КАРТОЧКА ПРОЕКТА,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

 

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ


Номер 21-73-00097

НазваниеКерамические наночастицы и трансплантация микрофлоры для контроля токсичности микропластика на модели свободноживущих нематод (Caenorhabditis elegans и Turbatix aceti)

РуководительФахруллина Гульнур Ильдаровна, Кандидат биологических наук

Организация финансирования, регионфедеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Казанский (Приволжский) федеральный университет", Республика Татарстан (Татарстан)

Срок выполнения при поддержке РНФ 07.2021 - 06.2023 

КонкурсКонкурс 2021 года «Проведение инициативных исследований молодыми учеными» Президентской программы исследовательских проектов, реализуемых ведущими учеными, в том числе молодыми учеными

Область знания, основной код классификатора 03 - Химия и науки о материалах, 03-601 - Химия новых неорганических функциональных и наноразмерных материалов

Ключевые словаалюмосиликаты; галлуазит; каолинит; микропластик; трансплантация микрофлоры; Caenorhabditis elegans; Alcanivorax borkumensis; токсичность; микроскопия; искусственный интеллект; машинное обучение

Код ГРНТИ31.15.37


 

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ


Аннотация
Полимерные материалы, попадая в виде отходов в окружающую среду, в процессе измельчения превращаются в нано- и микроразмерные частицы различного химического состава и морфологии, получившие собирательное название «микропластик». Несмотря на попытки сократить производство полимерных отходов, приходится признать, что в настоящее время загрязнение микропластиком повсеместно, и необходим поиск путей детоксикации полимерных нано- и микрочастиц при проникновении в организм человека и животных. Предлагаемый проект направлен на разработку научных основ снижения токсических эффектов микропластика с использованием керамических наночастиц в качестве энтеросорбентов и трансплантированной экзогенной микрофлоры. В рамках проекта планируется определение корреляции токсичности микропластика (на примере полистирола и полиметакрилата) с биораспределением в тканях свободноживущих нематод (Caenorhabditis elegans, Turbatrix aceti), а также с составом кишечной микрофлоры. Будет разработана методология высокопроизводительного анализа и классификации частиц микропластика в тканях нематод с использованием алгоритмов искусственного интеллекта и машинного обучения. Микропластик представляет собой полученные в процессе химического синтеза частицы размером менее 5 мм, (твердые синтетические полимеры с размерами частиц от 1 мкм до 5 мм). Частицы размером менее 1 мкм относят к нанопластику. Присутствие микропластика обнаружено в мировом океане, включая пляжи, пресноводных водоемах, арктических льдах, почве, воздухе и других средах обитания. Особенно опасным является накопление микрочастиц в живых организмах, являющихся первым звеном в пищевой цепи. Нанопластик и микропластик представляют собой частицы различного химического состава, в первую очередь выделяют полиэтилен, полипропилен, полиэтилентерефталат, полистирол и поливинилхлорид, а также их разнообразные смеси и обогащенные различными присадками (пигменты, неорганические частицы и т.п.) композиты. Коллоидные частицы микропластика практически не разрушаются на протяжении многих лет, поступая в организм, микропластик может накапливаться в органах и тканях, что затрагивает как животных, так и человека. Присутствие частиц микропластика в организме связано с потенциальным негативным воздействием, которое, на сегодняшний день, плохо изучено, однако, учитывая рост пластиковых отходов и увеличение путей поступления микропластика в организм человека, как по пищевой цепи (при поедании животных, которые могут проглатывать частицы пластика), так и непосредственно с водой, пищевой солью и даже при дыхании), возникает очевидная необходимость в разработке способов снижения токсических эффектов микропластика. В настоящее время человечеству приходится существовать в окружающей среде, подверженной массивному загрязнению микропластиком, следовательно, необходимо не только искать новые способы определения уровня загрязнения, но и разрабатывать методы защиты, предотвращения негативного воздействия полимерных микро- и наночастиц на организм. Однако, на сегодняшний день, неизвестны целенаправленные работы по детоксикации микро- и нанопластика с использованием адсорбентов и\или микроорганизмов. Таким образом, предлагаемый проект будет в числе пионерских исследований по созданию препаратов для снижения токсичности, вызываемой частицами микропластика. Суть проекта заключается в использовании неорганических керамических микрочастиц (каолинит и галлуазит) в качестве энтеросорбента, позволяющего минимизировать высвобождение активных форм кислорода, которые рассматриваются как один из основных факторов токсичности микропластика. Ранее, нами было показано, что глинистые наночастицы способны к ремедиации окислительного стресса. В предлагаемом проекте в качестве модельного объекта для экспериментов in vivo будут использованы свободноживущие (непаразитические) нематоды, основным источником питания которых являются бактерии, так, нематоды Caenorhabditis elegans в лабораторных условиях поедают клетки кишечной палочки (Escherichia coli). Ранее нами было показано, что трансплантация экзогенной и во многом экзотической микробиоты (морские бактерии-нефтедеструкторы Alcanivorax borkumensis) в кишечник C. elegans приводит к снижению окислительного стресса в присутствии агрессивной среды (сырая нефть). В предлагаемом проекте будет разработана новая формуляция на основе неорганических наночастиц природного происхождения и галофильных бактерий, которая позволит нивелировать токсический эффект, вызываемый повышенными концентрациями микроразмерного пластика. В качестве модельных полимерных микрочастиц будут использованы сферические частицы полистирола и полиметакрилата.

