КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

 

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ


Номер 21-73-10185

НазваниеИзучение взаимодействий полиэлектролитных комплексов и белковых структур для создания высокочувствительных сенсоров вирусных заболеваний

РуководительМуравьев Антон Андреевич, Кандидат химических наук

Прежний руководитель Николаев Константин Геннадьевич, дата замены: 05.08.2022

Организация финансирования, регион федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Национальный исследовательский университет ИТМО", г Санкт-Петербург

Период выполнения при поддержке РНФ 07.2021 - 06.2024 

Конкурс№61 - Конкурс 2021 года «Проведение исследований научными группами под руководством молодых ученых» Президентской программы исследовательских проектов, реализуемых ведущими учеными, в том числе молодыми учеными.

Область знания, основной код классификатора 03 - Химия и науки о материалах, 03-405 - Наноструктуры и кластеры. Супрамолекулярная химия. Коллоидные системы.

Ключевые словаантитела, антигены, ферменты, полиэлектролиты, полиэлектролитные комплексы, слой-за-слоем, сенсоры, электроанализ

Код ГРНТИ31.27.20


 

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ


Аннотация
Потребность последних лет в быстром выпуске новых систем детектирования вирусных заболеваний продемонстрировала отсутствие универсального подхода к их созданию. В первую очередь это объясняется проблемой сохранения активности иммобилизованных антител или антигенов на подложке в составе тест-систем. Наиболее распространенным способом иммобилизации чувствительных биораспознающих молекул на подложке является ковалентная сшивка. Преимуществом такого метода является иммобилизация воспроизводимого количества молекул. Существенным недостатком служит блокировка активных центров биологических молекул (антител, антигенов и ферментов), что приводит к изменению стехиометрии биохимических реакций, и, следовательно, снижению чувствительности и селективности реакции. Всё это приводит к увеличению времени создания тест-систем для детектирования новых вирусных заболеваний, например вируса SARS-CoV-2. Существуют фундаментальные научные исследования, которые предлагают использовать в качестве способа иммобилизации биологических чувствительных молекул на поверхности подложки последовательно адсорбированные слои полиэлектролитов. Создание различных наноархитектур слоев полиэлеткролитов для иммобилизации антител, антигенов и ферментов демонстрирует возможность увеличения количества иммобилизованных биочувствительных молекул, что в свою очередь приводит к повышению чувствительности тест-систем. Перспективы данного подхода уже продемонстрированы в моей группе, также предлагаемый подход позволяет избежать большого количества нанослоев полиэлектролитов путем создания гидрогелевых структур полиэлектролитных комплексов (Nikolaev et al. «Tick-Borne Encephalitis Electrochemical Detection by Multilayer Perceptron on Liquid–Metal Interface», ACS Applied Bio Materials, 2020) на поверхности подложки (Nikolaev et al. «ElectroSens Platform with a Polyelectrolyte-Based Carbon Fiber Sensor for Point-of-Care Analysis of Zn in Blood and Urine», ACS Omega, 2020). Эффективность применения полиэлектролитов достигается при использовании их ограниченного количества (Nikolaev et al. «Thin and Flexible Ion Sensors Based on Polyelectrolyte Multilayers Assembled onto the Carbon Adhesive Tape», ACS Omega, 2019). Основной стратегией является включение биологических полиэлектролитов (антител, антигенов и ферментов) в гидрогелевые полиэлектролитные комплексы, а также создание с помощью полиэлектролитных комплексов препятствия для проникновения мешающих определению вирусов белковых структур, чьи константы связывания близки к значениям селективных молекул. Предлагаемая стратегия подтверждается современным общемировым трендом создания функциональных интерфейсов. Предлагаемый новый подход для создания биосенсорного интерфейса, который обеспечит высокую чувствительность, позволит создавать сенсоры нового поколения. Целью проекта является исследование биоселективных взаимодействий в слоях полиэлектролитов разной архитектуры. Предлагаемый подход основан на том, что высокозаряженные внутренне неупорядоченные белковые структуры могут образовывать комплексы с очень высоким сродством друг к другу, в которых оба белка полностью сохраняют свою неупорядоченность и динамику (Nikolaev et al. «Programmable Soft-Matter Electronics», J. Phys. Chem. Lett. 2021). Их взаимодействие демонстрирует еще одну удивительную особенность: кинетика ассоциации/диссоциации зависит от концентрации белка. В частности, при низких концентрациях белка наблюдается медленный переход с ассоциированной на диссоциированной форму, подобно переключению с одного состояния на второе, в то время как при более высоких, физиологически значимых концентрациях переключение происходит быстро. Изменение в механизме может быть обусловлено образованием временных тройных комплексов белок-полиэлектролит-белок, термодинамически выгодных при высоких концентрациях белка, которые ускоряют обмен между связанными и несвязанными формами на порядки. Разупорядоченность в полиэлектролитных комплексах способствует (i) связыванию, ограниченному диффузией, (ii) переходному образованию тройного комплекса и (iii) быстрому обмену мономерами путем конкурентного замещения, которые вместе обеспечивают быструю кинетику. Таким образом, биологические полиэлектролиты могут поддерживать высокую чувствительность регуляторных сетей даже к взаимодействиям с чрезвычайно высоким сродством белков друг к другу. В проекте планируется исследование взаимодействий типа антитело-антиген и фермент-субстрат, их кинетики, при их включении в состав полиэлектролитов. Будет исследована селективность предложенных наноархитектур. В качестве модельных систем будут использованы вирусы, которые относятся к классу скрытых вирусных заболеваний: вирус герпеса, вирус папилломы человека и цитомегаловирус. Выбор таких аналитов объясняется потребностью в их контроле у большого количества населения. Протекая бессимптомно, скрытые вирусные инфекции вызывают воспаление и легко переходят в хроническую форму. Последствиями скрытых инфекций, передающихся половым путем, могут быть частые воспалительные заболевания мочеполовой сферы, сложности с зачатием, у мужчин — проблемы с потенцией, у женщин — с менструальным циклом и вынашиванием детей. В качестве способа детектирования в предложенной сенсорной платформе предлагается использовать электрохимическую детекцию. Электрохимический способ детектирования обладает высокой чувствительностью, по сравнению со спектрофотометрическим, в сочетании с низким потреблением биохимических реагентов. Аналитические характеристики, полученные таким способом, обладают высокой прецизионностью и воспроизводимостью. Данный метод подходит как для изучения фундаментальных свойств переноса заряда в биохимических системах, так и для применения в тест-системах. На основе результатов предложенного проекта будет предложена электрохимическая сенсорная платформа для детектирования скрытых вирусных заболеваний: вируса герпеса, вируса папилломы человека и цитомегаловируса. С учетом имеющегося научного задела у коллектива авторов в данной области и современного оснащения Университета ИТМО, в рамках которых планируется исследование, успешное выполнение проекта и всех заявленных индикаторов не вызывает сомнений. По результатам проекта, планируется опубликование не менее 9 статей в научных журналах cо средним импакт-фактором не ниже 2,5.

