КАРТОЧКА ПРОЕКТА,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

 

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ


Номер 21-73-20105

НазваниеСоздание масс-спектрометрического метода полного de novo секвенирования интактных природных биологически активных пептидов земноводных.

РуководительСамгина Татьяна Юрьевна, Кандидат химических наук

Организация финансирования, регионФедеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Московский государственный университет имени M.В.Ломоносова», г Москва

Годы выполнения при поддержке РНФ 2021 - 2024 

КонкурсКонкурс 2021 года по мероприятию «Проведение исследований на базе существующей научной инфраструктуры мирового уровня» Президентской программы исследовательских проектов, реализуемых ведущими учеными, в том числе молодыми учеными

Объект инфраструктуры Центр коллективного пользования научным оборудованием «Арктика»

Область знания, основной код классификатора 03 - Химия и науки о материалах, 03-205 - Аналитическая химия

Ключевые словаБелки, пептиды, масс-спектрометрия, секвенирование, изомерные аминокислоты, дисульфидные связи, биологически активные соединения, электрораспыление, покрытие сиквенса, дериватизация, резистентность микроорганизмов, антибактериальные пептиды, автоматизированные методы обработки спектров

Код ГРНТИ31.19.29, 31.23.27, 31.27.22


 

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ


Аннотация
За последние 20 лет масс-спектрометрия стала ключевым методом протеомики для белкового профилирования, поиска белковых маркеров заболеваний, изучения аддуктов белков с лекарствами и межбелковых образований и т.д. Существует два вида масс-спектрометрического анализа белков: “снизу-вверх” и “сверху-вниз” [Kinter M., Sherman N. Protein Sequencing and Identification Using Tandem Mass Spectrometry. Wiley-Interscience Series on Mass Spectrometry. Desiderio D.M., Nibbering N.M.M., Editors. New York: John Wiley & Sons Inc., 2000, 320 p.; А.Т. Лебедев, К.А. Артеменко, Т.Ю. Самгина “Основы масс-спектрометрии белков и пептидов”, Техносфера, Москва, 2012, 187 с.]. В первом случае белки энзиматически расщепляются (обычно трипсином) на более короткие цепочки пептидов с молекулярной массой до 2000 Дальтон, которые далее идентифицируются МС с использованием баз данных. В подходе “сверху-вниз” для определения белка используются исключительно возможности масс-спектрометрия. Здесь незаменимыми оказываются тандемная масс-спектрометрия, масс-спектрометрия высокого разрешения, альтернативные методы инициирования фрагментации. Большинство исследователей использует подход “снизу-вверх”, поскольку он проще и хорошо автоматизирован. Однако, если исследуемого пептида нет в существующих базах данных, его первичную структуру приходится устанавливать впервые: в этом случае речь идет о “de novo” секвенировании. Для этого необходимо установить полный сиквенс белка (полипептида), добившись разрывов цепи по всем пептидным связям. Если для триптических пептидов (коротких, полученных трипсинолизом исходного образца, с фиксированным С-концевым лизином или аргинином) эта задача удовлетворительно решается многочисленными программными продуктами автоматического секвенирования, то для нетриптических природных биологически активных пептидов все оказывается значительно сложнее, хотя именно они играют ключевую роль в фунционировании живых организмов. Поскольку последовательности вновь секвенируемых пептидов не содержатся в существующих базах данных, в отношении их исключен подход “снизу-вверх” и процедура трипсинолиза. В работе с ними исследователи вынуждены применять подход “сверху-вниз”, подразумевающий использование исключительно возможности самой масс-спектрометрии. Масс-спектрометрическое de novo секвенирование длинных природных пептидов сопряжено с преодолением следующих проблем: 1. Длина пептида. Например, эскулентины кожных секретов лягушек имеют в цепочке до 46 звеньев. Это фактически уже небольшие белки, полный сиквенс которых желательно установить масс-спектрометрическим путем, т.