Аннотация результатов, полученных в 2021 году
Описаны подходы к формированию субмикронных носителей типа ядро-оболочка, где апконверсионные частицы инкапсулированы в минеральное ядро карбоната кальция в полиморфной модификации ватерит, а оболочка может содержать фотодинамический краситель. Получены протоколы формирования комплекса CaCO3(BSA/NaYF4/BSA). Оболочка формировалась на основе комплекса бычьего сывороточного альбумина. Оболочки были нанесены методом последовательной адсорбции. Для контроля за нанесением слоев были измерены zeta потенциалы каждого из слоёв, а также дзета потенциал субмикронных частиц CaCO3. Размер полученных комплексов CaCO3(BSA/NaYF4/BSA) порядка 1 мкм. Средний размер пор ватерита варьируется в пределах 30-80 нм, что сопоставимо с размером внедренных частиц. Получен протокол синтеза апконверсионных наночастиц NaYF4:Er,Yb, а также их покрытие оболочкой SiO2. Сформулированы оптимальные условия отжига полученных частиц. Частицы имеют сферическую форму со средним диаметром 76.4 нм. При прогреве наночастицы частично спекаются, образуя агрегаты со средним размером 219 нм. Покрытие наночастиц оболочкой SiO2 предотвращает спекание, средний размер наночастиц 80 нм. Для сшивания фотодинамического красителя с оболочкой наночастиц нами проведено покрытие их поверхности сывороточным альбумином человека (HSA). Был использован способ, основанный на самопроизвольной адсорбции белков на поверхности наночастиц. Для стабилизации проводилось дополнительное сшивание молекул альбумина между собой в присутствии перекиси водорода. Метиленовый синий и натриевая соль флуоресцеина использовались в качестве красителей для присоединения красителя к оболочке. Наличие красителя на поверхности наночастиц определялось по спектрам поглощения. Исследовалась возможность возбуждения люминесценции красителя при облучении наночастиц светом с длиной волны 980 нм. При возбуждении наночастиц, покрытых метиленовым синим наблюдается люминесценция в области 670 нм. В ходе реализации проекта был проведен структурированный анализ современного состояния исследований цитотоксичности различных видов апконверсионных наночастиц не покрытых/покрытых разнообразными типами оболочек на здоровых и патологических клеточных культурах; для исследования биосовместимости синтезированных наночастиц был выполнен анализ цитотоксической и цитостатической активности наночастиц и контейнеров. В качестве контейнеров использовались синтезированные нами пористые частицы карбоната кальция. Тесты на жизнеспособность клеток при воздействии CaCO3, показали незначительное цитотоксическое действие на клетки дермальных фибробластов человека (HeLa). У клеток линии HeLa было обнаружено умеренное ингибирование жизнеспособности при инкубации 24 часа. Через 24 и 48 ч жизнеспособность клеток HeLa полностью восстанавливается. Было изучено влияние температуры отжига на цитотоксичность апконверсионных наночастиц на различных клеточных линиях. Исследовалась цитотоксичность частиц NaYF4: Yb3+, Er3+ неотожженных и отожженных при 550 oC на различных нормальных и раковых клеточных линиях мышей через 24, 48 и 72 ч инкубации. При анализе полученных данных, было установлено, что через 24 часа после воздействия, только у клеточной культуры макрофагов Raw264.7, как отожжённые, так и не отожжённые частицы вызывают снижение в 2 раза количества живых клеток и общего количества клеток в поле зрения, при всех изученных концентрациях. Через 48 часов после воздействия, только у клеточной культуры макрофагов Raw264.7 как отожжённые, так не отожжённые частицы вызывают снижение в 2 раза количества живых клеток и общего количества клеток в поле зрения при концентрациях 10 и 50 мкг на ячейку и снижение при концентрации 100 мг на ячейку количества живых клеток и общего количества клеток в поле зрения в 4.3 раза. Однако неотожжённые частицы при концентрации 100 мкг на ячейку приводили к снижению на 20% живых клеток и общего количества клеток культуры фибробластов L929. Кроме того, отожжённые частицы вызывали достоверное увеличение количества мертвых клеток на культуре макрофагов, а не отожжённые частицы на культуре фибробластов. Через 72 часа, не отожжённые частицы вызывают снижение более чем в 5 раз количества живых клеток и общего количества клеток в поле зрения при всех концентрациях у клеточной культуры макрофагов Raw264.7. и снижение показателей в 2 раза клеточной культуры фибробластов L929. Однако, отожжённые частицы в культуре макрофагов вызывали достоверное снижение в 2 раза количества живых клеток и общего количества клеток Проведена оценка цитотоксичности апконверсионных наночастиц, покрытых SiO2, на различных клеточных линиях. Частицы, покрытые оболочкой из кремния, оказывают дозозависимое цитотоксическое действие на все исследованные клеточные линии. Наиболее выраженное действие отмечается для клеточной линии Raw264.7. Вероятно, это связано с высокой фагоцитарной активностью макрофагов. Менее чувствительной клеточной линией была 4Т1. Статистически значимые различия в жизнеспособности клеток через 24 и 48 ч инкубации клеток с частицами наблюдались только для линии клеток макрофагов. Было проведено исследование влияния апконверсионных частиц, покрытых оболочкой SiO2, на клетки карциномы почки человека A498. Установлено, что через сутки при концентрации 2,5 мг/мл клетки сохраняют свое строение и форму, как и в контроле, однако в ряде клеток появляются апоптозные тельца и аутофагосомы. При концентрации 5 мг/мл клетки приобретают более округлую форму и отмечается признаки конденсации ядра (начальные признаки апоптоза) в 30% клетках. При концентрации 10 мг/мл ядра становятся по типу теней, а ряд ядер в клетках приобретаю форму «серпов», что является достоверным признаком апоптоза.