Ожидаемые результаты
В результате выполнения проекта будут исследованы фундаментальные свойства взаимодействия активных центров в системе антитело-антиген и фермент-субстрат. Будут разработаны методы создания чувствительных слоев для тест-систем на основе нанослоев полиэлектролитов в качестве матрицы. Кроме того, ожидается увеличение чувствительности и селективности биораспознающих реакций благодаря созданию свободной конформации молекул белковых структур и, следовательно, увеличению числа активных центров. С помощью спектральных и кинетических методов будет подробно исследовано влияние полиэлектролитных комплексов на конформационные изменения в структуре белков антител, антигенов и ферментов. Будет проведено исследование влияния ионной силы, рН и степени протонирования полиэлектролитов. Будут исследованы механизмы последовательного осаждения выбранных комбинаций полиэлектролитных слоев с известными откликами, в том числе на основе полистиролсульфоната в комбинации с полиэтиленимином (как линейным, так и разветвленным), полиаллиламингидрохлоридом, полиакриловой кислотой, полидиаллилдиметиламмоний хлоридом, поли-4-винилпиридином и др. Будут изучены их буферная активность, структурно-морфологические и гидрофильно-гидрофобные свойства в зависимости от условий осаждения, рН, и степени протонирования слабых поликислот и полиоснований. Будут разработаны принципы послойного нанесения полиэлектролитов на различные материалы электродов, принимая во внимание раннее найденные дзета-потенциалы. Будет изучена возможность влиять на релаксацию системы. Будут установлены механизмы десорбции за счет анализа процессов в растворах, которые способны вытеснять протоны из –NH3+, -СООН. Предлагаемый подход соответствует общемировой тенденции создания новых интерфейсов на основе биомиметических материалов, которые позволяют иммобилизировать биологические молекулы с сохранением их активности. Практическая значимость проведенных исследований найдет применение в технологии создания тест-систем для контроля скрытых вирусных инфекций, которая позволит обеспечить проведение медицинской диагностики на качественно новом уровне. Подход в создании дешевых и высокочувствительных количественных систем детектирования отвечает требованиям персонализированной медицинской диагностики, а также возможности интегрирования таких тест-систем в Интернет Вещей (IoT, Internet of Things).


