Аннотация результатов, полученных в 2021 году
За отчетный период 2021 года в рамках выполнения проекта «Создание масс-спектрометрического метода полного de novo секвенирования интактных природных биологически активных пептидов земноводных» под руководством Самгиной Т.Ю удалось провести несколько разнонаправленных исследований в области изучения пептидного состава кожных секретов различных лягушек. Были начаты работы по оптимизации процесса выделения кожного секрета земноводных для максимального выхода биоактивных пептидов и нейтрализация энзимов на примере секретов лягушек Rana ridibunda и Rana lessonae, у которых ингибирование эндопротеаз осуществляли метанолом, соляной кислотой, а также фенилметилсульфонил фторидом. Полученные данные методом высокоэффективной жидкостной хроматографии–масс-спектрометрии высокого разрешения (ВЭЖХ-МСВР) в режимах полного сканирования и тандемной масс-спектрометрии показали, что количество обнаруженных интактных пептидов в образцах, полученных обработкой кожных секретов соляной кислотой и метанолом было невелико и отличалось несущественно, тогда как количество протеолитических форм для обоих вариантов обработки было более 100. Пока что предварительно полученные результаты не позволили выявить однозначно лучшего подхода для ингибирования эндопротеаз, и исследование данного вопроса требует новых экспериментов. Была проведена работа по выявлению изменений в кожном пептидном секрете в условиях патогенного бактериального воздействия на травяных лягушек Rana temporaria. В работе использовались штамм 13267 Micrococcus luteus и непатогенный тестовый штамм 209-P Staphylococcus aureus. Оба вида относятся к грамположительным бактериям. Бактерии M. luteus присутствуют в нормальной флоре кожи млекопитающих, а отдельные штаммы Staphylococcus aureus могут быть опасны и для человека. Общая длительность эксперимента составила 62 дня, за которые пятикратно были получены кожные секреты спинных желез. Собранные секреты трех особей различались тем, что для контрольной лягушки (К) они отражали её реакцию на длительность содержания в неволе и стрессовое воздействие водной среды (стресс «неволи в водной среде»), тогда как экспериментальные особи Э1 и Э2 испытывали дополнительное воздействие микроорганизмов. Были изучены вариации уровней нескольких десятков пептидов. Наиболее любопытные зависимости зарегистрировали для бревинина-2Т, бревинина-2Те, бревинина-1Та, бревинина-1Т и бревинина-1Тb, а также ряда пептидов из семейства темпоринов. К сожалению, полученные результаты не позволили сделать надежных выводов о влиянии использованных микроорганизмов на секретирование конкретных пептидов в связи с разнонаправленностью колебаний секретирования пептидов вне зависимости от контакта с бактериями или физического состояния особи. Например, у контрольной лягушки в течение пяти недель шло 16-ти кратное падение пептида бревинина-1Та. Контакт с бактериями S. aureus в низкой концентрации активизирует его синтез, но при тысячекратном увеличении концентраций бактерий S. aureus доля бревинина-1Та в секрете особи Э1 возросла только втрое. У второй же экспериментальной лягушки Э2 такого возрастания не произошло, а отмечалось падение его выработки. Аналогичные наблюдения были сделаны и для других пептидов, для которых были зафиксированы количественные изменения Были изучены пептидомы Кубинского эндемичного вида древесной квакши Osteopilus septentrionalis и лягушки Rana temporaria из Словенской популяции. Для кубинской лягушки были установлены сиквенсы шестнадцати новых анионных (отрицательно заряженные при физиологических значениях рН) пептидов двух новых семейств: септенинов 1 и септенинов 2, для большинства которых характерно проницание мембран патогенных клеток под острым углом. Полученные в работе расчетные значения гидрофобности, гидрофобных моментов и α-спиральности септенинов 1 и септенинов 2 на основании установленных их сиквенсов свидетельствуют, что большинство из них потенциально могут обладать свойствами наклонно-ориентированных пептидов и проявлять бактерицидную активность. Для словенской лягушки удалось идентифицировать 60 пептидов, в число которых вошли 6 новых пептидов, относящихся к уже известным классам: 5 темпоринов и один бревенин 1. Сравнение пептидома с ранее изученным для Rana temporaria из Подмосковной популяции позволяет предлагать эти пептиды в качестве таксономических маркеров – пептидов, появляющихся или исчезающих