Аннотация результатов, полученных в 2022 году
Для повышения стабильности размеров наночастиц (порядка 80 нм) была несколько изменена методика синтеза. Синтез проводился гидротермальным способом, но, для повышения концентрации цитратных групп, пассивирующих рост поверхности наночастиц, предельно повышалась концентрация лимонной кислоты в растворе. Источником натрия служил цитрат натрия, при этом его количество рассчитывалось исходя из стехиометрии реакции. Присоединение фолиевой кислоты к альбумину, покрывающему наночастицы, проводилось при помощи стандартного EDC/NHS ковалентного связывания. Контроль наличия фолиевой кислоты на поверхности проводился методом ИК спектроскопии. Были получены частицы карбоната кальция с оболочками, содержащими АКНЧ, и ядрами, содержащими краситель Cy3 и Cy5. Введение наночастиц различного типа и проведение фотодинамической терапии вызывает изменения рефрактометрических свойств тканей. При этом для опухолевой ткани наблюдаются меньшие различия в величинах показателей преломления без ФДТ и после ФДТ. Меньшее значение показателя преломления опухолевой ткани после ФДТ может быть связано с тем, что ФДТ приводит частичному разрушению наночастиц и клеток опухолевой ткани, что способствует уменьшению её плотности и соответствует более низкому показателю преломления. Сравнительный анализ показателей преломления различных биотканей после введения различных доз наночастиц оного типа показал, что для тканей с введенной большей дозой характерен более высокий показатель преломления, чем для образцов тканей, взятых вблизи развития опухоли при введении наночастиц меньших доз. Полученный результат может быть связан с накоплением наночастиц в опухолевой ткани и тканях, её окружающих и даёт возможность предположить, что показатель преломления может быть использован для оценки накопления наночастиц в тканях. Изменение спектров КР опухолевой ткани и тканей, взятых в области развития опухоли показало, что наибольшая эффективность наблюдается после введения наночастиц NaYF4 с раствором альбумина (Alb) и красителем (Cyc3). При введении данного типа частиц наблюдается увеличение интенсивности КР тканей около области развития опухоли, а интенсивность КР опухолевой ткани уменьшается для всего измеренного спектра 400-1800 см-1, что может свидетельствовать о разрушении опухолевой ткани. При введении NaYF4 отожженных наблюдался эффект, что после ФДТ для всех близкорасположенных тканей не было изменений, а для опухолевой ткани отмечался рост интенсивности КР, что указывает на накопление наночастиц с ткани, не оказывающего разрушающего воздействия. Исходя из анализа спектров можно сделать выводы, что фотодинамическая терапия приводит к увеличению рассеяния в тканях, а использование апконверсионных наночастиц увеличивает рассеяние по сравнению с классическим фотосенсибилизатором. Полученный результат пилотного исследования может служить основанием для продолжения работы. Динамика просветления глицерином и пропиленгликолем зависит только от типа кожи (здоровая или патологическая). Наиболее вероятно, на данном этапе преобладающим механизмом просветления является диффузия воды из кожи, стимулированная осмотическим действием просветляющего агента. Скорость диффузии воды зависит, прежде всего, от структуры кожи, различающейся для нормы и патологии, что объясняет ее независимость от типа просветляющего агента. Было показано, что частицы АКНЧ и минеральные частицы в различных модификациях не токсичны для клеток линии рака молочной железы мыши 4T1. Были протестированы режимы работы лазера, варьируя мощность и время облучения клеток 4T1, к которым добавляли АКНЧ. В процессе анализа результатов было выяснено, что выживаемость сильно зависит от нахождения клеток на воздухе. То есть необходимо оптимизировать время нахождения клеток в планшете на воздухе. Для этого была составлена карта, где показано, как происходит эксперимент и какие уровни оптической плотности (которые напрямую связаны с выживаемостью) получаются в течение эксперимента с учетом повторностей. Таким образом, было найдено, что время нахождения клеток на воздухе не должно составлять более 15 минут. Результаты фототоксичности показали, что достаточно высокий уровень токсичности наблюдается на вторые сутки после облучения, что говорит о том, что отклик на облучение носит долговременный характер и не наблюдается в первые сутки после облучения. Фотоцитотоксичность для клеток 4T1 максимальны для частиц карбоната кальция в концентрациях 10,50,100 частиц на клетку. Добавление АКНЧ и белков, меченых красителями Cy 3 и Cy 5 не вносят существенных изменений в уровень фотоцитотоксичности, а в концентрации 100 частиц на клетку наоборот показывают более высокую выживаемость клеток.

