Аннотация результатов, полученных в 2021 году
В полном соответствии с заявкой, в первый год выполнения Проекта 2021 проводились исследования молекулярных механизмов гидролиза имипенема металло-β-лактамазами подклассов B1 и B3, а также проведена интерпретация экспериментально наблюдаемых различий в восприимчивости цефтриаксона пенициллин-связывающими белками PBP2 из штамма дикого типа и мутантных штаммов, а также при введении искусственных точечных замен. За отчетный период проведено молекулярное моделирование с использованием современных методов, включая комбинированный метод квантовой механики / молекулярной механики (КМ/ММ), метод молекулярной динамики с классическими и КМ/ММ потенциалами, а также методы анализа электронной плотности в стационарных точках поверхности потенциальной энергии и в кадрах молекулярно-динамических траекторий. Важно отметить, что все расчёты с потенциалами КМ/ММ выполнены с гибридными функционалами и в базисах достаточно большого размера (двухэкспонентных с добавлением поляризационных функций), что позволило получить надежные результаты. Проведено детальное изучение механизма реакции гидролиза имипенема в активных центрах бицинковых металло-β-лактамаз L1 и NDM-1. Эти два фермента относятся к подклассам B3 и B1 металло-β-лактамаз, соответственно, и различаются строением активных центров. Основные различия – аминокислотный состав координационной сферы катионов цинка, а также область связывания карбоксильной группы антибиотика с ферментом. Это приводит к различиям в структурах фермент-субстратных комплексов. Для L1 координационная связь между карбонильным кислородом субстрата и катионом цинка составляет 2,4 Å, в NDM-1 это расстояние длиннее более, чем на 1 Å, что значительно ослабляет взаимодействия. Количественной мерой активации карбонильной группы и усиления электрофильности карбонильного углерода субстрата служит атомный индекс Фукуи: его значение в активном центре L1 в два раза превышает таковое в NDM-1. Различия в эффективности активации субстрата проявляются в двукратном увеличении энергетического барьера стадии нуклеофильной атаки. Другое структурное различие L1 и NDM-1 – петля активного центра ферментов. В активном центре L1 находится структурно жесткий и гидрофобный остаток пролина, который взаимодействует с пятичленным циклом имипенема и полностью блокирует протонирование атома углерода антибиотика. В NDM-1 над пятичленным циклом может находиться молекула воды, являясь донором протона при образовании (S)-энантиомера С-протонированного продукта, однако такой процесс происходит с большими барьерами. Таким образом, продукт ферментативного гидролиза имипенема, протонированный по атому азота, является основным для NDM-1 и единственным для L1. Образование (R)-энантиомера продукта, протонированного по атому углерода, проходит уже после выхода N-протонированного продукта гидролиза в раствор. Преимущественное образование именно этого энантиомера связано с особенностями конформационной динамики гидролизованного имипенема: молекула содержит в себе подвижный «хвост», который может блокировать атом углерода для присоединения протона с той или иной стороны от плоскости пятичленного кольца. Анализ конформационного состава показывает, что наиболее часто атом углерода доступен со стороны, приводящей к образованию (R)-энантиомера. Анализ индексов порядков связей в пятичленном цикле гидролизованного имипенема в молекулярно-динамической траектории с КМ/ММ потенциалами показал, что в большей степени реализуется резонансная форма, способствующая протонированию атома углерода, а не атома азота. Полученные результаты согласуются с недавними спектральными и ЯМР исследованиями. Проведены исследования взаимодействий цефтриаксона с пенициллин связывающими белками PBP2 из штамма дикого типа, мутантных штаммов и ферментов PBP2 с искусственно введенными аминокислотными заменами. Для PBP2 эффективный кинетический параметр k2/Ks, определяющий отношение скорости образования ацил-ферментного комплекса с цефтриаксоном и константы связывания, в 150 раз превышает таковой для PBP2 из мутантного штамма 35/02 и в 2300 раз для PBP2 из штамма H041. Мы провели исследования эффективности активации фермента, а также последующие реакции в активных центрах этих ферментов. Согласно расчетам методом молекулярной динамики с потенциалами КМ/MM, в РВР2 из штамма дикого типа FA19 гораздо лучше формируется оксианионный центр, что проявляется в более коротких длинах водородных связей между атомом кислорода карбонильной группы антибиотика и аминокислотными остатками, формирующими оксианионный центр. В мутантных ферментах наблюдается дестабилизация тетраэдрического интермедиата относительно фермент-субстратного комплекса, что также снижает эффективность протекания реакции. Проанализировано влияние аминокислотной замены в положении 501 в PBP2 из штамма 35/02. Наиболее важным является поведение петли β3-β4. Согласно расчётам, проведенным методом молекулярной динамики с потенциалами КМ/ММ, расстояния между аминокислотными остатками 307 и 501 характеризуют подвижность этой области и определяют k2/Ks: большие значения расстояний относятся к вариантам PBP2, характеризующимся большими значениями k2/Ks. По результатам работы опубликовано 2 статьи (International Journal of Molecular Sciences (Q1 по данным SJR) и Известия Академии наук. Серия химическая) и одна статья проходит рецензирование (Journal of Chemical Informatics and Modeling (Q1 по данным SJR)); результаты работы доложены в 5 докладах на 4 конференциях.

