КАРТОЧКА ПРОЕКТА,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

НазваниеПатогенетика наследственных форм умственной отсталости: клеточные, молекулярные и онтогенетические аспекты

РуководительЛебедев Игорь Николаевич, Доктор биологических наук

Организация финансирования, регионфедеральное государственное бюджетное научное учреждение "Томский национальный исследовательский медицинский центр Российской академии наук", Томская обл

КонкурсКонкурс 2021 года «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований по поручениям (указаниям) Президента Российской Федерации» (генетические исследования)

Аннотация
Нарушения развития головного мозга, приводящие к задержке интеллектуального развития в детском возрасте, умственной отсталости и аутизму, имеют высокую распространенность в популяции (до 1-3%), неся существенный груз для семьи и общества (Ilyas et al., 2020). В связи с этим ранняя диагностика, профилактика и лечение таких заболеваний является одной из ключевых проблем современного здравоохранения. Патогенетические механизмы развития интеллектуальных нарушений весьма разнообразны и зависят как от генетических факторов, так и от влияния окружающей среды. Наблюдающееся в последнее десятилетие стремительное развитие технологий анализа генома и их нарастающая интеграция в практику персонализированной и геномной медицины, привели к значительному росту информации о генах, мутации в которых описаны у пациентов с интеллектуальными нарушениями. Вместе с тем, механизмы, регулирующие когнитивные функции мозга и затрагиваемые такими мутациями, остаются во многом еще неясными. С клинической точки зрения, это накладывает определенные ограничения на надежность интерпретации патогенетической значимости идентифицируемых генетических вариантов и стоящей за этим обоснованности принимаемых диагностических, профилактических и возможных терапевтических решений. Проблемность существующего момента подчеркивается фактически 4-кратным разрывом между объемом накопленной информации о мутациях в более чем 1000 генах у пациентов с умственной отсталостью (Vissers et al., 2016, 2018) и числом самостоятельных нозологических единиц наследственных форм интеллектуальных нарушений, отмеченных в базе данных наследственных болезней человека (OMIM). На конец 2020 года в ней зарегистрировано 72 формы аутосомно-рецессивной (MRT), 63 формы аутосомно-доминантной (MRD) и 108 форм Х-сцепленной (MRX) умственной отсталости (http://omim.org). Причиной такого дисбаланса является несколько факторов, среди которых следует подчеркнуть чрезвычайную сложность и необратимость онтогенетических процессов формирования головного мозга, затрудняющих расшифровку пусковых патогенетических механизмов. Другим фактором является колоссальное разнообразие генетических вариантов, выявляемых в когортах пациентов с интеллектуальными нарушениями. В то же время, каждый конкретный пациент может быть носителем уникального (орфанного) варианта, доказательство патогенетической значимости которого в условиях объема выборки, определяемого формулой “n=1”, представляет непростую задачу. Наконец, накапливаемые в литературе данные и наш собственный опыт, свидетельствуют о том, что ряд микроструктурных хромосомных аномалий (Copy Number Variation, CNV), ассоциированных с интеллектуальными нарушениями и определяющих до 15-20% случаев заболевания, могут встречаться и у здоровых носителей без каких-либо клинических проявлений, обозначая феномен неполной пенетрантности наследственных изменений, способных, часто с неопределенной вероятностью, реализоваться нарушениями когнитивных функций. Для решения обозначенных проблем в рамках настоящего проекта мы планируем объединить наши ресурсы, опыт и компетенции в организации новой лаборатории онтогенетики наследственных болезней, основным научным направлением которой будет являться изучение и расшифровка патогенетических механизмов формирования наследственных болезней, прежде всего интеллектуальных нарушений, в динамике ранних онтогенетических процессов. Концептуально, наши исследования будут развиваться в двух фундаментальных и одном технологическом направлениях. Первое направление, так называемая “прямая онтогенетика”, будет построено на создании in vivo моделей заболеваний с использованием лабораторных животных. В рамках данного направления мы планируем создать, в зависимости от числа выявленных генетических вариантов и степени их изученности в мировой литературе, от 5 до 10 мышиных моделей наследственных заболеваний, проявляющихся нарушениями организации и функций головного мозга. Использование мышиных моделей с адресными модификациями генома, в том числе с "loss-of function" и "gain-of-function" мутациями, моделирующими полярные изменения в копийности генов, с прицентромерными или субтеломерными хромосомными перестройками, зарегистрированными у наших пациентов, позволит провести глубокое анатомо-морфологическое фенотипирование, электрофизиологическое исследование мозга, а также транскриптомный, эпигенетический и протеомный анализ в зависимости от природы генетического дефекта. На завершающих этапах проекта для некоторых генов мы проведем эксперименты по генетической репарации и восстановлению их функций в созданных моделях за счет сверхэкспрессии, либо нокаута целевых белков, изменяющих свою активность в мутантных линиях, с помощью shRNA или CRISPR/Cas9-технологий. Второе направление, “обратная онтогенетика”, преодолевая существующие ограничения модельных животных, будет построено на использовании технологий клеточного репрограммирования и дифференцировки с созданием in vitro моделей, включая 3D-нейрональные органоиды, на основе линий индуцированных плюрипотентных стволовых клеток от пациентов с микроструктурными хромосомными аберрациями, проявляющимися нарушениями интеллектуального развития. В фокусе нашего внимания будут, прежде всего, хромосомные микроделеции и микродупликации одних и тех же хромосомных регионов, затрагивающие единственный ген. Эти же гены потенциально могут стать предметом изучения и в рамках отмеченного выше направления “прямой онтогенетики” при создании in vivo моделей. Актуальность изучения подобных “моногенных CNV” (single-gene CNV) определяется главным образом возможностью идентификации новых кандидатных генов микроделеционных и микродупликационных синдромов, выяснением их функциональной значимости в развитии центральной нервной системы с сопутствующим анализом вероятных плейотропных эффектов, как ключевого признака хромосомных заболеваний, классически проявляющихся множественными нарушениями развития разных систем органов, в том числе затрагивающих процессы эмбрионального развития и ведущих к ранней эмбриональной гибели. В то же время нас будут интересовать и вопросы неполной пенетрантности микроструктурных хромосомных аномалий. В своем исследовании мы также сконцентрируемся на получении линий индуцированных плюрипотентных стволовых клеток от клинически бессимптомных носителей хромосомных перестроек. Транскрипционные и эпигенетические исследования планируется выполнить на уровне клеток с индуцированной плюрипотентностью, эмбриоидных телец, 3D-органоидов, моделирующих ранние стадии развития головного мозга человека, а также в терминально дифференцированных нейрональных клетках с хромосомными мутациями. Наконец, третий раздел проекта будет связан с разработкой новых методов молекулярно-генетической диагностики недифференцированных форм умственной отсталости. В рамках этого блока мы планируем создать и апробировать новые методы поиска и биоинформатической интерпретации генетических вариантов, основанные на комбинации технологии захвата конформации хромосом (технологии Hi-C) и экзомного обогащения, позволяющих одновременно решать вопросы диагностики моногенных мутаций, детекции сбалансированных и несбалансированных хромосомных перестроек, что не реализовано ни одной существующей в настоящее время технологией. Решение задачи профилактики наследственных форм интеллектуальных нарушений, связанных с микроструктурными изменениями в числе копий хромосомных регионов (Copy Number Variation, CNV), будет связано с разработкой технологии полногеномного анализа новых обогащенных фракций внеклеточных нуклеиновых кислот плода в крови беременной женщины. Планируемая в рамках проекта разработка технологии преимплантационного генетического тестирования унаследованных патогенетически значимых CNV в геноме эмбриона в рамках процедур искусственного оплодотворения, основанная на комбинации методов полногеномного хромосомного скрининга и анализа гаплотипов, позволит преодолеть существующий в современной преимплантационной генетической диагностике барьер на выявление микроструктурных хромосомных изменений размером менее 5-10 миллионов пар оснований (5-10 Mb).

