Аннотация результатов, полученных в 2021 году
В рамках реализации первого этапа проекта осуществлена физико-химическая характеристика частиц микропластика с различным диаметром и химическим составом и наноглин природного происхождения. Галлуазит и каолинит имеют размеры частиц в диапазоне 400-500 нм и высокий уровень полидисперсности, представляя собой гетерогенную систему с большей вариабельностью в размерах и морфологии относительно частиц микропластика. Морфологические особенности коллоидных суспензий частиц нано- и микропластика, а также наноглин изучены с использованием метода корреляционной микроскопии. Микроанализ размера и морфологии материалов согласуется с данными метода лазерной доплеровской анемометрии. Для исследования оптических свойств материалов применялся недеструктивный метод спектральной диагностики, показавший зависимость интенсивности отражения света от диаметра частиц. Разработан и реализован новый подход экспресс-идентификации микропластиковых частиц с использованием микроскопии темного поля и алгоритмов глубокого обучения. Предложенный метод был впервые использован для изучения распределения микропластических частиц в фибробластах кожи человека после инкубации с различными смесями частиц без предварительного отделения этих частиц друг от друга. Эффективность метода была сопоставлена с методом картирования по спектральному углу, позволяющим идентифицировать частицы по их уникальному профилю отраженного света. Результаты исследования показали, что использование моделей глубокого обучения значительно повышает скорость определения частиц, сохраняя сопоставимую с гиперспектральным анализом точность идентификации. Предложен метод количественной оценки микропластиковых частиц в биологических организмах, который позволяет идентифицировать материалы в сложных системах биологических объектов (клетках, тканях, организмах). Автоматизированный анализ двух пар изображений, полученных при длительной и короткой экспозиции, позволяет получить информацию о границах биологических сред, сохраняя условия освещения для корректной классификации частиц. Это позволяет оценить распределение наноматериалов с учетом не только их концентрации, но и расположения в каждой клетке или органе. Также, разработан метод использования одномерной сверточной нейронной сети в виде этапа перекрестной проверки традиционных методов картирования. Модель была обучена в рамках алгоритма контролируемого обучения с использованием спектров 100 и 200 нм частиц в качестве входных данных. В качестве модельного объекта для экспериментальных исследований по токсичности нанопластика был выбран дикий тип свободноживущей почвенной нематоды Caenorhabditis elegans и уксусная угрица Turbatrix aceti. Определена токсичность наночастиц полистирола в широком диапазоне релевантных концентраций. Установлено, что наночастицы полистирола (500 и 100 нм) в диапазоне изученных концентраций не оказывают отрицательного воздействия на выживаемость нематод C. elegans, тогда как наночастицы (100 нм) полистирола в высоких концентрациях (0,5 и 1 мг/мл) обуславливали снижение средней продолжительность жизни нематод (15-20%). Низкие концентрации наночастиц 100 нм (0,05 мг/мл) не оказывали влияния на продолжительность жизни нематод C. еlegans. В случае нематод T. аceti наночастицы 500 и 1000 нм также не оказывали отрицательного воздействия, а частицы 100 нм при максимально высокой концентрации (1 мг/мл) несколько снизили среднюю продолжительность жизни (10%). Можно предположить, что нематоды T. аceti обладают повышенной устойчивостью к микропластику, что связано с особенностями их естественной среды обитания. Для определения устойчивости к окислительному стрессу нематод C. elegans и T. аceti под воздействием наночастиц пластика были изучены изменения во внутриклеточном уровне липофусцина и концентрации активных форм кислорода (АФК) у взрослых нематод. Полученные данные указывают на то, что наночастицы полистирола в высоких концентрациях (1мг/мл) усиливают образование окислительных повреждений в клетках червей и приводят к преждевременному старению организма. У нематод C. elegans наблюдали повышение содержания внутриклеточных активных форм кислорода по сравнению с нематодами