 

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ


Аннотация результатов, полученных в 2021 году
В рамках выполняемого проекта были решены задачи с использованием междисциплинарного подхода. Это оказалось возможным благодаря наличию в университете ИТМО научных групп, коллаборация с которыми позволила достичь планируемых результатов. В течение срока выполнения проекта было продолжено сотрудничество с партнерами из Первого московского медицинского университета им. Сеченова, в частности исследовательской группой профессора Скального Анатолия Викторовича. Общий подход в исследовании процессов, происходящих в среде макромолекул позволил совместно изучать изменение микроэлементов в биоподобных системах. Взаимодействие с партнером Университета ИТМО - Институтом полиомиелита и вирусных энцефалитов имени М. П. Чумакова, а именно научной группой проф., академика РАН Алексея Михайлович Егорова, позволило продолжить исследования в области иммуноферментного анализа на основе предлагаемых подходов для количественного анализа цельных вирусных частиц. Общий подход, используемый в создании биораспознающих трансдьюсеров представлен на рисунке 1. Финансовая поддержка фонда РНФ в рамках текущего проекта (21-73-10185 Изучение взаимодействий полиэлектролитных комплексов и белковых структур для создания высокочувствительных сенсоров вирусных заболеваний) позволила создать в научно-образовательном центре Инфохимии (директор – проф. Екатерина Владимировна Скорб), Университета ИТМО группу Хемометрики во главе с руководителем проекта – Николаевым Константином Геннадьевичем (https://infochemistry.ru/research/groups). В группу Хемометрики были пргилашены молодые ученые с опытом в различных областях: электрохимии, биохимии, а также синтетической биологии. Научный задел, созданный при поддержке проекта, позволил руководителю проекта вести преподавание учебных дисциплин в рамках образовательной программы «Инфохимия», таких как: «Синхронизация электрохимических и биологических осцилляторов», «Электрохимические сенсоры» и «Физико-химические методы анализа». Всё вышеперечисленное открыло возможность для развития дальнейшей научной деятельности в рамках выполняемого проекта. Были созданы электроды на основе модифицированного нанослоями полиэлектролитов углеволоконного электрода. Было показано, что уратоксидаза в среде краудинга синтетических макромолекул - полиэтиленимина, поли(аллиламина гидрохлорида и поли(4-стиролсульфоната натрия)) способна проявлять высокую ферментативную активность. Нанослой гидрогеля толщиной около 200 нм представляет собой полиэлектролитный комплекс слабозаряженного полиэлектролита с высокозаряженным за счет образования коацерватного состояния. Включение уратоксидазы позволяет изучать поведение биомакромолекул в стесненной среде. Каталитическая активность уратоксидазы в такой наноархитектуре подтверждается экспериментальными данными в системе с реальным объектом мочи больных SARS-Cov-2 и электрохимическим методом детекции. Низкие значения константы Михаэлиса-Ментен свидетельствуют о высокой каталитической активности уратоксидазы в нанослое гидрогеля. Электрохимический интерфейс на основе углеродного волокна позволяет варьировать широкий диапазон параметров в нанометровом масштабе в сочетании с простой конструкцией, что позволяет использовать этот интерфейс в сенсорных системах. Для повышения эффективности диагностики вирусных инфекций мы предлагаем новый подход иммунохимических биосенсоров для определения одиночных вирусных частиц по специфическим антителам. Антитела иммобилизованы на электродах в трехмерной полимерной матрице с несколькими слоями полиэлектролитов на углеродном электроде, нанесенном трафаретной печатью. Нековалентная иммобилизация антител в последовательных слоях положительно заряженного полиэтиленимина (ПЭИ) и отрицательно заряженного полистиролсульфоната (ПСС) позволяет достичь эффекта скопления макромолекул. Такой подход к иммобилизации способствует сохранению оптимальной конформации и подвижности активного центра антитела для взаимодействия с крупными частицами вириона. Мы создали интерфейс электрохимического биосенсора для обнаружения вируса герпеса, вируса папилломы человека и цитомегаловируса, чтобы продемонстрировать применимость метода. При оптимизированной архитектуре 3D-матрицы, включающей сочетание двух слоев положительно заряженного ПЭИ с антителами и последнего слоя отрицательно заряженного ФСС, анализ характеризуется чрезвычайно низким пределом обнаружения (LOD). Предложенный принцип определения вирионных частиц хорошо подходит для новой экспресс-диагностики и выявления вирусных инфекций по месту оказания медицинской помощи.