Ожидаемые результаты
Будет разработана методология идентификации частиц микропластика и алюмосиликатов в тканях нематод с использованием алгоритмов машинного обучения. Будет проведена пробоподготовка и сравнительная характеристика физико-химических параметров исследуемых частиц микропластика и алюмосиликатов. Будет осуществлена визуализация материалов с использованием различных техник микроскопии, включая микроскопию темного поля с гиперспектральной визуализацией. Будут изучены пути проникновения полимерных нано- и микрочастиц в ткани и органы нематод C. elegans и T. aceti, определены параметры токсического воздействия полистирола и полиметакрилата в отношении нематод. Будет предложен протокол получения и предварительной обработки унифицированных наборов данных частиц в растворе и в тканях нематод. Будут подобраны оптимальные параметры для сегментации данных и обучения моделей нейронных сетей, на базе различных архитектур, включая ResNet, DenseNet и EfficientNet. Будет проведен сравнительный анализ эффективности построенных интеллектуальных систем для идентификации частиц в тканях C. elegans и T. aceti с использованием результатов классификации гиперспектральных данных посредством алгоритма Spectral Angle Mapping в качестве эталона. Керамические наночастицы будут использованы в качестве энтеросорбентов для снижения токсичности микропластика в отношении нематод C. elegans и T. aceti, как без параллельного применения микроорганизмов, так и в присутствии бактерий A. borkumensis. Будут опробованы два подхода: 1) одновременное внесение в среду совместно с источником питания (бактерии Escherichia coli OP50) как микропластика, так и нанокерамики и 2) предварительное введение микропластика в организм нематод с последующим использованием нанокерамики. Трансплантация микрофлоры, заключающаяся в формировании монокультурных биопленок бактерии A. borkumensis в качестве симбиотического микроорганизма нематод C. elegans и T. aceti, приведет к снижению токсичности микропластика в зависимости от концентрации и времени введения бактерий. Завершающим этапом в реализации проекта станет формирование композитных частиц, состоящих из наноглин и бактерий A. borkumensis, которые будут введены в организм нематод одновременно, что позволит изучить синергетические эффекты по снижению токсичности микропластика.


 

