Аннотация результатов, полученных в 2021 году
В ходе выполнения проекта были выполнены четыре основные задачи: поставлен эксперимент по выявлению минимальной дозы церкарий, который ведет к развитию морфологических аномалий у зеленых лягушек (на примере прудовой лягушки, Pelophylax lessonae) (1); проведены эксперименты по заражению восьми видов бесхвостых амфибий с целью определения селективного воздействия метацеркарий Strigea robusta на развитие головастиков разных видов амфибий, в т.ч. и принадлежащих разным таксономическим группам (2); проведено сравнение морфологических деформаций у тех видов амфибий, у которых наблюдалось развитие аномалий (3); был собран и аннотирован de novo транскриптом развивающихся почек конечностей Pelophylax ridibundus с целью дальнейшего определения дифференциальной экспрессии генов. При проведении дозо-зависимого эксперимента по выявлению минимальной дозы, индуцирующей аномалии у головастиков зеленых лягушек было выявлено, что аномалия P присутствует во всех экспериментальных группах головастиков за исключением контроля. Часть особей (19,6 %) имели тяжелые случаи аномалии Р, тогда как у остальных обнаружена полидактилия (33,3 %), представляющая собой от одного до четырех дополнительных пальцев на задних конечностях. Число церкарий, сформировавших цисты у головастиков составило 50,9% (221 из 434 церкарий), т. е. практически каждая вторая церкария прижилась в головастиках. В ходе эксперимента было выявлено, что легкая форма аномалии может проявляться даже при воздействии двух церкарий. При этом у таких особей число пальцев не превышало 6 на задних конечностях, на передних конечностях полидактилия не наблюдалась. Тяжелая форма может развиваться даже при минимальных воздействиях 2-х (инверсия конечностей) и 4-х церкарий. Фенотип тяжелой формы включал в себя полидактилию, инверсию конечностей, выросты и брахимелию. Обнаружено также, что цисты локализуются одинаково как справа, так и слева. Локализация цист наблюдается преимущественно в области задних конечностей (25,8%), хвоста (22,6%), а также головы (20,4%), и реже встречается на спине (11,3%), боках (15,4%) и передних конечностях (4,5%). С целью изучения влияния Strigea robusta на развитие головастиков разных видов амфибий, принадлежащих разным таксономическим группам, было исследовано 702 головастика 8 видов бесхвостых амфибий (112 Rana arvalis, 70 Rana temporaria, 70 Xenopus laevis, 120 Bufotes baturae, 150 Bufo bufo, 60 Bufotes viridis, 30 Dyscophus antongilii, 90 Pelophylax lessonae). Все они были разделены в 41 экспериментальную группу с определенным вариантом заражения, либо его отсутствием (контроль). Аномалия Р проявлялась у всех трех исследованных видов жаб (Bufo bufo, Bufotes baturae, Bufotes viridis) и ее встречаемость (преимущественно полидактилии) варьировала от 19 до 78%. Особи с тяжелыми формами аномалии Р встречались во всех испытуемых группах (3,7–8,0%). Несмотря на наличие цист у развивающихся головастиков бурых лягушек рода Rana (Rana arvalis, Rana temporaria), ни один из головастиков, находящихся под экспериментом, не имел никаких отклонений в морфологическом облике. Выживаемость головастиков варьировала от 36 до 93%; 57% в среднем для Rana arvalis и 77% для Rana temporaria. Ни у одной из наблюдаемых экспериментальных личинок шпорцевых лягушек Xenopus laevis и лягушек-помидоров Dyscophus antongilii также не наблюдались аномалии развития. Таким образом, в ходе наших исследований был найден селективный эффект воздействия метацеркарий Strigea robusta на развивающихся головастиков бесхвостых амфибий – результат, отличающий данный вариант индуцированных трематодами деформаций у амфибий от известного в Северной Америке варианта деформаций, индуцированных Ribeiroia ondatrae, вызывающей развитие дополнительных конечностей (полимелия) у всех видов хвостатых и бесхвостых амфибий. Трематода Strigea robusta имеет воздействие на развитие конечностей головастиков зеленых лягушек рода Pelophylax (P. ridibundus, P. lessonae, P. esculentus) и жаб родов Bufo (B. bufo) и Bufotes (B. viridis, B. baturae). Наблюдаемые деформации были очень близки к проявлениям аномалии Р у зеленых лягушек рода Pelophylax. У них были серьезные или незначительные пороки развития на задних и передних конечностях. У некоторых полидактильных особей было 6-7 пальцев на задних и 5 пальцев на передних конечностях. В тяжелых случаях аномалии Р у жаб отмечались инверсии задних конечностей (таумелия), опухолевидные образования, полидактилия, брахимелия. При небольших дозах церкарий развиваются полидактилии. Тяжелые случаи аномалии P включают в себя инверсию задних конечностей (таумелию), укорочение задних конечностей (брахимелия), за редким исключением сопровождаемые увеличенным числом пальцев (полидактилия), а также дополнительные дистальные фрагменты конечностей в ингуинальной области, опухолеобразные выросты, костяные выросты и геморрагии в области задних конечностей. Полученные нами результаты на серой жабе и прудовой лягушке, вероятно, свидетельствуют в пользу индивидуального иммунного ответа головастиков, которым можно объяснить высокий уровень межгрупповой изменчивости, наблюдаемый в экспериментах (помимо влияния дозы церкарий, прижившихся метацеркарий и их локализации). Сборка и аннотирование транскриптома развивающихся конечностей головастика озерной лягушки Pelophylax ridibundus позволила получить 1 022 972 прочтений, общая длина которых составила 548 954 323 п. н. Общее количество генов, найденное с помощью программы gVolante составило 3354, из них полное прочтение затронуло 3024 гена (90.16% от общего количества генов), частичное - 3141 (93.65%), число неопознанных ядерных генов составило 213 (6.5%). Наибольший прочитавшийся фрагмент включал в себя 24488 п.н., тогда как наименьший – 176 п.н., средняя длина сиквенсов составила 537 п.н., медиана – 306 п.н. Общее число прочтений, имеющих длину более 1000 п.н. составило 98 981 (9.7% от общего числа прочтений), более 10000 п.н. – 425 сиквенсов. GC-состав оказался равен 44.24%. Наибольшее сходство исследованного транскриптома наблюдается с Lithobates catesbianus (24%), Xenopus tropicalis (17%), Leptobrachium leishanense (14%), Xenopus laevis (8%). Было выявлено 37 генов, ассоциированных с морфогенезом пальцев, и 91 ген, ассоциированный с морфогенезом передних и задних конечностей. Полученные результаты по аннотации транскриптома послужат важной базой для выравнивания транскриптома и анализа экспрессии генов при развитии почки конечностей головастиков как в норме, так и при воздействии метацеркарий Strigea robusta, запланированного на следующий год выполнения проекта. Ссылки на СМИ: 1) Ученые ТюмГУ реализуют проекты на гранты Российского научного фонда https://t-l.ru/306938.html 2) Вебсайт "Ранариум", страничка "Anomalie P": http://www.ranaesc.ru/index/index.html

Аннотация результатов, полученных в 2022 году
В ходе экспериментов по заражению головастиков зеленых лягушек обнаружено, что все три таксона (Pelophylax ridibundus, P. lessonae и P. esculentus) не имеют специфических особенностей заражения трематодой Strigea robusta, головастики имели схожие деформации при дозах в 16, 32 и 48 церкарий, частота встречаемости аномалий (полидактилии и тяжелых вариантов аномалии P) не различалась между видами. Аномалий развития у головастиков Bombina orientalis, Ranoidea caerulea, Triprion petasatus, Scinax ruber, Rhinella marina найдено не было. Таким образом, была показана новая специфичность воздействия трематоды Strigea robusta на головастиков амфибий. Отмечено присутствие некоторых других аномалий развития, таких как метаморфический отек брюшной полости (Ranoidea caerulea, Triprion petasatus), геморрагический отек в области оперкулярной камеры (Ranoidea caerulea), а также была найдена бифуркация хвоста и амелия у Triprion petasatus, вызванные, по всей видимости, другими факторами. Выживаемость головастиков амфибий, подвергнутых воздействию исследуемого вида трематод, существенно не различалась между разными видами амфибий, составляя 79 – 98%.При этом в головастиках Triprion petasatus, Ranoidea caerulea и Bombina orientalis среднее количество цист составляло было существенно ниже, чем в экспериментах с зелеными лягушками, где этот показатель составлял 4,3 цисты на особь. Вероятно, это связано с существованием резистентности у данных видов к заражению данным видом патогена, позволяющая элиминировать проникающих церкарий и повышать выживаемость по сравнению с головастиками жаб и зеленых лягушек. В ходе отлова зеленых лягушек в популяционных системах, обитающих на севере Среднего Поволжья, также были обнаружены новые очаги с высокой частотой встречаемости аномалии P: была зарегистрирована еще одна точка в Поволжье с тяжелыми формами аномалии и шесть локалитетов со случаями симметричной полидактилии. Встречаемость полидактилии в данных локалитетах варьировала от 0,7 до 20,6%. Тяжелые формы в популяции прудовых лягушек, населяющих водоем из окр. пос. Гусево составляли 3,1%. Получены новые сведения по дифференциальной экспрессии генов в развивающихся конечностях головастиков озерной лягушки, представляющие важную информацию для будущего понимания изменения профиля экспрессии генов развивающихся конечностей при воздействии паразита Strigea robusta.