из кожного секрета лягушек, относящихся к одному виду, но разным популяциям, из-за отличающихся факторов внешней среды, хищников и окружающих микроорганизмов. В случае исследованной лягушки наибольшие изменения коснулись секретируемых темпоринов – пептидов, обладающих широкой активностью в отношении грамположительных и грамотрицательных бактерий, грибков и вирусов. Количество темпоринов в секрете обеих лягушек практически одинаково: 13 в случае Подмосковной особи и 14 в случае Словенской, но лишь 9 из них общие для обеих популяций. Предполагаемые активности новых пептидов оценены с помощью 2D-карты – графика, построенного в координатах нормализованный дефект масс (NMD, ось Х) нормализованный изотопный сдвиг (NIS, ось Y), разработанной нами ранее. В результате сравнения всех известных последовательностей темпоринов была предложена таблица возможных замен аминокислот в их структурах. Такая таблица представляет собой удобный прогностический инструмент при анализе новых пептидов, позволяя предполагать соответствующие замены определенных аминокислот в конкретных положениях последовательностей. Были оптимизированы нормализованные энергии соударений для работы с кожными пептидами амфибий в режимах диссоциации инициированной соударениями и диссоциации инициированной соударениями при повышенной энергии. Продемонстрирована эффективность подхода МС3 - ДПЭ-ДАСПЭ для идентификации изомерных остатков лейцина и изолейцина. Тем не менее следует подчеркнуть, что при отсутствии первичного иона z-серии метод не работает. Необходимо проработать возможность варьирования условий первой стадии фрагментации, а именно условий диссоциации при переносе электрона. Сравнение результатов ручного секвенирования с автоматическим с помощью программного обеспечения PEAKS Studio X Pro показало, что программа позволяет с высокой степенью достоверности устанавливать последовательности коротких пептидов, особенно в случае структур, богатых лизинами, однако для длинных дисульфидсодержащих пептидов результаты автоматизированного секвенирования оказываются значительно хуже.

Аннотация результатов, полученных в 2022 году
В 2022 году были продолжены исследовательские работы в рамках заявленной темы гранта «Создание масс-спектрометрического метода полного de novo секвенирования интактных природных биологически активных пептидов земноводных». Полный геном амфибий не изучен, что делает задачу сложной, поскольку исключает использование трипсинолиза с последующим воссозданием исходных пептидов с помощью существующих баз данных изученных белков и пептидов. Для решения заявленной задачи мы используем современные масс-спектрометры высокого разрешения, в частности, орбитальные ловушки, которые конструктивно легко сопрягаются с набором различных методов фрагментации полипептидных цепей. Для секвенирования пептидов ранидных лягушек мы применяем наиболее информативные для наших объектов методы: фрагментацию, активированную столкновениями (ДАС) и диссоциацию активированную столкновениями при повышенной энергии (ДАСПЭ); диссоциацию, индуцированную переносом электрона (ДПЭ), а также МС3 эксперимент, объединяющий захват электрона с дополнительной активацией фрагментации соударениями (EThcD, ДПЭ+ДАСПЭ). За отчетный период особое внимание было уделено изучению возможностей метода EThcD для de novo секвенирования наших объектов, а именно: дисульфидсодержащих длинных (до 34 звеньев) пептидов с С-концевым S-S циклом (бревининов 1 и 2, а также ранатуеринов 2); более коротких (22-23 звена) мелиттин-родственных пептидов и коротких (13-16 звеньев) амидированных темпоринов. Все перечисленные пептиды относятся к антимикробным пептидам (АМП). Исследования проводились на кожные субстратах бурых лягушек: R. arvalis из словенской популяции и Архангельской R. temporaria, в секретах которых присутствуют пептиды из перечисленных семейств. Последовательности всех компонентов обеих лягушек определялись ручной интерпретацией совокупности спектров, полученных перечисленными выше методами фрагментации, однако наиболее структурно информативными оказались именно спектры EThcD. В условиях этого метода происходила фрагментация внутри S-S С-терминального цикла с диссоциацией самой S-S связи у интактных дисульфидных пептидов, что позволяло установить полную информацию о последовательностях подобных пептидов, не прибегая к химической модификации S-S связей. Спектры EThcD были информативными при секвенировании коротких, сложно