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ


Аннотация результатов, полученных в 2021 году
В рамках реализации первого этапа проекта осуществлена физико-химическая характеристика частиц микропластика с различным диаметром и химическим составом и наноглин природного происхождения. Галлуазит и каолинит имеют размеры частиц в диапазоне 400-500 нм и высокий уровень полидисперсности, представляя собой гетерогенную систему с большей вариабельностью в размерах и морфологии относительно частиц микропластика. Морфологические особенности коллоидных суспензий частиц нано- и микропластика, а также наноглин изучены с использованием метода корреляционной микроскопии. Микроанализ размера и морфологии материалов согласуется с данными метода лазерной доплеровской анемометрии. Для исследования оптических свойств материалов применялся недеструктивный метод спектральной диагностики, показавший зависимость интенсивности отражения света от диаметра частиц. Разработан и реализован новый подход экспресс-идентификации микропластиковых частиц с использованием микроскопии темного поля и алгоритмов глубокого обучения. Предложенный метод был впервые использован для изучения распределения микропластических частиц в фибробластах кожи человека после инкубации с различными смесями частиц без предварительного отделения этих частиц друг от друга. Эффективность метода была сопоставлена с методом картирования по спектральному углу, позволяющим идентифицировать частицы по их уникальному профилю отраженного света. Результаты исследования показали, что использование моделей глубокого обучения значительно повышает скорость определения частиц, сохраняя сопоставимую с гиперспектральным анализом точность идентификации. Предложен метод количественной оценки микропластиковых частиц в биологических организмах, который позволяет идентифицировать материалы в сложных системах биологических объектов (клетках, тканях, организмах). Автоматизированный анализ двух пар изображений, полученных при длительной и короткой экспозиции, позволяет получить информацию о границах биологических сред, сохраняя условия освещения для корректной классификации частиц. Это позволяет оценить распределение наноматериалов с учетом не только их концентрации, но и расположения в каждой клетке или органе. Также, разработан метод использования одномерной сверточной нейронной сети в виде этапа перекрестной проверки традиционных методов картирования. Модель была обучена в рамках алгоритма контролируемого обучения с использованием спектров 100 и 200 нм частиц в качестве входных данных. В качестве модельного объекта для экспериментальных исследований по токсичности нанопластика был выбран дикий тип свободноживущей почвенной нематоды Caenorhabditis elegans и уксусная угрица Turbatrix aceti. Определена токсичность наночастиц полистирола в широком диапазоне релевантных концентраций. Установлено, что наночастицы полистирола (500 и 100 нм) в диапазоне изученных концентраций не оказывают отрицательного воздействия на выживаемость нематод C. elegans, тогда как наночастицы (100 нм) полистирола в высоких концентрациях (0,5 и 1 мг/мл) обуславливали снижение средней продолжительность жизни нематод (15-20%). Низкие концентрации наночастиц 100 нм (0,05 мг/мл) не оказывали влияния на продолжительность жизни нематод C. еlegans. В случае нематод T. аceti наночастицы 500 и 1000 нм также не оказывали отрицательного воздействия, а частицы 100 нм при максимально высокой концентрации (1 мг/мл) несколько снизили среднюю продолжительность жизни (10%). Можно предположить, что нематоды T. аceti обладают повышенной устойчивостью к микропластику, что связано с особенностями их естественной среды обитания. Для определения устойчивости к окислительному стрессу нематод C. elegans и T. аceti под воздействием наночастиц пластика были изучены изменения во внутриклеточном уровне липофусцина и концентрации активных форм кислорода (АФК) у взрослых нематод. Полученные данные указывают на то, что наночастицы полистирола в высоких концентрациях (1мг/мл) усиливают образование окислительных повреждений в клетках червей и приводят к преждевременному старению организма. У нематод C. elegans наблюдали повышение содержания внутриклеточных активных форм кислорода по сравнению с нематодами T. аceti при одинаковых концентрациях наночастиц. Так как увеличение содержания АФК приводит к окислительному стрессу, обуславливая ускоренную гибель нематод, очевидно, что нематоды T. аceti более устойчивы к воздействию нанопластика, а нематоды C. elegans сильнее подвержены окислительному стрессу. Анализ поведенческих реакций на основании оценки индекса хемотаксиса (ИХ) показал, что нематоды C. elegans и T. аceti активно предпочитали чистые бактерии (ИХ=-0,67±0,13), однако не наблюдалось реакции избегания бактерий, смешанных с наночастицами, в ом числе при высоких концентрациях (1 мг/мл). При проведении поведенческих тестов не выявлено значимых отличий в поведении нематод в зависимости от концентрации нанопластика. Нематоды демонстрировали нормальное пищевое поведением по отношению бактерий E.coli смешанных с наночастицами пластика. Для определения механизмов токсического влияния нанопластика изучено развитие и репродуктивность нематод. Наночастицы пластика 100 нм обуславливали уменьшение длины тела нематод C. elegans только при высоких концентрациях (1 мг/ч), более низкие концентрации незначительно снижали размер тела нематод. Наночастицы полистирола с диаметром 500 и 100 нм не влияли на рост и размножение нематод, тогда как частицы 100 нм оказали слабо выраженное токсическое действие. Обработка нематод наночастицами полистирола в течение 72 часов (со стадии L1) способствовала небольшому уменьшению репродуктивной способности как при концентрации 0,5 мг/ч, так и при 1 мг/ч. Однако, количество яиц у червей, инкубированных с наночастицами в концентрации 0,5 мг/ч, было на 2-3 яйца меньше по сравнению с нематодами, выращенными при концентрации 1 мг/ч. Полученные данные свидетельствуют о том, что частицы полистирола и полиметакрилата проникают в кишечник нематод, распределяясь по всей длине кишечника, при этом частицы не локализованы в определенных областях кишечных стенок. Локализация частиц в прилегающих тканях кишечника была выполнена с помощью гиперспектрального анализа в видимом и ближнем инфракрасном диапазоне длин волн в режиме темнопольной микроскопии большого увеличения (объективы 60х и 100х). С использованием наномеханической атомно-силовой микроскопии осуществлен анализ проникновения нано- и микросфер полистирола в цитоплазму фибробластов кожи человека. В режиме визуализации силовых кривых PeakForce Tapping определены механические характеристики (модуль Юнга, адгезия и деформация), позволяющие установить локализацию нано- и микрочастиц полистирола в биологических объектах. Определение наночастиц (100 нм; 200 нм), проникающих в цитоплазму фибробластов с помощью атомно-силовой микроскопии затруднено в связи с линейными размерами исследуемых объектов. Микросферы (500 нм, 1 мкм) были визуализированы с помощью изображений топографии поверхности, адгезии и деформации. Изучено влияние частиц микропластика в различной концентрации на жизнеспособность фибробластов, пролиферацию клеток оценивали с помощью МТТ-анализа. После воздействия нано- и микрочастиц полистирола в концентрациях 1 и 5 мкг/мл в течение 24 часов значительной цитотоксичности (p>0,05) не наблюдалось. При 10 мкг/мл частицы с диаметром 200 и 1000 нм обуславливали снижение жизнеспособности клеток до 75,2±11,7% и 79,1±13,1% соответственно, частицы с диаметром 100 нм стимулировали жизнеспособность клеток до 121,5±6,9% в концентрации 10 мкг/мл. https://www.eurekalert.org/news-releases/935663 https://media.kpfu.ru/news/v-kfu-razrabotan-metod-identifikacii-mikroplastika-v-kletkakh-cheloveka https://scientificrussia.ru/articles/ucenye-kfu-sozdali-avtomaticeskij-metod-identifikacii-mikroplastika-v-celoveke https://rt-online.ru/uchenye-kfu-razrabotali-metod-opredeleniya-mikroplastika-v-zhivyh-organizmah/