е. методом “сверху-вниз”. 2. Присутствие сразу нескольких оснόвных аминокислотных остатков в пептидной цепочке (аргининов и/или лизинов). Это делает их фрагментацию нестандартной в сравнении с триптическими пептидами, имеющими С-концевое расположение оснóвных аминокислот. Высокое содержание оснóвных аминокислот у природных пептидов не позволяет провести трипсинолиз (т.е. исключает подход "снизу-вверх") из-за образования слишком коротких пептидов, которые могут быть потеряны во время анализа. 3. Неполное покрытие сиквенса. Поскольку часто не удается добиться разрывов всех амидных связей пептида, масс-спектр, как правило, не содержит необходимого полного набора возможных фрагментных ионов. Выходом их этой ситуации может быть использование альтернативных методов инициирования фрагментации, которое сопровождается другим набором фрагментных ионов. 4. Присутствие внутримолекулярных дисульфидных связей, образованных взаимодействием остатков цистеинов. Для преодоления этой сложности используется дериватизация, поиск специфических серий ионов или он-лайн восстановление S-S связи. 5. Присутствие в последовательности пептидов амфибий изобарных (лизин/глутамин, фенилаланин/окисленный метионин и т.д.) и изомерных (лейцин/изолейцин) аминокислот. Проблема идентификации изобарных аминокислот решается использованием масс-спектрометрии высокого разрешения, изомерных - применением существующих методов тандемной масс-спектрометрии или химической дериватизации. 6. Циклизация коротких пептидов. В результате взаимодействия “голова-хвост” происходит образование циклического иона, который в дальнейшем может фрагментировать по любой пептидной связи, приводя к скрамблингу. Наиболее надежным способом решения этой проблемы является химическая дериватизация N-аминогруппы пептидов. Использование приборов ионного циклотронного резонанса и орбитальных ловушек решает перечисленные выше проблемы масс-спектрометрического секвенирования пептидов, за исключением циклизация и раскрытия дисульфидных связей. Именно поэтому поиски новых дериватизующих агентов или альтернативных методов инициирования распада по-прежнему являются актуальными задачами протеомики. Наиболее же интересной фундаментальной проблемой, где масс-спектрометрии требуется поддержка альтернативного метода (деградация по Эдману), является различие изомерных лейцина и изолейцина. Деградация по Эдману существенно замедляет и удорожает работу, а из-за высоких требований к чистоте и количеству образца значительную часть компонентов в сложных пептидных смесях изучить не удается. Решение проблемы дифференции изомеров по-прежнему крайне актуально, поскольку это позволило бы проводить полное секвенирование белков, триптических и нетриптических пептидов исключительно масс-спектрометрическим путем без привлечения дополнительных методов. В настоящее время актуальной задачей является создание комплексного масс-спектрометрического метода, позволяющего преодолеть все перечисленные сложности масс-спектрометрического de novo секвенирования. Новизна настоящего проекта связана с созданием именно такого, исключительно масс-спектрометрического метода секвенирования самых разнообразных нетриптических пептидов в сложных природных смесях. Метод должен быть быстрым, надежным, чувствительным и применимым для работы с пептидными смесями. Кроме того, метод должен позволить оценивать тип потенциальной биологической активности новых полипептидов амфибий [K.A. Artemenko, A.R. Zubarev, T.Yu. Samgina, M.M. Savitski, A.T. Lebedev, R.A. Zubarev. Two Dimensional Mass Mapping as a General Method of Data Representation in Comprehensive Analysis of Complex Molecular Mixtures. Anal. Chem., 2009, 81, 3738–3745; T.Yu. Samgina, V.A. Gorshkov, K.A. Artemenko, E.A. Vorontsov, O.V. Klykov, S.V. Ogourtsov, R.A. Zubarev, A.T. Lebedev. Peptides, 2012, 34, 296-302].