Ожидаемые результаты
В соответствии с блоками фундаментальных и технологических направлений исследований, а также требованиями конкурсной документации и индикаторами Федеральной научно-технической программы развития генетических технологий на 2019-2027 годы, ожидаемые результаты проекта могут быть обозначены следующим образом: - Создание от 5 до 10 in vivo моделей наследственных форм интеллектуальных нарушений на основе линий мышей с адресными модификациями генома на генном и хромосомном уровне. Верхний предел в количестве созданных моделей будет определяться идентификацией новых наследственных мутаций у пациентов с недифференцированными формами умственной отсталости. Данная идентификация будет проводиться на протяжении всего периода реализации проекта в ходе клинического и диагностического обследования пациентов с использованием дополнительно привлекаемых источников финансирования. Критериями выбора генов и хромосомных перестроек для создания in vivo моделей будут: степень изученности идентифицированных генов в мировой литературе; их предполагаемая роль в патогенезе нарушений интеллектуального развития; локализация перестроек в разных районах хромосом, в том числе обогащенных гетерохроматином, определяющих вероятность формирования патологического фенотипа. В настоящее время мы располагаем информацией о генетических вариантах в геноме более 1000 пациентов с недифференцированными формами умственной отсталости. К окончанию проекта в 2024 году предполагается, что число таких пациентов будет удвоено. На момент подготовки заявки нами инициировано создание первой в мире in vivo модели синдрома Насименто (Х-сцепленная форма умственной отсталости, MIM 300860, https://omim.org/entry/300860), обусловленного мутациями гена UBE2A и хромосомными перестройками в субсегменте Xq24, описанными в наших совместных исследованиях (Tolmacheva et al., 2020, PMID: 32485717) (см. Рис. 1 в Приложении к заявке). - Создание in vitro моделей наследственных форм умственной отсталости на основе линий индуцированных плюрипотентных стволовых клеток от пациентов с микроструктурными хромосомными аномалиями или точечными мутациями. Фокус нашего внимания будет сконцентрирован на создании линий от пациентов с хромосомными микроделециями и микродупликациями, затрагивающими единственный ген, с целью изучения его дозо-зависимых эффектов, механизмов неполной пенетрантности и возможных плейотропных проявлений. На момент подготовки заявки мы уже располагаем коллекцией линий от двух семей с наследственными формами микроделеций и микродупликаций в локусе 3p26.3, затрагивающих ген CNTN6 (Gridina et al., 2019, PMID: 31518906: Shnaider et al., 2019, PMID: 31678775). Кроме того, нами ведется работа по получению линии с нуллисомией по гену CNTN6 с использованием метода CRISPR/Cas9. Данные линии будут использованы в проекте для характеристики транскрипционных и эпигенетических изменений, определяющих неполную пенетрантность и плейотропные эффекты мутаций. В течение первого года реализации проекта планируется создать новую клеточную in vitro модель от бессимптомного носителя частичной трисомии 10p11.21q11.23 размером 9 Mb для анализа механизмов эпигенетического сайленсинга протяженной хромосомной перестройки. - В результате выполнения проекта ожидается получить ряд новых фундаментальных научных результатов, связанных с идентификацией новых генов или CNV у пациентов с нарушениями интеллектуального развития. В исследовании будет проведен анализ частоты и спектра CNV при недифференцированных формах умственной отсталости, их размера, генного состава, хромосомной локализации и происхождения. Транскриптомный и эпигенетический анализ CNV с использованием созданных in vivo и in vitro моделей позволит идентифицировать спектр дифференциально экспрессирующихся генов и эпигенетических модификаций хроматина, определяющих неполную пенетрантность и плейотропные эффекты хромосомных и моногенных мутаций на ранних этапах онтогенеза. - Реализация проекта позволит разработать и провести клиническую апробацию ряда новых молекулярно-генетических методов диагностики наследственных форм умственной отсталости и задержки интеллектуального развития, включая: А) метод Exo-C, основанный на комбинации технологии захвата конформации хромосом (Hi-C) и экзомного секвенирования, позволяющий проводить одновременную идентификацию моногенных мутаций, несбалансированных и сбалансированных (в том числе сбалансированных транслокаций и инверсий) хромосомных перестроек (см. Рис. 2 в Приложении к заявке). Метод Exo-C в настоящее время не имеет прямых аналогов в мировой практике. Б) метод неинвазивного пренатального тестирования (НИПТ) наследственных и de novo CNV по анализу обогащенных фракций внеклеточной ДНК плода, связанных с клеточной поверхностью, циркулирующих в крови беременной женщины, в семьях с высоким генетическим риском рождения ребенка с хромосомным заболеванием по данным ультразвукового и биохимического скрининга, а также в случае семейного носительства патогенетически значимых микроделеционных или микродупликационных хромосомных вариантов. В) метод преимплантационного генетического тестирования (ПГТ) эмбрионов на предмет хромосомных микроделеций и микродупликаций в рамках циклов искусственного оплодотворения в семьях, являющихся носителями патогенетически значимых микроструктурных хромосомных вариантов. Метод не имеет прямых аналогов в мировой литературе и основан на комбинированном применении технологий полногеномного хромосомного скрининга и анализа сегрегации гаплотипов, фланкирующих регион хромосомной перестройки, после полногеномной амплификации ДНК. В настоящее время мы проводим апробацию разрабатываемого метода для преимплантационной генетической диагностики отмеченного выше синдрома Насименто в семье, в которой мать является носительницей не манифестирующей вследствие асимметричной инактивации Х-хромосомы микроделеции Xq24, размером 239 кб. В сравнении с этим стоит отметить, что предел существующих в настоящее время методов преимплантационного генетического тестирования микроструктурных хромосомных перестроек ограничен диапазоном 5-10 Mb для aCGH и 2,4-5 Mb для SNP-array (ESHRE PGT Consortium good practice recommendations for the detection of structural and numerical chromosomal aberrations // Hum Reprod Open 2020. PMID: 32500102 DOI: 10.1093/hropen/hoaa017). Г) В ходе выполнения проекта планируется создать коллекцию референсных ДНК-образцов для молекулярной in vitro диагностики микроделеционных и микродупликационных синдромов, в том числе для пренатальной диагностики.