фрагментирующих, темпоринов, а также для проведения дифференциирования в изомерных парах лейцин/изолейцин. Была предложена схема, описывающая наблюдаемую новую фрагментацию в S-S циклах интактных пептидов в условиях EThcD. Обнаруженная фрагментация дала основание применить к секвенированию пептидов из секретов словенских особей R. arvalis и архангельских R. temporaria прием «сверху-вниз», исключающий использование трипсинолиза и модификаций, когда сиквенс пептидов устанавливается исключительно масс-спектрометрическим путем. Для сравнения часть кожных субстратов обеих особей была модифицирована (восстановление/алкилирование). Это, в том числе, наглядно показало, что любое модифицирование пептидных смесей приводит к потере минорных компонентов при последующей очистке (более половины числа исходных дисульфидных пептидов не удалось детектировать после дериватизации). Вместе с тем все исходные S-S содержащие интактные пептиды кожных секретов, включая минорные, удалось полностью секвенировать исключительно комплексом методов масс-спектрометрии, т.е. провести de novo секвенирование методом “сверху-вниз”. При масс-спектрометрическом анализе кожных субстратов двух этих видов амфибий мы впервые применительно к нашим объектам использовали удлиненное время хроматографического разделения параллельно с отложенным сканированием наиболее интенсивных ионов. Это позволило уловить минорные компоненты для каждого вида амфибий, последовательности которых были определены нами впервые, что открыло для нас возможность провести популяционные исследования. Сравнительные исследования популяционных различий в компонентном составе кожных пептидомов были проведены на двух популяциях R. arvalis (словенской и подмосковной) и четырех популяциях R. temporaria (словенской, подмосковной, архангельской и итальянской). Было обнаружено, что состав компонентов кожного пептидома внутри вида, в основном, сохраняется, однако каждая популяция внутри вида имеет свои отличия в кожном пептидоме. И это дает возможность выделить в кожном секрете как биомаркеры вида (общие для всех популяций вида пептиды), так и биомаркеры отдельных популяций (пептиды, характерные для конкретной популяции внутри вида). Наиболее изменчивыми пептидами в секретах четырех популяций травяной лягушки R. temporaria оказались темпорины. Для каждой популяции этого вида есть свои характерные пептиды этого семейства, от самой южной популяции (итальянской) до самой северной архангельской, живущей почти у полярного круга (на 2º южнее). Возможно, именно темпорины участвуют в адаптации всех популяций R. temporaria к изменяющимся условиям новых экологических ниш, с новыми патогенными микроорганизмами. В секретах двух популяций R. arvalis изменения происходят в семействах ранатуеринов 2, мелиттин-родственных пептидов и темпоринов (все АМП). Любопытно, что в секрете особей из самой северной популяции R. temporaria был впервые обнаружен бревинин 2d, чья последовательность задолго до этого была предсказана генетически, но никогда не обнаруживалась в секретах этого вида амфибий. По мнению эволюционного генетика J.A. Tennessen`а, лягушка, попадая при расселении в другую эконишу с новой микробиотой, сама определяет, какие пептиды ей необходимо секретировать из генетически заложенного в определенных локусах хромосом антибактериальные пептиды [Tennessen JA. Adaptive Diversity and Divergence at Frog Antimicrobial Peptide Loci. PhD Thesis, Oregon State University, February 27, 2009; Tennessen J.A., Blouin M.S. A revised leopard frog phylogeny allows a more detailed examination of adaptive evolution at ranatuerin-2 antimicrobial peptide loci//Immunogenetics. 2010.62(5):333-343]. Популяционные колебания в компонентном составе кожных пептидомов внутри вида далеко не случайны и определяются в значительной степени изменившимся патогенным окружением. Все обнаруженные новые последовательности пептидов в секретах словенской R. arvalis и архангельской R. temporaria переданы в международную базу данных с присвоением шифров. Помимо масс-спектрометрических исследований была проведена заготовка кожного секрета новосибирских особей R. arvalis, словенских особей R. dalmatina, подмоссковных особей P. lessonae и ростовских особей P. ridibundus для дальнейших исследований. За текущий период были защищены две кандидатские диссертации по теме гранта М.Д. Толпиной и И.Д. Васильевой. Результаты исследований опубликованы в журналах Q1 и Q2.

