Аннотация результатов, полученных в 2021 году
В рамках выполняемого проекта были решены задачи с использованием междисциплинарного подхода. Это оказалось возможным благодаря наличию в университете ИТМО научных групп, коллаборация с которыми позволила достичь планируемых результатов. В течение срока выполнения проекта было продолжено сотрудничество с партнерами из Первого московского медицинского университета им. Сеченова, в частности исследовательской группой профессора Скального Анатолия Викторовича. Общий подход в исследовании процессов, происходящих в среде макромолекул позволил совместно изучать изменение микроэлементов в биоподобных системах. Взаимодействие с партнером Университета ИТМО - Институтом полиомиелита и вирусных энцефалитов имени М. П. Чумакова, а именно научной группой проф., академика РАН Алексея Михайлович Егорова, позволило продолжить исследования в области иммуноферментного анализа на основе предлагаемых подходов для количественного анализа цельных вирусных частиц. Общий подход, используемый в создании биораспознающих трансдьюсеров представлен на рисунке 1. Финансовая поддержка фонда РНФ в рамках текущего проекта (21-73-10185 Изучение взаимодействий полиэлектролитных комплексов и белковых структур для создания высокочувствительных сенсоров вирусных заболеваний) позволила создать в научно-образовательном центре Инфохимии (директор – проф. Екатерина Владимировна Скорб), Университета ИТМО группу Хемометрики во главе с руководителем проекта – Николаевым Константином Геннадьевичем (https://infochemistry.ru/research/groups). В группу Хемометрики были пргилашены молодые ученые с опытом в различных областях: электрохимии, биохимии, а также синтетической биологии. Научный задел, созданный при поддержке проекта, позволил руководителю проекта вести преподавание учебных дисциплин в рамках образовательной программы «Инфохимия», таких как: «Синхронизация электрохимических и биологических осцилляторов», «Электрохимические сенсоры» и «Физико-химические методы анализа». Всё вышеперечисленное открыло возможность для развития дальнейшей научной деятельности в рамках выполняемого проекта. Были созданы электроды на основе модифицированного нанослоями полиэлектролитов углеволоконного электрода. Было показано, что уратоксидаза в среде краудинга синтетических макромолекул - полиэтиленимина, поли(аллиламина гидрохлорида и поли(4-стиролсульфоната натрия)) способна проявлять высокую ферментативную активность. Нанослой гидрогеля толщиной около 200 нм представляет собой полиэлектролитный комплекс слабозаряженного полиэлектролита с высокозаряженным за счет образования коацерватного состояния. Включение уратоксидазы позволяет изучать поведение биомакромолекул в стесненной среде. Каталитическая активность уратоксидазы в такой наноархитектуре подтверждается экспериментальными данными в системе с реальным объектом мочи больных SARS-Cov-2 и электрохимическим методом детекции. Низкие значения константы Михаэлиса-Ментен свидетельствуют о высокой каталитической активности уратоксидазы в нанослое гидрогеля. Электрохимический интерфейс на основе углеродного волокна позволяет варьировать широкий диапазон параметров в нанометровом масштабе в сочетании с простой конструкцией, что позволяет использовать этот интерфейс в сенсорных системах. Для повышения эффективности диагностики вирусных инфекций мы предлагаем новый подход иммунохимических биосенсоров для определения одиночных вирусных частиц по специфическим антителам. Антитела иммобилизованы на электродах в трехмерной полимерной матрице с несколькими слоями полиэлектролитов на углеродном электроде, нанесенном трафаретной печатью. Нековалентная иммобилизация антител в последовательных слоях положительно заряженного полиэтиленимина (ПЭИ) и отрицательно заряженного полистиролсульфоната (ПСС) позволяет достичь эффекта скопления макромолекул. Такой подход к иммобилизации способствует сохранению оптимальной конформации и подвижности активного центра антитела для взаимодействия с крупными частицами вириона. Мы создали интерфейс электрохимического биосенсора для обнаружения вируса герпеса, вируса папилломы человека и цитомегаловируса, чтобы продемонстрировать применимость метода. При оптимизированной архитектуре 3D-матрицы, включающей сочетание двух слоев положительно заряженного ПЭИ с антителами и последнего слоя отрицательно заряженного ФСС, анализ характеризуется чрезвычайно низким пределом обнаружения (LOD). Предложенный принцип определения вирионных частиц хорошо подходит для новой экспресс-диагностики и выявления вирусных инфекций по месту оказания медицинской помощи.