Аннотация результатов, полученных в 2021 году
В отчетном периоде исследования проводились по трем основным направлениям: создание и анализ in vivo моделей наследственных заболеваний, сопровождающихся нарушением интеллектуального развития; создание и анализ in vitro моделей; разработка новых технологий диагностики. Кроме того, на протяжении всего периода проводился рекрутинг пациентов с недифференцированными формами умственной отсталости с целью поиска новых генных и хромосомных вариантов для моделирования. Блок 1. Создание и анализ in vivo моделей. Для создания in vivo (на мышах) модели синдрома Насименто (OMIM 300860) были разработаны генетические конструкции для гиперэкспрессии, нокаута и нокдауна гена Ube2a. Эффективность гиперэкспрессии и нокаута гена Ube2a была подтверждена тестированием в клетках нейробластомы мыши N2A с последующей детекцией с помощью Вестерн-блот анализа. Анализ экспрессии мРНК гена Ube2a на разных эмбриональных стадиях был проведен с помощью in situ гибридизации, продемонстрировавшей, что мРНК Ube2a детектируется в нейрональных предшественниках на стадиях Е12.5, Е14.5 и Е15.5. На стадиях Е16.5 и Е18.5 экспрессия Ube2a также детектируется в кортикальной пластине. Далее ген Ube2a был инактивирован в коре головного мозга эмбрионов мыши с помощью in utero электропорации генетических конструкций в латеральные желудочки мозга эмбрионов. В результате была обнаружена задержка миграции кортикальных нейронов при снижении экспрессии гена Ube2a по сравнению с контролем. Для моделирования эффектов эпигенетического сайленсинга хромосомных аберраций у носителей малых сверхчисленных маркерных хромосом (sSMC) начато создание экспериментальных линий мышей с делециями в прицентромерном и прителомерном районах хромосом с помощью CRISPR/Cas9 редактирования генома. Внесение хромосомных перестроек производится путем микроинъекций компонентов системы CRISPR/Cas9 в цитоплазму зигот мышей. В настоящее время получено 384 зиготы от 35 самок мышей линии C57BL, в 167 зигот провели инъекции генетических конструкций с компонентами системы CRISPR/Cas9. Из них 119 зигот были трансплантированы, однако из 86 подсаженных зигот, срок внутриутробного развития которых завершился, получено только 8 мышат, еще для 33 зигот результаты пока ожидаются. Блок 2. Создание и анализ in vitro моделей. Мы изучили случай носительства малой сверхчисленной маркерной хромосомы (sSMC), обнаруженной в ходе пренатальной диагностики у плода. Происхождение и структура маркерной хромосомы были установлены с помощью: стандартного цитогенетического анализа, aCGH на SNP-микрочипах, количественной ПЦР в режиме реального времени, FISH-анализа с центромеро-специфичными, теломеро-специфичными и локус-специфичными ДНК-зондами; хромосомной микродиссекции с обратной in situ гибридизацией; полногеномной амплификации и секвенирования микродиссекционной ДНК-библиотеки. Было установлено, что sSMC является кольцевой производной хромосомы 10 и включает регион короткого плеча 10p11.21-p11.1 и длинного плеча 10q11.21-q11.23 размером 1,243 и 7,173 Mb, соответственно. Присутствие в кариотипе дополнительного хромосомного материала протяженностью около 9 Mb, содержащего 107 генов, в том числе 7 генов, индексированных в OMIM, не привело к каким-либо клиническим проявлениям на момент рождения ребенка, и позволило сформулировать гипотезу о наличии механизмов эпигенетического сайленсинга генов, локализованных в прицентромерном регионе маркерной хромосомы (Lebedev et al., 2021; PMID 34440234). Так как данная семья отказалась от дальнейшего сотрудничества, in vitro моделирование эффектов эпигенетического и транскрипционного сайленсинга генов в прицентромерных регионах хромосом стало проводится на основе клеточных линий от другого бессимптомного носителя sSMC – деривата хромосомы 4. Мы установили линию фибробластов пациента (TAF16), из которой получили 12 линий ИПСК. Стандартный цитогенетический анализ показал, что sSMC сохраняется в 72% ИПС клеток. Происхождение sSMC было подтверждено при помощи FISH с прицентромерными зондами, продемонстрировавшими, что sSMC является дериватом хромосомы 4, и FISH с теломероспецифичным зондом, свидетельствующим о ее кольцевой форме в ИПСК. Мы получили линии кортикальных нейронов из ИПСК пациента с микродупликацией гена CNTN6, со скорректированным генотипом и контрольных линий путем направленной дифференцировки за счет сверхэкспрессии гена NGN2. Для установления причин вариабельности проявления микродупликаций в локусе 3p26.3 мы оценили распределение эпигенетических маркеров, локализованных вблизи гена CNTN6. ChIP-seq анализ показал, что для пациент-специфических ИПСК с дупликацией характерна гетерохроматинизация данного региона, распространяющаяся и за его пределы на область до 7 Mb. Гетерохроматинизация дуплицированного региона в ИПСК свидетельствует о снижении экспрессии гена CNTN6 и/или генов длинных некодирующих РНК, лежащих в данном локусе, что согласуется с данными о дисбалансе в аллельной экспрессии CNTN6 у пациента с дупликацией, и свидетельствуют в пользу гипотезы о влиянии эпигенетического статуса дуплицированного района на фенотипические проявления изменений копийности. Для изучения роли гена UBE2A в нейрогенезе человека мы создаем клеточную модель на основе ИПСК, в которую будут входить ИПСК от пациентов с аномалиями нейрогенеза, задержкой интеллектуального развития и перестройками в сегменте Xq24 (микроделецией и микродупликацией), ИПСК от их здоровых матерей – носительниц аналогичных перестроек, ИПСК с нокаутом и с гиперэкспрессией гена UBE2A и контрольные ИПСК. К настоящему времени получено по 10 линий ИПСК от двух бессимптомных носителей перестроек и пациента с микроделецией Xq24 (всего 30 линий с перестройками, затрагивающими локус гена UBE2A). Начата работа по созданию линий клеток с нокаутом и с повышенной экспрессией гена UBE2A путем редактирования генома ИПСК. Для нокаута гена UBE2A было использовано CRISPR-Cas9 геномное редактирование ИПСК здорового донора FD5S с кариотипом 46,XX, результаты которого оценивали секвенированием по Сэнгеру. 