Аннотация результатов, полученных в 2022 году
В соответствии с заявкой, на втором году выполнения Проекта проводились исследования ингибирующей способности органических бороновых кислот, индол и пиррол карбоксилатных соединений по отношению к металло-β-лактамазам, а также аллостерических ингибиторов по отношению к TEM-1. Проведен сравнительный анализ взаимодействий циклических и нециклических борсодержащих ингибиторов и определены причины различающейся ингибирующей активности по отношению к металло-β-лактамазам. Показано, что наибольшее влияние оказывает именно динамическое поведение образующихся комплексов. Для этого проведено моделирование методом классической молекулярной динамики с последующим анализом главных компонент для комплексов NDM-1 c циклическим соединением QPX7728 и нециклическим на основе бензо[b]тиофена. Показано, что нециклический боронатный ингибитор фиксирует гибкую петлю L3 в открытой конформации, что позволяет ингибитору легче покидать активный центр, в то время как для циклических соединений петля L3 на протяжении практически всей молекулярно-динамической траектории замыкается над активным центром. Определен механизм взаимодействия индол и пиролл карбоксилатных соединений с активными центрами металло-β-лактамаз NDM-1 и IMP-1. Показано, что некоторые производные пиролл карбоксилатов способны замещать мостиковый гидроксид-анион в активном центре металло-β-лактамаз. Сравнение кристаллографических структур комплексов с пиролл карбоксилатами и бороновыми ингибиторами показывает схожие мотивы связывания с катионами цинка и каталитическим остатком глютамата. Индол карбоксилаты в активном центре бицинковых металло-β-лактамаз напротив не замещают гидроксид-анион, а образуют с ним водородную связь. Кристаллографические структуры комплексов металло-β-лактамаз с индол карбоксилатами похожи на рассчитанные модельные структуры фермент-субстратных комплексов с β-лактамными антибиотиками. Для определения механизмов аллостерического ингибирования проведено сравнительное классическое молекулярно-динамическое моделирование сериновой β-лактамазы TEM-1 в апо-форме и в комплексе с аллостерическим ингибитором. В полученных траекториях проведен динамический сетевой анализ. Наибольшие отличия связаны с поведением аллостерического сайта, состоящего из С-конца и фрагмента петли Н10. В апо-форме C-конец и часть петли Н10 заключены в одно сообщество, а остальная часть петли H10 отделена в другое сообщество. Это свидетельствует о том, что движения фрагментов аллостерического центра не скоррелированы друг с другом. При добавлении ингибитора Cymal-6 эти два сообщества объединяются в одно за счет взаимодействия с низкомолекулярным соединением. Другой важный структурный элемент системы – Ω–петля, содержащая аминокислотный остаток, проводящий деацилирование в реакции гидролиза антибиотиков. Для обеих исследуемых систем Ω–петля относится к отдельному сообществу, основание петли имеет общие ребра с другими семействами, однако сама петля общих ребер с другими семействами не имеет. В дополнение к поставленным задачам, определены электронные эффекты, влияющие на реакционную способность цефалоспориновых соединений в активном центре металло-β-лактамазы L1. Для этого проанализированы структуры переходных состояний лимитирующей стадии в комплексах с наиболее и наименее реакционноспособными цефалоспоринами. Делокализация неподеленных элетронных пар в данных структурах находится в области фрагмента H…N-C4-C3. Ранее, в рамках данного Проекта было показано, что быстрый гидролиз обусловлен большей локализацией неподеленных электронных пар на атоме N, в то время как в медленно гидролизующихся цефалоспоринах эти неподеленные электронные пары существенно делокализованы по всему фрагменту H…N-C4-C3. На данном этапе работы показано, что за обусловленность локализации неподеленных электронных пар ответственна лабильность дырок Ферми, а одноэлектронные потенциалы показывают, что более высокая локализация неподеленных пар выражается в доминировании статической обменной корреляции в окрестности атома N.