Аннотация результатов, полученных в 2022 году
Методами рентгеновской дифрактометрии и спектроскопии ЯМР 1H/13C синтезированного 5-((4-(трет-бутил)фенилокси)метил)-3-фенилпиразола установлено, что продукт выделен в двух десмотропных формах. Первый десмотроп представлен исключительно 1H-таутомером, тогда как второй десмотроп является водородно-связанным тетрамерным ассоциатом, сформированным из двух молекул 1H-таутомера и двух молекул 2H-таутомера. Одинаковые рефлексы обеих десмотропных форм по данным порошковой рентгеновской дифрактометрии позволяет предполагать, что первая десмотропная форма также формирует тетрамерную структуру в твердой фазе. Мультиплексный анализ маркеров повреждения ДНК и изучение жизненного цикла клеток в линии M-HeLa после инкубации с 3,5-дизамещенными пиразолами на каликсареновой платформе показал, что ДНК является вероятной мишенью для тестовых соединений. Отсутствие мутагенности пиразолов по данным теоретических расчетов предполагает высокий потенциал полученных соединений для биомедицинской диагностики. Было показано ускорение реакции Кневенагеля между барбитуровой кислотой и ароматическими альдегидами в ограниченном пространстве коацерватных комплксов полиэлектролитов. Реализован полуавтоматизированный спектрофотометрический контроль реакции с использованием роботизированных манипуляторов для захвата кювет и дозирования растворов реагентов. Предложен подход к дизайну сенсора на мочевую кислоту на основе углеволоконного электрода, покрытого ферментом уриказой в ограниченной среде синтетических полиэлектролитов через электростатические взаимодействия. Показана конкурентоспособность предложенного электрохимического ферментного метода со спектрофотометрическим методом по показателю повторяемости для определения содержания мочевой кислоты. Предложенная система углеволокна, модифицированного полиэлектролитными нанослоями может быть использована для сбора больших данных и применения методов машинного обучения для фундаментального физико-химического исследования белков в ограниченных средах и практического использования в качестве одноразовых электрохимических сенсоров. Предложена адаптированная стратегия введения компонентов в полиэлектролитные структуры, нанесение их на поверхность подложек разной морфологии и универсальный подход к разработке разных типов сенсоров. Предложенный новый подход к электрохимическим сенсорам, основанный на иммобилизации специфических агентов в квазиподвижной матрице полиэлектролитных слоев на поверхности углеродных материалов, демонстрирует более простой и быстрый протокол наноструктурирования поверхности, чем предыдущие работы, с сохранением, иногда улучшением функциональных характеристик.