18 клонов (44%) несли в гене UBE2A нокаутирующий индел в гомозиготном состоянии, 7 клонов (18%) были компаунд-гетерозиготами по нокаутирующим инделам, один клон был гетерозиготой по нокаутирующей однонуклеотидной инсерции. Интересно, что пролиферативная активность нокаутных по гену UBE2A клонов оказалась выше, чем исходной линии. Поиск дифференциально-экспрессирующихся генов (ДЭГ) проводили для нейронов, полученных из ИПСК пациентов с микроделецией и микродупликацией гена CNTN6, и здоровых индивидов. Для нейронов с разным числом копий CNTN6 было показано преимущественно снижение экспрессии ДЭГ по сравнению с контролем. Мы выделили 4 категории транскрипционных эффектов реципрокных CNV, затрагивающих данный ген: 1) однонаправленное увеличение экспрессии (25 ДЭГ); 2) однонаправленное снижение экспрессии (402 ДЭГ); 3) снижение экспрессии генов при дупликации и повышение экспрессии данных генов при делеции CNTN6 (51 ДЭГ); 4) повышение экспрессии генов при дупликации и снижение экспрессии данных генов при делеции CNTN6 (51 ДЭГ). Продукты общих ДЭГ в нейронах с микроделецией и микродупликацией CNTN6 участвуют в синаптической передаче сигнала и нейрогенезе. Блок 3. Разработка технологий диагностики. Сформирована выборка семей для идентификации новых, неописанных мутаций, приводящих к порокам развития головного мозга и нарушениям интеллектуального развития. Предварительно у пациентов были исключены числовые и крупные структурные хромосомные аномалии, наследственные нарушения обмена и известные моногенные наследственные синдромы. Проведено полноэкзомное секвенирование в 4 семьях с семейными формами умственной отсталости. У пациента М. (7 лет, синдром Денди-Уокера, агенезия мозолистого тела, гипогенезия моста, пахигирия лобных долей, эпилептическая энцефалопатия) выявлена de novo миссенс-мутация в гетерозиготном состоянии на хромосоме 1 в гене MACF1, затрагивающая консервативную аминокислоту. Клиническая значимость варианта на настоящий момент неизвестна, в литературе по данным на декабрь 2021 г. он описан не был. Результаты in silico алгоритмов предсказывают патогенное влияние данной замены на структуру белка. Хромосомный микроматричный анализ 25 парных образцов плацентарных тканей (хорион и экстраэмбриональная мезодерма, являющихся производными разных зародышевых листков) от спонтанных абортусов с нормальным кариотипом проведен для выявления CNV, обладающих плейотропным эффектом во внутриутробном и постнатальном периоде развития. CNV проанализированы по типу, генному составу, клинической значимости и происхождению, выявлены микроперестройки, общие для погибших эмбрионов и пациентов с задержкой интеллектуального развития. Интересно, что помимо CNV, выявленных в двух типах плацентарных тканей и, следовательно, имеющих мейотическое происхождение, мы обнаружили большое число мозаичных CNV митотического происхождения. Начато исследование физико-химических характеристик фракций внеклеточной ДНК плода, связанной с клеточной поверхностью и циркулирующей в крови матери, в том числе женщин, вынашивающих плод с хромосомной анеуплоидией. Получена и фракционирована кровь от 21 беременной женщины, определена концентрация и распределение длин фрагментов вкДНК. Для семей, в которых один из супругов является носителем патогенной CNV, ведется разработка нового подхода к выявлению хромосомных микроделеций/микродупликаций в ходе преимплантационного генетического тестирования (ПГТ). Сущность подхода заключается в комбинации принципов ПГТ на моногенные наследственные заболевания (ПГТ-М) с анализом гаплотипов, маркирующих хромосому с CNV, и ПГТ на анеуплоидии (ПГТ-А) с целью исключения переноса эмбриона с нарушением числа хромосом. Необходимость комбинационного подхода обусловлена недостаточными разрешающими возможностями современных методов aCGH и NGS в детекции хромосомных микроперестроек после полногеномной амплификации единичных клеток в биоптате трофэктодермы. Разработанная тест-система для преимплантационной генетической диагностики микроделеционных синдромов позволила в семье с delXq24 выбрать для переноса эмбрион со сбалансированным кариотипом, однако беременность у женщины не наступила. В семье с del1q41 оба полученных эмбриона имели дополнительные анеуплоидии и не были рекомендованы к переносу. Сформирована референсная выборка из 22 пациентов с известными микроделеционными/ микродупликационными синдромами, сочетающимися с нарушениями психомоторного развития. Проведена клиническая характеристика пациентов и молекулярно-цитогенетический анализ с помощью aCGH, верифицированный методом ПЦР в реальном времени. Для каждого пациента охарактеризованы размер и границы микроперестройки, ее генный состав с выделением генов, вероятно связанных с развитием симптомов заболевания. Проводится отработка технологии одновременного анализа 3D-организации хроматина и секвенирования его последовательности (Exo-C), позволяющая с высокой точностью выявлять сбалансированные хромосомные перестройки. С этой целью была сформирована выборка пациентов, включающая 11 индивидов с инверсиями и сбалансированными транслокациями и 2 индивидов с несбалансированными перестройками. Впервые методом Exo-C были проанализированы геномы пациентов с инверсиями. Было показано характерное изменение паттерна трехмерных контактов, свидетельствующее о наличии крупных инверсий. Визуальный анализ полученных Exo-C-карт позволил подтвердить наличие инверсий и установить координаты их границ с точностью до 50 тысяч п.о. для образцов гетерозиготных инверсий, что говорит о чувствительности метода, достаточной для выявления хромосомной перестройки даже на фоне контактов нормального локуса. Выявленные паттерны будут использованы для разработки автоматического алгоритма поиска сбалансированных хромосомных перестроек на основе Exo-C-данных.

