Аннотация результатов, полученных в 2021 году
Сформирована представительная выборка препаратов ГВ различного происхождения (уголь, пелоиды, почва, торф, лигнин, речная вода) и фракционного состава (нефракционированные препараты, гуминовые кислоты (ГК), фульвокислоты (ФК), гиматомелановые кислоты (ГМК)), охватывающая практически все хемотипы соединений, присутствующих в природных гуминовых системах. Молекулярный состав сформированной выборки ГВ охарактеризован как качественно, так и количественно методом МС ИЦР ПФ. Найдены характерные различия между молекулярными составами ГВ различного происхождения и различного фракционного состава Выполнено препаративное фракционирование гуминовых, гиматомелановых и фульвокислот угля, торфа и пелоидов методом твердофазной экстракции (ТФЭ) по полярности и по кислотности. Получена широкая выборка узких фракций ГВ (около 80 препаратов), которые проанализированы методом МС ИЦР ПФ. Для узких фракций ГВ рассчитаны дескрипторы молекулярного состава, отвечающие основным хемотипам биологически активных соединений, входящих в состав молекулярного ансамбля ГВ. Выявлено закономерное изменение молекулярного состава узких фракций ГВ: с ростом полярности элюента и рН среды: наблюдалось увеличение доли окисленных фрагментов, таких как гидролизуемые танины и углеводы, в то время как падала доля низко-окисленных конденсированных танинов и фенилизопропаноидов, а также терпеноидо-подобных соединений. Рассчитан пул дескрипторов молекулярного состава в виде 20-мерных векторов, описывающих плотность заселенности диаграмм ван Кревелена. Показана применимость данных дескрипторов для определения степени подобия (попарные коэффициенты корреляции) каждого набора фракций. Как и ожидалось, наиболее подобны друг другу оказались соседние фракции, а с увеличением разрыва в кислотности/полярности подобие фракций заметно снижалось. Во многих случаях удалось добиться высокой степени разделения молекулярных составов ГВ методом ТФЭ: коэффициент корреляции между фракциями при увеличении разницы в кислотности/полярности стремился к 0. Качество разделения может быть и далее улучшено применением методов 2D-фракционирования. Найдены и опробованы оптимальные условия для препаративного выделения фракций методом эксклюзионной хроматографией. Для этой цели выполнен целый блок фракционирования на аналитических и полупрепаративных колонках. Большое внимание уделено подбору буфера. Впервые были получены фракции, являющиеся результатом 2D фракционирования следующим образом: 1) фракционирования методом ТФЭ по кислотности; 2) фракционирования эксклюзионной хроматографией. Широкий пул полученных фракций с различной молекулярной массой был охарактеризован методом МС ИЦР ПФ. Это позволило установить наличие характеристичной взаимосвязи между молекулярной массой и доминирующим структурным типом компонентов ГВ: наибольшее содержание ароматических структур совпадает с максимумом молекулярно-массового распределения. Для наборов полученных узких фракций были зарегистрированы и обработаны спектры поглощения в УФ и видимой областях (более 100 спектров). Были рассчитаны дескрипторы спектров поглощения, связанные с такими параметрами как степень гумификации, средний размер молекулы и длина и степень взаимодействия в цепочке хромофоров/флуорофоров. Установлена взаимосвязь этих оптических дескрипторов с полярностью/кислотностью фракций. Кроме того, был выполнен начальный блок изысканий по поиску взаимосвязи между флуоресцентными свойствами фракций и их молекулярным составом. Были получены 3D-матрицы возбуждения-эмиссии флуоресценции и рассчитаны коэффициенты асимметрии полосы флуоресценции, которые позволили установить связь между полярностью фракции и коэффициентом асимметрии (аналог индекса гумификации). Изучение молекулярно-массового распределения фракций показало более узкие ММР по сравнению с исходными препаратами и меньшие значения средних молекулярных масс. Для фракций гумииновых и гиматомелановых кислот угля, разделенных по полярности и кислотности, был получен обширный блок данных по ингибирующей активности по отношению к бета-лактамазам TEM-1, мутантам TEM-1, а также к бета-лактамазе CTX-M типа. Благодаря фракционированию методом ТФЭ удалось выделить фракции, превосходящие по ингибирующей активности исходные препараты ГВ. Наибольшую ингибирующую активность проявляли фракции с наименьшей полярностью/кислотностью. Установлена решающая роль вклада конденсированных таннинов (флавоноидов) и лигнин-подобных соединений в молекулярный состав ГВ для достижения максимального ингибирующего эффекта. Установлено наличие синергетического эффекта между узкими фракциями ГВ и сульбактамом по отношению к бета-лактамазе TEM-1. Разработан подход для оценки подобия молекулярных составов гуминовых веществ, основанный на переходе в 20-мерное пространство путем расчета заселенности диаграммы ван Кревелена. Разработан алгоритм и программное обеспечение для обработки данных масс-спектрометрии ИЦР ПФ гуминовых веществ, включая расчет 20-мерных векторов, и их применение для установления количественных взаимосвязей «молекулярный состав - биологическая активность». Построены прогностические модели «молекулярный состав – анти-ВИЧ активность» для узких фракций ГМК с известными молекулярными составами, которые показали ведущую роль конденсированных таннинов (флавоноидов) не только для беталактамазной, но и для анти-ВИЧ активности узких фракций ГВ. Это указывает на перспективность глубокого фракционирования для направленного выделения биологически активных фракций из сложного молекулярного ансамбля ГВ.