Аннотация результатов, полученных в 2023 году
Реализация проекта в рамках заявленной темы гранта «Создание масс-спектрометрического метода полного de novo секвенирования интактных природных биологически активных пептидов земноводных» была успешно продолжена в 2023. Установление полного сиквенса пептидов кожного секрета амфибий ранее требовало комплексного подхода с использованием дериватизирующих реагентов для раскрытия С-концевого цистеинового цикла («Rana box»), характерного для интактных дисульфидных пептидах ранидных лягушек. Однако в результате исследований в 2023 году было показано, что фрагментация внутри «Rana box» в интактных дисульфидных пептидах ранидных лягушек в условиях МС3 эксперимента, объединяющего захват электрона с дополнительной активацией фрагментации соударениями (EThcD) комплементарна тому раскрытию дисульфидного цикла, который наблюдался нами ранее в условиях ДАС/ДАСПЭ для дериватизированного пептида. Использование суммы двух методов EThcD и ДАС/ДАСПЭ позволяет установить последовательность аминокислот в интактных пептидах с «Rana box» при ручной интерпретации масс-спектров и делает возможным изучение секретов амфибий методом «сверху вниз», т.е. исключительно масс-спектрометрическими методами. Изучение спектров фрагментации в условиях EThcD в многозарядных ионах дисульфидсодержащих пептидов позволило установить механизм данного процесса и использовать его для объяснения наблюдаемых процессов. Было показано, что электрон захватывается аминокислотным остатком оснóвной аминокислоты внутри цикла с последующим переносом радикального центра на карбонильный атом углерода. Было продемонстрировано, что химическое модифицирование пептидов, даже самое щадящее, приводит к искажению результатов из-за неуниверсальности самой процедуры для всех компонентов секретов; связанной с этим недостижимостью 100%-ного выхода модифицированных пептидов; и, главное, из-за неизбежных потерь части компонентов, присутствующих изначально в интактном образце в минимальных количествах, при последующей очистке образцов кожных секретов. На ряде примеров нами была показана возможность и эффективность использования метода определения сиквенсов компонентов кожных секретов амфибий методом сверху-вниз (top-down), подразумевающего отсутствие предварительного трипсинолиза и любых химических модификаций, в основном, для раскрытия S-S связей дисульфидных пептидов. Протеазы, в отличие от пептидов амфибий, представляют собой большие белковые молекулы, осаждения которых можно добиться изменением ионной силы растворителя. Ранее как в нашей, так и в других научных группах были замечены экспериментальные различия в способности разных классов химических реагентов по-своему ингибировать протеазы амфибий, вызывающих деградацию кожных секретов лягушек. При выявлении оптимального и наиболее эффективного ингибитора протеаз кожных секретов амфибий были изучены образцы, обработанные метанолом, соляной кислотой, муравьиной кислотой и ингибитором протеаз – фенилметилсульфонил фторидом (ФМСФ). Среди исследованных ингибиторов наилучшим образом себя показал метанол. При его использовании процессы деградации пептидов в процессе получения кожных секретов протекали слабо, что проявлялось в малом количестве образующихся протеолитических форм, что, в свою очередь, проявлялось в малой интенсивности их сигналов в масс-хроматограмме относительно сигналов интактных пептидов. В 2023 году был изучен и впервые описан состав кожного секрета словенских особей R. dalmatina, в котором обнаружены пептиды семейств бревининов 1, бревининов 2, мелиттин-родственных пептидов, темпоринов и брадикинин-родственных пептидов. Установлены последовательности трех новых пептидов: бревинина 1Db; бревинина 2D и тмпорина 1Da. По набору обнаруженных пептидных семейств R. dalmatina оказалась наиболее близка с травяной лягушкой R. temporaria. Помимо 4-х дисульфидных бревининов 1, 2, в секрете присутствует мелиттин-родственный пептид FQ-22, полностью идентичный выделенному из секрета R. temporaria, а также десять темпоринов. Состав секретируемых брадикинин-родственных пептидов у R. dalmatina существенно беднее, чем у R. temporaria, у которой брадикинин - мажорный пептид секрета. Кожный секрет R. dalmatina уступает травяной лягушке по разнообразию аналогов брадикинина и их протеолитических форм, и, главное, по их количеству в секрете: интенсивность сигналов всех ионов брадикинин-родственных пептидов невысока. Набор антимикробных пептидов, полученный клонированием кДНК (транскриптом), всегда существенно больше реально секретируемого (кожный пептидом). Изучение литературных данных показало, что результаты клонинга зависят от правильности определения рамок начала и конца считывания закодированной в кДНК информации. Неверно определенные рамки начала и конца считывания часто приводят к неверным результатам, вследствие богатого разнообразия последовательностей пептидов. Мы провели сравнение набора пептидов, полученного разными способами, для бурой словенской лягушки Rana dalmatina, где наглядно показали, насколько правильность определения транскриптома этой лягушки зависела от неизученности компонентного состава ее кожного пептидома – на момент написания нашей статьи в литературе отсутствовали данные по составу ее кожного пептидома.