Публикации

1. - Найден способ выявлять безопасные аномалии в числе хромосом у зародыша ТАСС, 18 ОКТ 2021, 08:43 (год публикации - ).

2. - Найден способ выявлять безопасные аномалии в числе хромосом у зародыша Российский научный фонд, 18 октября, 2021 10:31 (год публикации - ).

3. - Томские генетики научились выявлять безопасные аномалии в числе хромосом у зародыша Вести-Томск (ГТРК Томск), 10.11.2021 (год публикации - ).

4. Кашеварова А.А., Лопаткина М.Е., Беляева Е.О., Федотов Д.А., Дроздов Г.В., Назаренко Л.П., Лебедев И.Н. Распространенность и спектр моногенных CNV у пациентов с нарушениями интеллектуального развития Медицинская генетика, 2021. Т. 20. № 10. С. 44-46 (год публикации - 2021).

5. Лебедев И.Н., Карамышева Т.В., Елисафенко Е.А., Макунин А.И., Жигалина Д.И., Лопаткина М.Е., Дроздов Г.В., Черемных А.Д., Торхова Н.Б., Сеитова Г.Н., Васильев С.А., Кашеварова А.А., Назаренко Л.П., Рубцов Н.Б. Prenatal Diagnosis of Small Supernumerary Marker Chromosome 10 by Array-Based Comparative Genomic Hybridization and Microdissected Chromosome Sequencing Biomedicines, Biomedicines. 2021 Aug 17;9(8):1030 (год публикации - 2021).

6. Левин-Краветц О., Кордонски А., Шустерман А., Бисвас С., Персо А., Элиас С., Лангут Я., Флорентин А.,... Борисова Е., Тарабыкин В., Купик М., Такер М., Ротин Д., Праг Г. Split Chloramphenicol Acetyl-Transferase Assay Reveals Self-Ubiquitylation-Dependent Regulation of UBE3B Journal of Molecular Biology, J Mol Biol. 2021 Vol. 433. Issue 23. Article Number 167276 (год публикации - 2021).

7. Толмачева Е.Н., Кашеварова А.А., Беляева Е.О., Салюкова О.А., Фонова Е.А., Лопаткина М.Е., Дроздов Г.В., Федотов Д.А., Лебедев И.Н. Клинические эффекты моногенной дупликации Xp11.4 с вовлечением гена TSPAN7 Медицинская генетика, 2021. Т.20. № 9. С. 45-47 (год публикации - 2021).

