Аннотация результатов, полученных в 2021 году
1. Интерферометрический метод использован для определения аффинности и кросс-специфичности аптамеров к разным вирусам. Для снижения неспецифических взаимодействий все эксперименты проведены в буфере с добавлением твин-20 и БСА. Оптимизация проведена на хорошо изученном объекте, G-квадруплексном аптамере RHA0385, специфичном к вирусу гриппа А. Рассчитана константа диссоциации комплекса аптамер-вирус: KD=1,1±0,3 пM, что соответствует KD=1,1±0,3 нM в пересчете на концентрацию гемагглютинина в вирусе гриппа. Проверено образование сэндвич-подобных комплексов. Показано, что тройной комплекс собирается при последовательном смешении компонентов: сначала на иммобилизованный аптамер садится вирус, затем на вирус садятся наночастицы, покрытые аптамером. Проведен подбор аптамеров к другим вирусам c проверкой их аффинности и селективности. Для каждого вируса был проведен скрининг из трех аптамеров. Предложен набор из пяти аптамеров для пяти вирусов: аденовирус, грипп А, грипп В, SARS-CoV-2 и РСВ. 2. Аптамер BV42 к вирусу гриппа имеет структуру i-мотива. Синтезировано несколько производных аптамера, в которых вместо одного из цитозинов, фланкирующих i-мотив, были введены феноксазиновые группы. Эти группы обладают следующим свойством: при разрушении структуры i-мотива феноксазин депротонируется и выходит из стэккинга, что сопровождается примерно 2-кратным увеличением его флуоресценции. Производное i3 – единственное с частично потушенной флуоресценцией при рН 7.3, т.е. эта часть i-мотива частично сохранна в стандартном PBS. SERS-спектр феноксазина был обнаружены на Рамановском приборе с лазером 633 нм. Значимые изменения обнаружены для аптамера i3. При рН 7 в спектре появляется дополнительный пик при 1050 см-1 в присутствие вируса гриппа А, который отсутствует в контроле и у олигонуклеотидов i4 и i5. А при рН 6 спектры не отличаются, но интенсивность сигналов от образца с вирусом гриппа А в два раза выше, чем в контрольном образце. Таким образом, подобраны условия для нового типа сенсора, в котором детектируется не только сорбция вторичного аптамера, но и изменение его конформации при взаимодействии с аналитом. 3. Были созданы нанопериодические SERS-подложки с различными формами основания столбиков, эффективно работающие на длинах волн лазерного возбуждения 532 и 785 нм. Наноструктуры различной формы (круги, квадраты, прямоугольные полоски, треугольники) были получены с помощью системы электронно-лучевой литографии. Оптимизированы параметры наноструктур. Было показано, что в ближней ИК-области спектра могут быть достигнуты рекордно большие коэффициенты усиления Рамановского рассеяния света, что связано с высокой добротностью плазменных волн в серебре при этих частотах. Установлено, что вклад в эффект SERS в ближней ИК-области кроме плазмонного резонанса обеспечивает геометрический резонанс, возникающий при согласовании размеров диэлектрической структуры и длины волны лазерного излучения. Для разработки оптических аптасенсоров нового типа (работающих при возбуждении лазерным излучением с длиной волны 532 нм) на основе нанопериодических SERS-подложек создавались и сравнивались по усилению структуры в виде массива квадратных и прямоугольных столбиков. Структуры с квадратными основаниями имеют в несколько раз большее усиление сигнала Рамановского рассеяния: – для наноквадратов - 26331 счетов в секунду, для нанополосок – 5332 счетов в секунду. На основе структур с квадратными основаниями с резонансными размерами и периодами (для длины волны лазерного возбуждения 532 нм) были созданы аптасенсоры для детектирования вируса гриппа А. Сенсор представлял собой сэндвич-схему с последовательной инкубацией с тиомодифицированным аптамером, дитиотреитолом, вирусом гриппа А (опыт) или гриппа В (контроль), аптамером с Раман-активным соединением Cyanine-3. Данный сенсор работает, как обратный сенсор, предположительно, из-за того, что первичный аптамер затягивает вирус гриппа А (опыт) в лунки нанопериодической структуры, в результате чего вторичный аптамер с краской отдаляется от основания лунок (от границы раздела Ag/SiO2, на которой возникает гигантское усиление сигнала Рамановского рассеяния). В случае вируса гриппа B (контроль) близи дна лунок остается вторичный аптамер с меткой Cy3, который дает SERS-сигнал. Поэтому с ростом концентрации вирусов относительный сигнал плавно падает. Синтезированы золотые и серебряные коллоидных частицы для работ на 785 нм лазере. Исследовались Нанокоробочки (полые нанокубики) из сплава Au-Ag состава Au9Ag (далее Au9Ag NBxs, гидродинамический диаметр 40-100 нм, λmax ~ 750 - 800 нм, в зависимости от условий получения). Нами также исследовались серебряные НЧ (призмы и пластины, гидродинамический диаметр 40-60 нм, λmax ~ 500 - 800 нм, в зависимости от условий получения). Также нами была оптимизирована методика синтеза новых типов НЧ под 532 нм лазер с красителем, расположенным внутри НЧ между серебряной сердцевиной и золотым покрытием. Растворы свежеполученных НЧ инкубировались в 100 нМ раствором малахитового зеленого (MG). На следующий день НЧ с адсорбированным красителем центрифугировали. Подобраны параметры методики, позволяющие добиться включения MG внутрь частиц. 