 

Публикации

1. - В КФУ разработан метод идентификации микропластика в клетках человека Медиа-Портал КФУ, - (год публикации - ).

2. - В КФУ разработан метод идентификации микропластика в клетках человека Научная Россия, - (год публикации - ).

3. - Ученые КФУ разработали метод определения микропластика в живых организмах Газета Республика Татарстан, - (год публикации - ).

4. - Deep learning algorithms assist in identifying microplastics in human body Eurekalert, - (год публикации - ).

5. - Разработан метод идентификации микропластика в клетках человека МАРЧМОНТ Капитал Партнерс, - (год публикации - ).

6. - Which AFM Substrates Are Used to Image Small Biological Objects? AZO Materials, - (год публикации - ).

7. - How Atomic Force Microscopy is Accelerating Microplastics Toxicity Research AZO Optics, - (год публикации - ).

8. - Deep learning algorithms assist in identifying microplastics in human body Institute of Materials, Minerals & Mining, - (год публикации - ).

9. - New technique for label-free identification of microplastics in human cells AZO Life Sciences, - (год публикации - ).

10. - Identification of Microplastics in the Human Body Assisted by Deep Learning Technology Networks, - (год публикации - ).

11. - Deep learning algorithms assist in identifying microplastics in human body Science Mag, - (год публикации - ).

12. Ахатова Ф.С., Ишмухаметов И.Р., Фахруллина Г.И., Фахруллин Р.Ф. Nanomechanical Atomic Force Microscopy to Probe Cellular Microplastics Uptake and Distribution International Journal of Molecular Sciences, 23(2), 806 (год публикации - 2022).

13. Ишмухаметов И.Р., Нигаматзянова Л.Р., Фахруллина Г.И., Фахруллин Р.Ф. Label-free identification of microplastics in human cells: dark-field microscopy and deep learning study Analytical and Bioanalytical Chemistry, https://doi.org/10.1007/s00216-021-03749-y (год публикации - 2021).

14. Ишмухаметов И.Р., Фахруллин Р.Ф., Фахруллина Г.И. Классификация частиц микропластика с применением микроскопии темного поля и остаточной нейронной сети Тезисы IX молодежной конференции ИОХ РАН, Стр. 160 (год публикации - 2021).

15. Ишмухаметов И.Р., Фахруллина Г.И., Фахруллин Р.Ф. Imaging of nano- and microplastics in vitro and in vivo with hyperspectral dark-field microscopy Abstracts, 2022 Global Nanobiotechnology Conference, p. 28 (год публикации - 2022).