Аннотация результатов, полученных в 2022 году
В настоящем проекте проводится изучение эффектов мутаций нескольких генов, важных для формирования мозга, на мышиных моделях. Получены трансгенные мыши с инактивацией гена Ube2a, а также мыши с гиперэкспрессией Ube2a. Показано, что гиперэкспрессия приводит к задержке нейрональной дифференцировки, в то время как инактивация вызывает ранний выход из митотического цикла. В экспериментах по моделированию дефицита гена Ube3C получена инактивирующая генетическая конструкция, трансфецированная в ESC мыши линии C57Bl6. ESC были инъецированы в мышиные бластоцисты линии CD1 и получены химерные животные. Полученное от них потомство черного цвета является показателем успешного переноса инактивирующей мутации в половые клетки. Для изучения роли гена Ire1a в дифференцировке нейронов коры головного мозга создана линия мышей с нокаутом данного гена. Обнаружено, что инактивация Ire1a приводит к увеличению количества нейронов нижних слоев и уменьшению в верхних слоях, а при гиперэкспрессии Ire1a выявлен противоположный фенотип. Показано, что потеря Ire1α вызывает снижение скорости синтеза белка и приводит к остановке рибосом на РНК. Исследована роль мультиадапторного белка Noma-GAP в аксональном транспорте везикул. Показано, что Rab11 необходим для направленного дендритами везикулярного транспорта постсинаптических белков и для созревания дендритов. Везикулы, содержащие Rab11, накапливаются в соме NOMA-GAP-дефицитных нейронов. Потеря NOMA-GAP связана с более быстрым ретроградным движением везикул. Для изучения роли NeuroD1/2/6 в регулировании клеточной смерти в нейронах коры головного мозга использовался тройной нокаут NeuroD1/2/6 генов. Мы изучили активность каспазы 3 в процессе развития коры. Количество апоптотических клеток было увеличено в разной степени на всех исследованных стадиях. Продолжено создание экспериментальных линий мышей с перестройками на хромосомах 1 и 12 для изучения и моделирования эффектов эпигенетического сайленсинга хромосомных аберраций. Получение адресных хромосомных перестроек проводилось путем микроинъекций компонентов CRISPR/Сas9 в зиготы мышей. В экспериментах с использованием мРНК Cas9 и sgRNA к хромосоме 12 зафиксирована низкая рождаемость мышей - 10 мышей из 317 перенесенных зигот, что свидетельствует о токсичности компонентов CRISPR/Сas9 для зигот и эмбрионов ранних стадий развития. Анализ пробных экспериментов по созданию хромосомных перестроек на бластоцистах и ранних эмбрионах мыши показывает наличие целевых перестроек в хромосоме 12. После рождения аналогичным образом будут проанализированы мыши. Анализ мышей, родившихся в эксперименте по хромосоме 1, не обнаружил у них делеций и дупликаций, однако выявил одно животное с инверсией. Hi-C анализ линии фибробластов бессимптомного носителя sSMC(4) подтвердил кольцевую форму маркерной хромосомы, точно установил ее размеры и содержание 166 генов, что делает удивительным отсутствие клинических проявлений у ее носителя. Бисульфитное секвенирование ДНК выделило участок хромосомы 4 с резким повышением покрытия, координаты которого соответствуют sSMC. CpG островки были деметелированы как в клетках с sSMC, так и в контрольных линиях. Это позволило заключить, что в ИПСК, содержащих sSMC, уровень метилирования данного района незначительно отличается от изогенных линий ИПСК без sSMC, что отставляет открытым вопрос о механизмах дозовой компенсации при наличии в кариотипе дополнительного хромосомного материала. Завершены эксперименты по направленной дифференцировке ИПСК линий c дупликацией гена CNTN6 в кортикальные нейроны для оценки уровней экспрессии и эпигенетического статуса генов, локализованных вблизи хромосомных перестроек в локусе 3p26.3. Проведен Chip-seq анализ c использованием антител к гистону H3K9me3. Получены результаты секвенирования большей части библиотек, идет анализ данных. По две линии ИПСК от пациента и здорового носителя дупликации гена CNTN6 были дифференцированы в эмбриоидные тельца с дальнейшим анализом RNA-seq. Между всеми образцами пациента и здорового носителя дупликации было найдено 4645 дифференциально экспрессированных гена (ДЭГ). Проведен анализ обогащения. Создана клеточная модель для изучения роли гена UBE2A в развитии синдрома Насименто, куда входят изогенные ИПСК с нормальной экспрессией, с отсутствием экспрессии и с гиперэкспрессией гена UBE2A, а также ИПСК пациента. Во всех нокаутных клонах наблюдается достоверное снижение экспрессии гена UBE2A и отсутствие белка UBE2A. При помощи лентивирусной трансфекции получены клоны с индуцибельной гиперкспрессией гена UBE2A, подтвержденной при помощи количественной ОТ-ПЦР. Начата функциональная характеристика гена UBE2A. Мы показали, что ИПСК с нокаутом гена UBE2A и полученные из них фибробласт-подобные клетки быстрее прикрепляются к поверхности после пересева клеток. Более быстрая адгезия сопровождается повышенным числом фокальных контактов на единицу площади. При этом нокаут гена UBE2A не сказывается на скорости пролиферации ИПСК и нейрональных предшественников, и на скорости роста мозговых органоидов. Отмечено, что нокаутные ИПСК и ИПСК с гиперэкспрессией гена UBE2A отличаются по морфологии ядра и демонстрируют достоверное повышение размера ядра по сравнению с исходными клетками. Увеличение размера ядра не связано с изменениями в ядерной ламине, в распределении конститутивного гетерохроматина внутри ядра или различиями в распределении клеток по клеточному циклу. Эксперимент по оценке роли гена UBE2A в репарации радиационно-индуцированных двунитевых разрывов ДНК не обнаружил статистически значимой разницы между ИПСК с нокаутом гена UBE2A и ИПСК дикого типа. Клинически и генетически обследованы 110 пациентов с нарушениями развития нервной системы. Микроматричный анализ проведен для 83 пациентов. Патогенные/потенциально патогенные CNV были обнаружены у 37% пробандов, все перестройки полностью охарактеризованы. Полноэкзомное секвенирование проведено для 52 индивидов из 17 семей, у 15 пробандов обнаружены клинически значимые варианты. Выявленные значимые для формирования мозга варианты являются кандидатами на изучение на клеточных и животных моделях. Суммарно 13 пар ДНК плацентарных тканей абортусов (хорион и экстраэмбриональная мезодерма) и их родителей проанализировано на SNP-микрочипах. Обнаружено 130 CNV, все они полностью охарактеризованы. Выявлено 163 общих CNV для эмбриональной гибели и нарушений интеллектуального развития. Получено 15 первичных клеточных линий экстраэмбриональных фибробластов человека от погибших эмбрионов с нормальным кариотипом, линии криоконсервированы. Проведена отработка модификаций НИПТ для скрининга микроструктурных хромосомных нарушений на модельной системе - ДНК пациентов с микроструктурными перестройками и их матерей. Использовали две относительные концентрации образцов – 10% и 30%, для которых выявлено 22% и 50% перестроек соответственно. Концентрация плодной ДНК оказывает значительное влияние на возможность детекции CNV с помощью NGS. Для 9 пациентов с нарушениями интеллектуального развития и хромосомными перестройками был проведен Exo-C анализ. Сравнена эффективность различных биоинформационных инструментов для моделирования 3D-контактов хроматина. Разработана платформа 3DGenBench для предсказания изменений 3D архитектуры генома, вызванных хромосомными перестройками.