Аннотация результатов, полученных в 2023 году
Визуализация контейнеров и различного типа частиц в биологических объектах проведена в различных пространственных масштабах. Для регистрации люминесцентных изображений использовался микроскоп AxioScopeA1. Регистрацию проводили с помощью высокоскоростной сверхчувствительной EMCCD-камеры iXonUltra 897. Для групп, с введением HSA+FA+Cy3 комплексов, в опухоли наблюдаемая концентрация ниже, чем в печени или селезенке. Максимальная концентрация комплекса – в печени, причем она уменьшается со временем исходя из разного времени забоя животных. Наличие фолиевой кислоты не показало эффекта накопления в опухоли при различных дозах введения и частицах с альбумином. Возможно, это связано с тем, что при наличии в оболочке фолиевой кислоты сильно уменьшается время циркуляции наночастиц в крови. Эритроциты эффективно захватывают наночастицы, покрытые альбумином (HSA). При отмывании эритроцитов и гемолизе в пробирке наблюдается осадок наночастиц. В капле крови вследствие высокой концентрации наночастиц сигнал больше, чем в мазке. Проведены измерения показателей преломления на 12 длинах волн видимого и ближнего ИК диапазонов (480-1550 нм) для биологических тканей в норме, после развития патологии (модельного рака печени), после введения наноконтейнеров 2 различных типов ((NaYF4 с раствором человеческого сывороточного альбумина (HSA) и NaYF4 с раствором человеческого сывороточного альбумина (HSA), фолиевой кислотой (FA) и красителем (Cy3))) и их изменения после фотодинамического воздействия. Проведен анализ полученных дисперсионных зависимостей и получены коэффициенты для формулы Зельмейера, позволяющие восстановить значение показателя преломления в диапазоне 480-1550 нм. Выполнены экспериментальные измерения спектров комбинационного рассеяния ex vivo для биологических тканей после развития патологии (модельного рака печени), после введения наноконтейнеров 2 различных типов ((NaYF4 с раствором человеческого сывороточного альбумина (HSA) и NaYF4 с раствором человеческого сывороточного альбумина (HSA), фолиевой кислотой (FA) и красителем (Cy3))) и их изменения после фотодинамического воздействия. Проведен качественный анализ спектров КР на наличие характерных особенностей, позволяющих оценить результат введения наночастиц различного типа, а также охарактеризовать изменения, происходящие в ткани после воздействия ФДТ. Выполнено исследование по влиянию вводимой дозы наночаcтиц на спектр КР тканей модельной опухоли и тканей, расположенных в области её развития. Проведены экспериментальные измерения спектров полного и коллимированного пропускания, а также диффузного отражения образцов биологических тканей ex vivo лабораторных крыс, разделенных на 6 групп. Определены их оптические характеристики, такие как коэффициент поглощения, транспортный коэффициент рассеяния и фактор анизотропии. Выполнены исследования по оценке токсичности носителей для внутренних органов при их введении лабораторным животным, а также было проведено установление зависимостей между кратностью введения носителей (доза) и степенью повреждения перевитой опухоли лабораторных животных после ФДТ. Влияние наночастиц и ФДТ на динамику развития перевитой опухоли лабораторных животных оценено как при проведении морфологических исследований с помощью окраски срезов органов и опухоли гематоксилин-эозином, так и с применением ультразвуковых технологий.