T. аceti при одинаковых концентрациях наночастиц. Так как увеличение содержания АФК приводит к окислительному стрессу, обуславливая ускоренную гибель нематод, очевидно, что нематоды T. аceti более устойчивы к воздействию нанопластика, а нематоды C. elegans сильнее подвержены окислительному стрессу. Анализ поведенческих реакций на основании оценки индекса хемотаксиса (ИХ) показал, что нематоды C. elegans и T. аceti активно предпочитали чистые бактерии (ИХ=-0,67±0,13), однако не наблюдалось реакции избегания бактерий, смешанных с наночастицами, в ом числе при высоких концентрациях (1 мг/мл). При проведении поведенческих тестов не выявлено значимых отличий в поведении нематод в зависимости от концентрации нанопластика. Нематоды демонстрировали нормальное пищевое поведением по отношению бактерий E.coli смешанных с наночастицами пластика. Для определения механизмов токсического влияния нанопластика изучено развитие и репродуктивность нематод. Наночастицы пластика 100 нм обуславливали уменьшение длины тела нематод C. elegans только при высоких концентрациях (1 мг/ч), более низкие концентрации незначительно снижали размер тела нематод. Наночастицы полистирола с диаметром 500 и 100 нм не влияли на рост и размножение нематод, тогда как частицы 100 нм оказали слабо выраженное токсическое действие. Обработка нематод наночастицами полистирола в течение 72 часов (со стадии L1) способствовала небольшому уменьшению репродуктивной способности как при концентрации 0,5 мг/ч, так и при 1 мг/ч. Однако, количество яиц у червей, инкубированных с наночастицами в концентрации 0,5 мг/ч, было на 2-3 яйца меньше по сравнению с нематодами, выращенными при концентрации 1 мг/ч. Полученные данные свидетельствуют о том, что частицы полистирола и полиметакрилата проникают в кишечник нематод, распределяясь по всей длине кишечника, при этом частицы не локализованы в определенных областях кишечных стенок. Локализация частиц в прилегающих тканях кишечника была выполнена с помощью гиперспектрального анализа в видимом и ближнем инфракрасном диапазоне длин волн в режиме темнопольной микроскопии большого увеличения (объективы 60х и 100х). С использованием наномеханической атомно-силовой микроскопии осуществлен анализ проникновения нано- и микросфер полистирола в цитоплазму фибробластов кожи человека. В режиме визуализации силовых кривых PeakForce Tapping определены механические характеристики (модуль Юнга, адгезия и деформация), позволяющие установить локализацию нано- и микрочастиц полистирола в биологических объектах. Определение наночастиц (100 нм; 200 нм), проникающих в цитоплазму фибробластов с помощью атомно-силовой микроскопии затруднено в связи с линейными размерами исследуемых объектов. Микросферы (500 нм, 1 мкм) были визуализированы с помощью изображений топографии поверхности, адгезии и деформации. Изучено влияние частиц микропластика в различной концентрации на жизнеспособность фибробластов, пролиферацию клеток оценивали с помощью МТТ-анализа. После воздействия нано- и микрочастиц полистирола в концентрациях 1 и 5 мкг/мл в течение 24 часов значительной цитотоксичности (p>0,05) не наблюдалось. При 10 мкг/мл частицы с диаметром 200 и 1000 нм обуславливали снижение жизнеспособности клеток до 75,2±11,7% и 79,1±13,1% соответственно, частицы с диаметром 100 нм стимулировали жизнеспособность клеток до 121,5±6,9% в концентрации 10 мкг/мл. https://www.eurekalert.org/news-releases/935663 https://media.kpfu.ru/news/v-kfu-razrabotan-metod-identifikacii-mikroplastika-v-kletkakh-cheloveka https://scientificrussia.ru/articles/ucenye-kfu-sozdali-avtomaticeskij-metod-identifikacii-mikroplastika-v-celoveke https://rt-online.ru/uchenye-kfu-razrabotali-metod-opredeleniya-mikroplastika-v-zhivyh-organizmah/

Аннотация результатов, полученных в 2022 году