 

Публикации

1. Першина Любовь, Носкова Ульяна, Никитина Анна, Москаленко Иван, Скорб Екатерина, Николаев Константин Uricase crowding via polyelectrolyte layers coacervation for enhanced enzymatic activity Langmuir, - (год публикации - 2022)


Аннотация результатов, полученных в 2022 году
Методами рентгеновской дифрактометрии и спектроскопии ЯМР 1H/13C синтезированного 5-((4-(трет-бутил)фенилокси)метил)-3-фенилпиразола установлено, что продукт выделен в двух десмотропных формах. Первый десмотроп представлен исключительно 1H-таутомером, тогда как второй десмотроп является водородно-связанным тетрамерным ассоциатом, сформированным из двух молекул 1H-таутомера и двух молекул 2H-таутомера. Одинаковые рефлексы обеих десмотропных форм по данным порошковой рентгеновской дифрактометрии позволяет предполагать, что первая десмотропная форма также формирует тетрамерную структуру в твердой фазе. Мультиплексный анализ маркеров повреждения ДНК и изучение жизненного цикла клеток в линии M-HeLa после инкубации с 3,5-дизамещенными пиразолами на каликсареновой платформе показал, что ДНК является вероятной мишенью для тестовых соединений. Отсутствие мутагенности пиразолов по данным теоретических расчетов предполагает высокий потенциал полученных соединений для биомедицинской диагностики. Было показано ускорение реакции Кневенагеля между барбитуровой кислотой и ароматическими альдегидами в ограниченном пространстве коацерватных комплксов полиэлектролитов. Реализован полуавтоматизированный спектрофотометрический контроль реакции с использованием роботизированных манипуляторов для захвата кювет и дозирования растворов реагентов. Предложен подход к дизайну сенсора на мочевую кислоту на основе углеволоконного электрода, покрытого ферментом уриказой в ограниченной среде синтетических полиэлектролитов через электростатические взаимодействия. Показана конкурентоспособность предложенного электрохимического ферментного метода со спектрофотометрическим методом по показателю повторяемости для определения содержания мочевой кислоты. Предложенная система углеволокна, модифицированного полиэлектролитными нанослоями может быть использована для сбора больших данных и применения методов машинного обучения для фундаментального физико-химического исследования белков в ограниченных средах и практического использования в качестве одноразовых электрохимических сенсоров. Предложена адаптированная стратегия введения компонентов в полиэлектролитные структуры, нанесение их на поверхность подложек разной морфологии и универсальный подход к разработке разных типов сенсоров. Предложенный новый подход к электрохимическим сенсорам, основанный на иммобилизации специфических агентов в квазиподвижной матрице полиэлектролитных слоев на поверхности углеродных материалов, демонстрирует более простой и быстрый протокол наноструктурирования поверхности, чем предыдущие работы, с сохранением, иногда улучшением функциональных характеристик.

 

Публикации

1. Балдина А.А., Першина Л.В., Носкова У.В., Никитина А.А., Муравьев А.А., Скорб Е.В., Николаев К.Г. Uricase crowding via polyelectrolyte layers coacervation for carbon fiber-based electrochemical detection of uric acid Polymers, 14(23), 5145 (год публикации - 2022) https://doi.org/10.3390/polym14235145

2. Муравьев А.А., Овсянников А.С., Коноров Г.В., Исламов Д.Р., Усачев К.С., Новиков А.С., Соловьева С.Е., Антипин И.С. Thermodynamic vs. Kinetic Control in Synthesis of O-Donor 2,5-Substituted Furan and 3,5-Substituted Pyrazole from Heteropropargyl Precursor Molecules, 27(16), 5178 (год публикации - 2022) https://doi.org/10.3390/molecules27165178