Ожидаемые результаты
В результате реализации проекта планируется получить следующие результаты: 1. Разработка надежного протокола выделения и сохранения пептидома, получаемого из кожного секрета амфибий. 2. Установление аминокислотных последовательностей нескольких сотен новых природных биологически активных пептидов амфибий, обитающих на территории России, Словении, Кубы. 3. Создание автоматизированного масс-спектрометрического метода идентификации изомерных лейцина и изолейцина при секвенировании пептидов. 4. Создание новых дериватизующих агентов для предотвращения циклизации ионов пептидов в источнике масс-спектрометра и для надежного разрушения дисульфидных связей в структуре пептидов. 5. Создание надежно работающего алгоритма полного сиквенирования природных нетриптических пептидов комплексом методов масс-спектрометрии. 6. Установление межвидовых и межпопуляционных различий пептидного профиля земноводных. Созданный в рамках предлагаемого исследования метод полного масс-спектрометрического секвенирования природных нетриптических пептидов может быть использован в любых исследовательских лабораториях, имеющих дело с пептидными объектами любого происхождения. Разработанный в рамках данных исследований алгоритм масс-спектрометрической дифференциации изомерных лейцина и изолейцина может быть включен в автоматизированные программы секвенирования скорострельной протеомики, что позволит использовать их в научных лабораториях, а также в клиниках по всему миру. Запланированные иследования будут проведены на современном мировом уровне. Результаты будут докладываться на Международных научных форумах и публиковаться в наиболее высокорейтинговых международных журналах индексируемых в базе данных «Сеть науки» (1 и 2 квартили Web of Science) (3-4 статьи в год).


 

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ


Аннотация результатов, полученных в 2021 году
За отчетный период 2021 года в рамках выполнения проекта «Создание масс-спектрометрического метода полного de novo секвенирования интактных природных биологически активных пептидов земноводных» под руководством Самгиной Т.Ю удалось провести несколько разнонаправленных исследований в области изучения пептидного состава кожных секретов различных лягушек. Были начаты работы по оптимизации процесса выделения кожного секрета земноводных для максимального выхода биоактивных пептидов и нейтрализация энзимов на примере секретов лягушек Rana ridibunda и Rana lessonae, у которых ингибирование эндопротеаз осуществляли метанолом, соляной кислотой, а также фенилметилсульфонил фторидом. Полученные данные методом высокоэффективной жидкостной хроматографии–масс-спектрометрии высокого разрешения (ВЭЖХ-МСВР) в режимах полного сканирования и тандемной масс-спектрометрии показали, что количество обнаруженных интактных пептидов в образцах, полученных обработкой кожных секретов соляной кислотой и метанолом было невелико и отличалось несущественно, тогда как количество протеолитических форм для обоих вариантов обработки было более 100. Пока что предварительно полученные результаты не позволили выявить однозначно лучшего подхода для ингибирования эндопротеаз, и исследование данного вопроса требует новых экспериментов. Была проведена работа по выявлению изменений в кожном пептидном секрете в условиях патогенного бактериального воздействия на травяных лягушек Rana temporaria. В работе использовались штамм 13267 Micrococcus luteus и непатогенный тестовый штамм 209-P Staphylococcus aureus. Оба вида относятся к грамположительным бактериям. Бактерии M. luteus присутствуют в нормальной флоре кожи млекопитающих, а отдельные штаммы Staphylococcus aureus могут быть опасны и для человека. Общая длительность эксперимента составила 62 дня, за которые пятикратно были получены кожные секреты спинных желез. Собранные секреты трех особей различались тем, что для контрольной лягушки (К) они отражали её реакцию на длительность содержания в неволе и стрессовое воздействие водной среды (стресс «неволи в водной среде»), тогда как экспериментальные особи Э1 и Э2 испытывали дополнительное воздействие микроорганизмов. Были изучены вариации уровней нескольких десятков пептидов. Наиболее любопытные зависимости зарегистрировали для бревинина-2Т, бревинина-2Те, бревинина-1Та, бревинина-1Т и бревинина-1Тb, а также ряда пептидов из семейства темпоринов. К сожалению, полученные результаты не позволили сделать надежных выводов о влиянии использованных микроорганизмов на секретирование конкретных пептидов в связи с разнонаправленностью колебаний секретирования пептидов вне зависимости от контакта с бактериями или физического состояния особи. Например, у контрольной лягушки в течение пяти недель шло 16-ти кратное падение пептида