, GD2, после сокультивирования со сфероидом опухолевых клеток достоверно выше, по сравнению с теми же клетками, которые не были культивированы с опухолевыми клетками. По результатам проведенной работы подготовлены и приняты в печать 10 публикаций, из них 9 публикаций в журналах, входящих в международные базы данных Scopus и WoS.

Аннотация результатов, полученных в 2023 году
На этапе 2023 года было выполнено секвенирование и анализ последовательности Т-клеточных рецепторов, распознающих эпитопы опухоль-ассоциированных антигенов HER-2/neu, MAGE-A3. При выполнении протокола индукции клональной экспансии было получено 7700 единичных клеток, из которых на основании анализа доминантности и аффинности клонотипов было выбрано по три клона TCR для антигенов HER-2/neu и MAGE-A3. С использованием полученных последовательностей были сконструированы лентивирусные вектора на основе ВИЧ-1 (pLenti hPGK GFP с вставкой вместо гена EGFP). Наработанные лентивирусы были сконцентрированы и подобрана необходимая множественность инфекции для трансдукции человеческих клеток. С использованием полученных конструкций была проведена трансдукция лимфоцитов здоровых доноров. Жизнеспособность культуры составляла 92-98%, в фенотипическом составе преобладали активные эффекторные цитотоксические лимфоциты. Анализ специфической цитотоксической активности показал ответ против клеточной линии SK-MEL-37. Биоинформатическое кластерирование с использованием arcsinh-преобразования показало 4 кластера клеток с экспрессией цитотоксических молекул, с преобладанием цитотоксических CD8 T-клеток, способных к уничтожению мишени с помощью перфорин-зависимого механизма и стимуляции апоптоза. Для индукции in vitro популяций антиген-специфичных цитотоксических Т-лимфоцитов против опухоль-ассоциированных антигенов PRAME и MART-1 .был оптимизирован многостадийный протокол стимуляции клональной экспансии и выделения клеток и было достигнуто получение 2-6% антигенспецифических клеток. Отсортированные клетки были использованы для секвенирования транскриптома единичных клеток и анализа последовательности Т-клеточных рецепторов, распознающих эпитопы опухоль-ассоциированных антигенов PRAME и MART-1. Бироинформатический анализ позволил обнаружить по 1 доминантному клонотипу для каждого эпитопа. С использованием полученных последовательностей были сконструированы лентивирусные вектора и конструкции готовы для передачи на синтез и вставку в плазмиду. Проверка эффективности получения генетически модифицированных клеток на оборудовании, сертифицированном для получения клеточных препаратов для иммунотерапии, была выполнена на комплексе оборудовании Sino-Biocan (производство Китай). Было подготовлено 2 клеточных препарата анти-GD2 CAR-T клеток и TCR-like анти-MAGE-A4, и фенотипический и функциональный анализ полученных клеток, подтвердил соответствие их данным, полученным в лабораторных условиях. Полученные данные подтвердили возможность использования и масштабирования разработанных в лаборатории протоколов для клинической практики. Оценка метаболизма ген-модифицрованных клеток проводилась в эксперименте in vitro при взаимодействии лимфоцитов со сфероидами клеточной линии SK-MEL-37. Энергетическая карта анти-NY-ESO-1 TCR-T-клеток показала, что общий уровень метаболической активности данных клеток после со-культивирования со сфероидами, достоверно выше по сравнению с группами контроля, и показано что генетически модифицированные NY-ESO-1 TCR-T клетки используют одновременно потенциал гликолитического пути окисления и сложного пути процессов окисления пирувата в митохондриях для подавлению опухолевых клеток в условиях in vitro. При оценке метаболизма анти-GD2 CAR-T клеток при взаимодействии с 3D структурой опухолевых клеток было показано значимое усиление митохондриальной активности, а также активация дополнительной продукции АТФ через механизмы гликолиза. Такая метаболическая интенсивность у CAR-T-клеток может говорить об их метаболической пластичности в ответ на жесткие условия среды, которые выражаются в индукции метаболических ферментов участвующих в продукции различных цитокинов для эффективного ответа на опухолевые микроокружение. Оценка метаболизма MAGE-A4-специфичных TCR-подобных CAR-T-клеток, указывает на изменение метаболизма посредством переключения на окислительное фосфорилирование. Активность митохондрий MAGE-A4-специфичных TCR-like CAR-T-клеток свидетельствует о быстрой реактивности и перепрограммированию клеток в ответ на опухолевое микроокружение. За перепрограммирование метаболизма клеток в ответ на опухолевое окружение отвечает белковый комплекс в виде mTORC1. При активации Т-клеточного рецептора этот комплекс активирует метаболизм клеток, способствуя более быстрой адаптации клеток к альтернативным источникам энергии и поддержанию эффективности CAR-T клеток. В качестве дополнительного этапа 2023 года было выполнено 3 серии экспериментов по клеточной терапии мышей с ксенотрансплантатами линии SK-MEL-37 на мышах NRG (NOD.Cg-Rag1tm1Mom Il2rgtm1Wjl/SzJ). Экспериментальная терапия с помощью анти-GD2 CAR-T клетками показала эффективность при однократным внутриопухолевом введении. Терапия ксенотрансплантата SK-MEL-37 с помощью TCR-like анти -MAGE-A4 клеток показала значимое снижение размеров опухолевого узла только при внутривенном введении ген-модифицированных клеток. Экспериментальная терапия животных с помощью клеток, с ген-модифицированным рецептором, распознающий эпитопы белка NY-ESO1 показала, что оба вида введения клеток снижали размер опухолевого узла на сроках до 14 дней. Дальнейшие доклинические исследования следующего этапа будут включать повторы экспериментов (для подтверждения полученных данных) и эксперименты с объединением нескольких типов генно-модифицированных клеток для усиления противоопухолевого эффекта. Анализ транскриптома единичных клеток после реализации противоопухолевого эффекта in vivo был выполнен в эксперименте с ксенотрансплантатом SK-MEL-37 и терапией внутривенным введением клеток анти-NY-ESO1. Анализ клеток выделенных из периферической крови животных у которых было показано значимое снижение размеров опухолевого узла показал, что трансдуцированные CD8 TCR-T-клетки имели ярко выраженные сигнатуры активации Т-клеток (LAG3, GNLY, DUSP2, FCGR3A, KLRK1, PRDM1 и TARP) и цитотоксичности (PRF1, GZMB, GZMH и GZMK), которые отсутствовали в других исследованных Т-клетках. Подготовлены и приняты в печать 6 публикаций, из них 5 публикаций в журналах, входящих в Q1 Scopus и WoS. Подготовлена и отправлена заявка на патент. Таким образом, нарастающим итогом опубликовано 23 статьи, с учетом количества статей в Q1 - 31 публикация.