Аннотация результатов, полученных в 2023 году
Объединение методов погружения и капельного нанесения позволило получить стержнеобразные кристаллы сульфонатных тиакаликс[4]аренов (СТСА) на поверхностях, модифицированных полиэлектролитами. Топологических анализ данных АСМ изображений показал образование кристаллов СТСА с более однородным распределением по размерам (индекс полидисперсности снижается с 0.14 до 0.03) при переходе от кремниевой подложки к поверхности, покрытой полиэтиленимином. Данные результаты перспективны для развития ион-проницаемых биосовместимых мембран, подходящих для регенерации тканей и других самозалечивающихся материалов, использующих инкапсуляцию молекул гостей в полости тиакаликсарена и адаптивные свойства и отклик подвижной полиэлектролитной нанопленки. Была разработана модель DFT для послойной агрегации СТСА кавитандов на положительно заряженных или нейтральных макромолекулах полиэтиленимина на силанольном неорганическом каркасе с использованием уровня теории B3LYP-D3/def2-SVP для выявления благоприятных множественных взаимодействий через водородные связи. Теоретическими расчетами было показано, что молекулы СТСА димеризуются через π-стекинг взаимодействия и водородные связи с образованием зигзагообразных молекулярных цепочек. Это позволяет управлять архитектурой макроциклов каликсарена на мягких поверхностях, как было представлено через конкуренцию слабых взаимодействий, включающих силанольный каркас, слой катионного полиэлектролита и анионный СТСА. Обнаружены большие матричные влияния, возникающие в среде биологических жидкостей при определении вирусов клещевого энцефалита и бешенства. Анализ полученного массива данных результатов анализа на содержание антител и вируса клещевого энцефалита и бешенства непосредственно в лабораториях медицинских учреждений коллабораторов и проверки работы предложенных электрохимических сенсорных платформ на реальных объектах (биологические жидкости) моделью многослойного перцептрона на тестовой выборке позволили добиться точности 89% классификации антигенов вируса клещевого энцефалита и вируса бешенства. Методами полуэмпирических квантовохимических расчетов и молекулярного докинга комплексообразования додекамера Диккерсона - модели спирали двухцепочечной ДНК - с пиразолильными производными каликсарена в разных стереоизомерных формах установлена предпочтительная ориентация вертикальной оси симметрии пиразолильных производных каликсарена вдоль водородных связей додекамера, при этом выбор большой или малой бороздки додекамера зависел от размера каликсаренового макроцикла (выбор малой бороздки формами "конус" и "1,3-альтернат", большой бороздки формой "частичный конус"). В то же время тетрамерный ассоциат модельного аналога каликсарена из-за отсутствия возможности участия в координации додекамера пиразольными фрагментами стабилизировал комплекс за счет стекинга ароматических колец на расстоянии до 5 Ангстрем от малой бороздки додекамера. Для оптимизации состава углеродных чернил и нанесения их на полимерную подложку были испытаны собственные композиции углеродных чернил на основе графита, модификатора ацетилцеллюлозы и смеси растворителей ацетон-циклогексанон, а также коммерческие образцы углеродных чернил фирм DuPont и EMS. В случае собственных чернил варьирование соотношения графита и ацетилцеллюлозного связующего, а также объемного соотношения растворителей и степени разбавления ими чернил наряду с разным числом наносимых слоев и времени и температуры высушивания всегда приводили к высокой адгезии к полимерному покрытию только в случае ПВХ, в то время как другие полимерные покрытия не удерживали на поверхности чернила собственного изготовления. Кроме того, наблюдалась низкая степень адгезии к серебряным дорожкам. Необходимо также отметить высокое сопротивление полученной композиции чернил (на порядок выше, чем образцы коммерческих трафаретных электродов RuSens и ItalSens, что не позволило создать на их основе электроактивные покрытия с воспроизводимыми структурно-групповыми и морфологическими характеристиками. Использование чернил производства EMS даже при использовании нескольких слоев приводило к окислению серебряных дорожек и появлению налета окисленных форм серебра (что было подтверждено данными порошковой дифрактометрии и EDX анализа), что не только снижало рабочую поверхность, доступную для нанесения аналитов, но и перекрывало своими пиками окисления выбранную нами редокс-пару ферроцианида/феррицианида. В случае чернил производства DuPont удалось достичь удовлетворительного покрытия слоя серебряных дорожек и полученные токи анодных и катодных процессов в несколько раз превосходили таковые для образцов сравнения - коммерческих электродов RuSens и ItalSens. На данный момент не решена задача воспроизводимости значений токов катодных и анодных процессов, однако полученный предварительный результат позволяет рассматривать композицию чернил производства DuPont как адекватную замену импортным печатным трафаретным электродам для использования в составе функциональных тонкопленочных покрытий в нано- и микроразмерном диапазоне.