бревинина-1Та. Контакт с бактериями S. aureus в низкой концентрации активизирует его синтез, но при тысячекратном увеличении концентраций бактерий S. aureus доля бревинина-1Та в секрете особи Э1 возросла только втрое. У второй же экспериментальной лягушки Э2 такого возрастания не произошло, а отмечалось падение его выработки. Аналогичные наблюдения были сделаны и для других пептидов, для которых были зафиксированы количественные изменения Были изучены пептидомы Кубинского эндемичного вида древесной квакши Osteopilus septentrionalis и лягушки Rana temporaria из Словенской популяции. Для кубинской лягушки были установлены сиквенсы шестнадцати новых анионных (отрицательно заряженные при физиологических значениях рН) пептидов двух новых семейств: септенинов 1 и септенинов 2, для большинства которых характерно проницание мембран патогенных клеток под острым углом. Полученные в работе расчетные значения гидрофобности, гидрофобных моментов и α-спиральности септенинов 1 и септенинов 2 на основании установленных их сиквенсов свидетельствуют, что большинство из них потенциально могут обладать свойствами наклонно-ориентированных пептидов и проявлять бактерицидную активность. Для словенской лягушки удалось идентифицировать 60 пептидов, в число которых вошли 6 новых пептидов, относящихся к уже известным классам: 5 темпоринов и один бревенин 1. Сравнение пептидома с ранее изученным для Rana temporaria из Подмосковной популяции позволяет предлагать эти пептиды в качестве таксономических маркеров – пептидов, появляющихся или исчезающих из кожного секрета лягушек, относящихся к одному виду, но разным популяциям, из-за отличающихся факторов внешней среды, хищников и окружающих микроорганизмов. В случае исследованной лягушки наибольшие изменения коснулись секретируемых темпоринов – пептидов, обладающих широкой активностью в отношении грамположительных и грамотрицательных бактерий, грибков и вирусов. Количество темпоринов в секрете обеих лягушек практически одинаково: 13 в случае Подмосковной особи и 14 в случае Словенской, но лишь 9 из них общие для обеих популяций. Предполагаемые активности новых пептидов оценены с помощью 2D-карты – графика, построенного в координатах нормализованный дефект масс (NMD, ось Х) нормализованный изотопный сдвиг (NIS, ось Y), разработанной нами ранее. В результате сравнения всех известных последовательностей темпоринов была предложена таблица возможных замен аминокислот в их структурах. Такая таблица представляет собой удобный прогностический инструмент при анализе новых пептидов, позволяя предполагать соответствующие замены определенных аминокислот в конкретных положениях последовательностей. Были оптимизированы нормализованные энергии соударений для работы с кожными пептидами амфибий в режимах диссоциации инициированной соударениями и диссоциации инициированной соударениями при повышенной энергии. Продемонстрирована эффективность подхода МС3 - ДПЭ-ДАСПЭ для идентификации изомерных остатков лейцина и изолейцина. Тем не менее следует подчеркнуть, что при отсутствии первичного иона z-серии метод не работает. Необходимо проработать возможность варьирования условий первой стадии фрагментации, а именно условий диссоциации при переносе электрона. Сравнение результатов ручного секвенирования с автоматическим с помощью программного обеспечения PEAKS Studio X Pro показало, что программа позволяет с высокой степенью достоверности устанавливать последовательности коротких пептидов, особенно в случае структур, богатых лизинами, однако для длинных дисульфидсодержащих пептидов результаты автоматизированного секвенирования оказываются значительно хуже.

 

Публикации

1. - Ученые МГУ нашли способ определять родину лягушек по их слизи Интернет издание "Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова (официальный сайт)", - (год публикации - ).

2. - Ученые нашли способ определять родину лягушек и получать в перспективе лекарства из их слизи Интернет издание "Naked-science.ru", - (год публикации - ).

3. - Ученые нашли способ определять родину лягушек по их слизи Интернет издание "Официальный сайт Российского Научного Фонда (РНФ)", - (год публикации - ).

4. Самгина Т.Ю., Васильева И.Д., Ковалев С.В., Требше П., Торкар Г., Сурин А.К., Зубарев Р.А., Лебедев А.Т. Differentiation of Central Slovenian and Moscow populations of Rana temporaria frogs using peptide biomarkers of temporins family Analytical and Bioanalytical Chemistry, номер 413, стр. 5333-5347 (год публикации - 2021).

5. Толпина М.Д., Васильева И.Д., Самгина Т.Ю. Современные подходы к масс-спектрометрическому de novo секвенированию нетриптических пептидов ранидных и хилидных амфибий Масс-спектрометрия, т. 18, № 3, стр. 140-169 (год публикации - 2021).