Аннотация результатов, полученных в 2022 году
Впервые был получен блок данных по ингибирующей активности в отношении β-лактамаз и по антиоксидантной емкости узких фракций одного и того же препарата ГВ, полученных тремя разными способами: ТФЭ по полярности, ТФЭ по кислотности и эксклюзионной хроматографией по молекулярным массам. Благодаря этим данным было установлено, что, если целевым типом биологической активности является антиоксидантная активность ГВ, наиболее перспективным методом предфракционирования является ТФЭ на картриджах по pH. Причем для сокращения трудозатрат достаточно ограничиться выделением только самых первых, наименее кислотных фракций. Это справедливо и для ингибирующей активности по отношению к бета-лактамазам. На основании данных МС ИЦР ПФ впервые определены молекулярные составы узких фракций одного препарата ГВ, разделенного методами по полярности и рКа и изучено их химическое подобие, которое показало максимальное различие фракций, разделенных по величине рКа методом ТФЭ путем сорбции при понижении рН. Полученный блок данных совместно с данными МСИЦР ПФ был использован для построения количественных соотношений «молекулярный состав-биологическая активность». Сделан вывод о том, что оптимальным методом извлечения компонентов ГВ с максимальной ингибирующей и антиоксидантной активностью является сорбция на ТФЭ картридже при рН 8 и последующее элюирование метанолом. В рамках проекта были обработаны данные по взаимосвязи анти-ВИЧ-активности фракций гуминовых веществ с их молекулярным составом. Это позволило выбрать одну из наиболее активных фракций – гуминовые кислоты пелоидов (ГКП) для проведения последующих экспериментов. В частности, была проверена гипотеза о наличии у ГКП эффекта портманто-ингибиторов (Portmanteau inhibitor), который может проявиться при наличии во фракции комбинации двух или более молекул (или двух активных центров одной молекулу), каждая из которых сама по себе является отдельным типом ингибитора для микроорганизма [Wang Z, Bennett EM, Wilson DJ, Salomon C, Vince R. Rationally designed dual inhibitors of HIV reverse transcriptase and integrase. J Med Chem. 2007 Jul 26;50(15):3416-9. doi: 10.1021/jm070512p. Epub 2007 Jul 4. PMID: 17608468.]. Решение данной задачи непосредственно связано с изучением изомерной сложности и химического разнообразия молекулярного ансамбля ГВ методами масс-спектрометрии высокого разрешения (МСВР), которое является одной из основных целей проекта. Такого рода мультитаргетные лекарственные средства особенно необходимы при лечении ВИЧ/туберкулез и ВИЧ/COVID-19 коинфекций. Обоснованием такому заключение стали результаты ретроспективного эпидемиологического анализа, которые показали что туберкулез является одной из основных причин смертности больных ВИЧ в России. И в первую очередь это связано с появлением мультирезистентных штаммов Mycobacterium tuberculosis. Так, на основании пилотного кросс-секционного эпидемиологического исследования нами установлено, что больные первичным туберкулезом с множественной лекарственной устойчивостью (МЛУ-ТБ) составляют 56,2% больных ВИЧ/туберкулезной коинфекцией. При этом наиболее распространенным при этой коинфекции является ВИЧ-1 субтип B, связанный с передачей через потребителей инъекционных наркотиков. Указанные исследования были опубликованы в статье Frolova, O.P.; Butylchenko, O.V.; Gadzhieva, P.G.; Timofeeva, M.Y.; Basangova, V.A.; Petrova, V.O.; Fadeeva, I.A.; Kashutina, M.I.; Zabroda, N.N.; Basov, A.A.; Belova, E.V.; Zhernov, Y.V.; Mitrokhin, O.V.; Enilenis, I.I.; Severova, L.P. Medical Care for