В рамках реализации второго этапа проекта с помощью гиперспектральной визуализации и химического картирования определены участки максимальной концентрации частиц микропластика в кишечнике нематод C. elegans и T. aceti. Установлено, что независимо от химического состава частиц и размера наблюдается концентрирование частиц в просвете кишечника, при этом проникновения в близлежащие участки тканей не наблюдалось. Получены данные о гиперспектральной визуализации и идентификации частиц полиэтилена в нематодах. Частицы микропластика могут быть эффективно визуализированы в нематодах, использование алгоритмов картирования позволяет избежать ложноположительных результатов при визуализации. Применение классического метода флуоресцентной визуализации (с предварительной окраской частиц микропластика липофильными флуоресцентными красителями) обуславливала ложноположительные результаты (окрашивание гранул липофусцина в нематодах), что вызвано диффузией красителя с поверхности полимерных частиц. Токсичность микропластика может быть также обусловлена динамическим поведением частиц, вызывающим раздражение кишечника, что было визуализировано с помощью темнопольной видеомикроскопии в реальном времени. Трансплантация нетипичной микрофлоры (бактерии A. borkumensis) в качестве симбиотического микроорганизма в нематодах C. elegans и T. aceti обуславливала снижение токсического эффекта микропластика. Установлено, что частицы каолина обладают наибольшей способностью связывать полимерные наночастицы, что обусловлено большей площадью поверхности. Тем не менее, галлуазит также способен к связыванию полистирола, полиэтилена и полипропилена. С помощью темнопольной микроскопии определен механизм электростатического взаимодействия керамических частиц с микропластиком. Использование алюмосиликатов стало предметом интенсивных исследований благодаря их уникальным свойствам и потенциалу применения в биомедицинских областях. Идентификация и характеристика различных типов алюмосиликатов в многокомпонентных биологических средах остается сложной задачей ввиду неоднородности подобных материалов. Разработана сквозная система анализа гиперспектральных изображений на основе алгоритмов машинного обучения для идентификации алюмосиликатных частиц в биологических образцах. Осуществлен анализ цитотоксичности трех типов частиц (галлуазита, каолинита и сепиолита) с использованием клеток аденокарциномы легких человека A549. Установлено, что частицы галлуазита и каолинита не проявляют цитотоксичности в диапазоне исследуемых концентраций, в то время как частицы сепиолита при концентрациях более 1 мкг/мл значимо подавляют жизнеспособность клеток. Так, при концентрации сепиолита, равной 10 мкг/мл, жизнеспособность клеток была снижена до 71,8 ± 1,7%. Увеличение концентрации до 100 мкг/мл снизило активность клеток до 56,4 ± 1,4%. Микроскопический анализ не выявил явных морфологических изменений в клетках, а визуально различимые частицы присутствовали во всех образцах. Для поиска оптимального способа классификации частиц было протестировано несколько подходов на основе глубокого обучения, включая одномерные сверточные нейронные сети на основе VGG16 и ResNet для пиксельного отображения всей области изображения без учета класса соседних пикселей. Разработана методология сбора, сегментации и классификации гиперспектральных данных с использованием одномерной остаточной нейронной сети (ResNet) для определения алюмосиликатов в биологических средах. Предварительное тестирование было проведено посредством классификации частиц галлуазита и каолинита в растворе, что позволило контролировать содержание алюмосиликатов в образце и определить точность идентификации. Обученная нейронная сеть успешно использовалась для классификации алюмосиликатов на модели культуры клеток. Результаты сравнения показали, что модель остаточной нейронной сети превосходит метод спектрального углового отображения по точности и эффективности классификации суспендированных частиц галлуазита и каолинита. Среднее значение F-меры, метрики производительности модели, составило 0,77 (точность – 88%) у остаточной нейронной сети, и 0,57 (точность - 77%) при использовании метода спектрального углового отображения. Для оценки точности классификации модели в биологических образцах нейронная сеть была применена к микрофотографиям клеток млекопитающих, содержащих частицы галлуазита и каолинита. Общая точность классификации алюмосиликатов в клетках составила 85% (F-мера – 0,7), что позволит использовать разработанную в проекте остаточную нейронную сеть для эффективного анализа гиперспектральных изображений в биологических и экологических приложениях.