Публикации

1. - Сибирские ученые создали платформу для сравнения вычислительных моделей в области 3D-геномики Сайт Министерства науки и высшего образования РФ, 14 июня. Наука (год публикации - ).

2. - Сибирские ученые разработали программу для выявления сложных генетических болезней Федерал пресс, 20 июня 2022, 14:43 Редакция "Федерал пресс" (год публикации - ).

3. - Ни гена сомнений. Ученые разбираются с причинами когнитивных нарушений Поиск, Поиск, №40 (1738) 30 СЕНТЯБРЯ 2022 (год публикации - ).

4. - Научные коллективы разных стран объединились, чтобы усовершенствовать технологии диагностики редкой хромосомной аномалии Сайт Томского национального исследовательского медицинского центра РАН, 01.10.2022 (год публикации - ).

5. - «Замаскированная» мутация может привести к невынашиванию беременности Сайт Российского научного фонда, 6 июля, 2022 14:08 (год публикации - ).

6. Белокопытова П.С., Виесна Е., Чилински М., Ки И., Салари Х., ДиСтефано М., Эспосито А., Конте М., Киариелло А.М., Теиф В.Б., Плевжински Д., Жанг Б., Джост Д., Фишман В.С. 3DGenBench: a web-server to benchmark computational models for 3D Genomics Nucleic Acids Research, Nucleic Acids Research. 2022. V.50(W1):W4-W12 (год публикации - 2022).

7. Гридина М.М., Нурисламов А.Р., Минина Ю.М., Лопаткина М.Е., Дроздов Г.В., Васильев С.А., Минайчева Л.И., Беляева Е.О., Никитина Т.В., Кашеварова А.А., Лебедев И.Н., Карамышева Т.В., Рубцов Н.Б., Серов О.Л. Generation of iPS cell line (ICGi040-A) from skin fibroblasts of a patient with ring small supernumerary marker chromosome 4 Stem Cell Research, Stem Cell Research. 2022. V.61:102740. Epub 2022 Feb 28. (год публикации - 2022).

8. Гридина М.М., Степанчук Ю., Нуриддинов М., Можейко Е., Валеев Э., Назаренко Л.П., Лопаткина М.Е., Маркова Ж.Г., Яблонская М.И., Воинова В.Ю., Шилова Н.В., Лебедев И.Н., Фишман В.С. Exo-C is a new Hi-C based method for all type genome structural variants detection Bioinformatics of Genome Regulation and Structure/Systems Biology (BGRS/SB-2022) : The Thirteenth International Multiconference (04–08 July 2022, Novosibirsk, Russia); Abstracts, Bioinformatics of Genome Regulation and Structure/Systems Biology (BGRS/SB-2022) : The Thirteenth International Multiconference (04–08 July 2022, Novosibirsk, Russia); Abstracts. – Novosibirsk: ICG SB RAS, 2022. P. 411-412. (год публикации - 2022).

9. Дроздов Г.В., Кашеварова А.А., Никитина Т.В., Толмачева Е.Н., Саженова Е.А., Фонова Е.А., Лебедев И.Н. Структура CNV при привычном и спорадическом невынашивании беременности Актуальные вопросы фундаментальной и клинической медицины: сборник материалов конгресса молодых ученых, 26‒27 мая 2022 г., Актуальные вопросы фундаментальной и клинической медицины / под ред. В.А. Степанова, Е.Л. Чойнзонова, С.В. Попова, Н.А. Бохана, В.В. Жданова, М.И. Бессоновой. – Томск: Изд-во Том. ун-та, 2022. – С. 21-23 (год публикации - 2022).

10. Карамышева Т.В., Гайнер Т.А., Елисафенко Е.А., Трифонов В.А., Закирова Э.Г., Орищенко К.Е., Прохорович М.А., Лопаткина М.Е., Скрябин Н.А., Лебедев И.Н., Рубцов Н.Б. The precise breakpoint mapping in paracentric inversion 10q22.2q23.3 by comprehensive cytogenomic analysis, multicolor banding, and single-copy chromosome sequencing Biomedicines, Biomedicines 2022, 10, 3255. (год публикации - 2022).