Tuberculosis-HIV-Coinfected Patients in Russia with Respect to a Changeable Patients’ Structure. Trop. Med. Infect. Dis. 2022, 7, 86. https://doi.org/10.3390/tropicalmed7060086. Ввиду актуальности поиска антивирусных средств для ковид-инфекции, нами запланированы исследования анти-COVID-19-активности фракции ГКП. При этом для установления актуального штамма SARS-CoV-2 нами был предварительно выполнен вейвлет-анализ пандемии COVID-19 в Российской Федерации: Anyutin, A.P.; Khodykina, T.M.; Akimova, E.I.; Belova, E.V.; Shashina, E.A.; Shcherbakov, D.V.; Makarova, V.V.; Zabroda, N.N.; Klimova, A.A.; Ermakova, N.A.; Isiutina-Fedotkova, T.S.; Zhernov, Y.V.; Polibin, R.V.; Mitrokhin, O.V. Study of the Deep Processes of COVID-19 in Russia: Finding Ways to Identify Preventive Measures. Int. J. Environ. Res. Public Health 2022, 19, 14714. https://doi.org/10.3390/ijerph192214714. Вейвлет-анализ глубинной структуры пандемии COVID-19 в России выявил четыре внутренних цикла с разными периодами: 3 дня, 8 дней, 20–22 дня и 90–100 дней. Малые циклы в 3 и 8 дней с наложением следующей волны на предыдущую предположительно связаны с изменением штамма SARS-CoV-2. Это будет в дальнейшем нами учтено при выборе изолята SARS-CoV-2 для исследований in vitro анти-COVID-19-активности фракции ГКП. https://istina.msu.ru/projects/359304901/

Аннотация результатов, полученных в 2023 году
В результате проведенных исследований отработаны различные схемы разделения гуминовых веществ и получен пул тонких фракций ГВ с использованием различных подходов: на основе обращенно-фазовой вэсокоэффективной жидкостной графии (ОФ-ВЭЖХ), твердофазной экстракции (ТФЭ), и осаждения при различных рН. Каждый подход обладает своими преимуществами и ограничениями. Разработанная методика ОФ-ВЭЖХ позволяет препаративно разделять фульвокислоты и при этом использует изопропиловый спирт, гораздо менее токсичный органический растворитель, чем метанол и ацетонитрил. Проведено дальнейшее совершенствование алгоритмов обработки масс-спектров высокого разрешения для гуминовых веществ. В частности, разработан фильтр шума спектров МСВР на основе алгоритма машинного обучения Gaussian Mixture Models. Он преодолевает недостатки ранее опубликованных алгоритмов, использующих гистограмму интенсивностей для оценки уровня шума. Предложенный алгоритм работает непосредственно с данными и исключает работу с гистограммами. На основании измерения суммарной антиоксидантной емкости показано планомерное увеличение значений суммарной активности антиоксидантных центров для ВЭЖХ фракций ФК. Для фракций, выделенных с помощью ТФЭ показан существенный эффект ингибирования беталактамазы. Проведено исследование противомеланомной активности препаратов ГВ по средствам механизма ингибирования микроРНК опухоли. Установлено, что фракция гиматомелановых кислот статистически значимо снижает экспрессию микроРНК miR-150-5p и miR-155-5p в клеточной культуре человеческой меланомы MelCher. Для фракции ГК такая активность определена только для снижения miR-155-5p по сравнению с контролем. Таким образом, нами впервые оценена эффективность применения гуминовых веществ пелоидов по механизму ингибирования микроРНК клеток меланомы В ходе проведения дерепликации молекулярного состава наиболее активной фракции CHI-рH8 и восстановления их 2D-структур по SMILES получили 41 структуру, данные об ингибирующей активности β-лактамазы TEM-1 которых присутствовали в базе данных ChEMBL, и получены лиганды гуминоподобных веществ. Проведен молекулярный докинга ряда молекул, обнаруженных во фракциях ГВ и β-лактамаз ТЕМ-1 и ТЕМ-18.