11. Кашеварова А.А., Дроздов Г.В., Никитина Т.В., Толмачева Е.Н.. Фонова Е.А., Саженова Е.А., Лебедев И.Н. The structure of genome variations at CNV level differs in recurrent and sporadic pregnancy loss Human Reproduction, Human Reproduction. 2022;37(Suppl 1):i445. deac107.504 (год публикации - 2022).

12. Кашеварова А.А., Дроздов Г.В., Федотов Д.А., Лебедев И.Н. Плейотропные эффекты CNV в геноме человека Генетика, Генетика. 2022. Т. 58. № 10. С. 1124-1137 (год публикации - 2022).

13. Кашеварова А.А., Лопаткина М.Е., Беляева Е.О., Федотов Д.А., Дроздов Г.В., Назаренко Л.П., Лебедев И.Н. Identification of candidate genes of intellectual disability by single-gene deletions/amplifications mapping using chromosomal microarray analysis European Psychiatry, European Psychiatry. 2022. V. 65. Suppl S1. S382. (год публикации - 2022).

14. Кашеварова А.А., Лопаткина М.Е., Васильева О.Ю., Федотов Д.А., Фонова Е.А., Сивцев А.А., Зарубин А.А., Лебедев И.Н. Алгоритм молекулярной диагностики наследственной патологии, ассоциированной с моногенными CNV Медицинская генетика, Медицинская генетика. 2022. Т. 21. № 11. С. 36-39 (год публикации - 2022).

15. Лебедев И.Н., Дроздов Г.В., Никитина Т.В., Саженова Е.А., Толмачева Е.Н., Фонова Е.А., Кашеварова А.А. Confined placental mosaicism for inherited segmental aneuploidies in miscarriages traces karyotype self-correction events Human Reproduction, Human Reproduction. 2022;37(Suppl 1):i446. deac107.505 (год публикации - 2022).

16. Ли П., Дюпонт Б., Ху К., Крими М., Шен Ю., Лебедев И.Н., Лир Т. The Past, Present and Future for Constitutional Ring Chromosomes: A report of the International Consortium for Human Ring Chromosomes (ICHRC) Human Genetics and Genomics Advances, Human Genetics and Genomics Advances. 2022 Sep 10; 3(4): 100139 (год публикации - 2022).

17. Никитина Т.В., Лебедев И.Н. Stem Cell-Based Trophoblast Models to Unravel the Genetic Causes of Human Miscarriages Cells, Cells. 2022. V. 11(12):1923 (год публикации - 2022).

18. Сивцев А.А., Скрябин Н.А. Связанная с клеточной поверхностью внеклеточная ДНК как потенциальный материал для неинвазивного пренатального тестирования Актуальные вопросы фундаментальной и клинической медицины: сборник материалов конгресса молодых ученых, 26‒27 мая 2022 г., Актуальные вопросы фундаментальной и клинической медицины / под ред. В.А. Степанова, Е.Л. Чойнзонова, С.В. Попова, Н.А. Бохана, В.В. Жданова, М.И. Бессоновой. – Томск: Изд-во Том. ун-та, 2022. – С. 66-68 (год публикации - 2022).

19. Степанчук Я.К., Гридина М.М., Валеев Э.С., Сайфитдинова А.Ф., Шилова Н.В., Лебедев И.Н., Фишман В.С. Применение технологии Hi-C для поиска сбалансированных транслокаций в единичных клетках человека Актуальные вопросы фундаментальной и клинической медицины: сборник материалов конгресса молодых ученых, 26‒27 мая 2022 г., Актуальные вопросы фундаментальной и клинической медицины / под ред. В.А. Степанова, Е.Л. Чойнзонова, С.В. Попова, Н.А. Бохана, В.В. Жданова, М.И. Бессоновой. – Томск: Изд-во Том. ун-та, 2022. – С. 75-78 (год публикации - 2022).

20. Толмачева Е.Н., Фонова Е.А., Лебедев И.Н. Х-сцепленные CNV в патогенетике интеллектуальных расстройств Генетика, Генетика. 2022. Т. 58. № 10. С. 1138-1154 (год публикации - 2022).

21. Федотов Д.А., Кашеварова А.А., Лопаткина М.Е., Васильева О.Ю., Беляева Е.О., Назаренко Л.П., Лебедев И.Н. CNV is a genetic factor underlying risk of neurodevelopmental disorder in a child of a woman with miscarriage in anamnesis Human Reproduction, Human Reproduction. 2022;37(Suppl 1):i444. deac107.502 (год публикации - 2022).

22. Федотов Д.А., Кашеварова А.А., Лопаткина М.Е., Васильева О.Ю., Беляева Е.О., Назаренко Л.П., Лебедев И.Н. Плейотропный эффект CNV при нарушениях психомоторного развития и невынашивании беременности Актуальные вопросы фундаментальной и клинической медицины: сборник материалов конгресса молодых ученых, 26‒27 мая 2022 г., Актуальные вопросы фундаментальной и клинической медицины / под ред. В.А. Степанова, Е.Л. Чойнзонова, С.В. Попова, Н.А. Бохана, В.В. Жданова, М.И. Бессоновой. – Томск: Изд-во Том. ун-та, 2022. – С. 84-87 (год публикации - 2022).

23. Фонова Е.А., Толмачева Е.Н., Кашеварова А.А., Саженова Е.А., Никитина Т.В., Лопаткина М.Е., Васильева О.Ю., Зарубин А.А., Александрова Т.Н., Юрьев С.Ю., Скрябин Н.А., Степанов В.А., Лебедев И.Н. Skewed X-chromosome inactivation as a possible marker of X-linked CNV in women with pregnancy loss Cytogenetic and Genome Research, Cytogenet Genome Res. 2022. V. 162. N 3. P. 97-108 (год публикации - 2022).