4. Для исследования были выбраны три трековые мембраны с различными характеристиками. Все мембраны были охарактеризованы с помощью растровой электронной микроскопии. Определялся средний диаметр пор по обеим сторонам и их плотность. Трековые мембраны получали в Лаборатории ядерных реакций им. Г.Н. Флерова Объединенного института ядерных исследований по разработанной ранее технологии. Получение трековых мембран основано на взаимодействии пучка ускоренных тяжелых ионов с полимером. При прохождении полимерной пленки высокоэнергетические многозарядные ионы оставляют зоны деструкции вдоль траекторий бомбардирующих частиц – треки. Далее облученная пленка проходит дополнительно фотоокисление путем воздействия ультрафиолетовым излучением, что позволяет более избирательно проводить разрушение деструктированных областей в полимере посредством последующего химического травления (щелочными растворами для ПЭТФ). Мембраны из ПЭТФ использованы для разработки нового сенсора с рекордно низкой чувствительностью. Сенсор работал следующим образом: наночастицы функционализировали аптамером RHA0385, инкубировали с R687, затем инкубировали с раствором вируса и снимали SERS-спектры. В присутствие вируса гриппа А сигнал от краски снижался, что соответствует разрушению комплекса аптамер-R687 и удалению краски от поверхности наночастиц. Тем не менее чувствительность сенсора не превышала разработанные ранее нами сенсоры. Для улучшения характеристик сенсора была использована фильтрация через ПЭТФ мембрану. Несмотря на потери вирусов, чувствительность сенсора увеличилась в 100 000 раз, достигнув 2 10^-5 HAU/mL, что соответствует 1 000 вирусных частиц в мл и сопоставимо с чувствительность ОТ-ПЦР (300-1200 вирусных частиц в мл). Для создания SERS-активных поверхностей на мембранах использованы ПЭТФ-мембраны, поскольку серебряные наночастицы плохо держались на ПК-мембранах, смываясь в раствор при первом контакте с жидкостью. Тонкие слои серебра осаждались на поверхность трековых мембран с использованием системы вакуумного термического напыления с автоматическим контролем толщины со скоростью напыления 0.4 Å/c. В результате формировались наноостровковые структуры различных форм с различными размерами в плоскости подложки, высотами и зазорами между металлическими кластерами. Продемонстрирована возможность создания серебряных наноостровковых SERS-активных слоев на поверхности пористых трековых мембран из полиэтилентерефталата, оптимизированных под возбуждающее лазерное излучение с длиной волны 532 нм. При использовании магнетронного напыления максимальный коэффициент усиления SERS (K=6*10^6) наблюдался при толщине напыления серебра 10 нм. При использовании метода термического напыления максимальный коэффициент усиления SERS (K=1,5*10^6) наблюдался при толщине напыления серебра 6 нм и отжиге при температуре 120 оС в течение 6 минут.

Аннотация результатов, полученных в 2022 году
Разработано несколько прототипов аптасенсоров определения респираторных вирусов: 1) на основе коллоидных наночастиц с фильтрацией через мембрану 2) твердотельный вариант - использование наноостровковых поверхностей и столбиков, полученных литографией 3) мембранный вариант - с использованием мембраны с SERS-активным слоем, через которую проходят белки и низкомолекулярные примеси, но остаются вирусы и сорбированные на их поверхности аптамеры. Первый вариант был успешно реализован в виде сенсора для определения вируса гриппа А. Сенсор работал следующим образом: наночастицы функционализировали аптамером RHA0385, инкубировали с R687, затем инкубировали с раствором вируса гриппа А. Для улучшения характеристик сенсора была использована фильтрация через трековую мембрану, и затем снимали SERS-спектры. В присутствие вируса гриппа А сигнал от краски снижался, что соответствует разрушению комплекса аптамер-R687 и удалению краски от поверхности наночастиц. Предел обнаружения составляет 10^3 VP/мл. Однако, этот вариант пока не удалось реализовать в виде мультиплексного анализа, поскольку не были найдены аналогичные пары аптамер – Рамановская метка, которые бы разрушались в присутствие аналита. Второй протестированный вариант - наностолбики, полученные литографией. Для этого типа SERS-подложек был использован подход с иммобилизацией на поверхности металла аптамеров с конъюгированным Рамановским красителем. Функционализация наностолбиков, полученных методом литографии дважды меченными аптамерами позволяет определять вирусы гриппа А, RSV, аденовирусы типов 3 и 5. Предел обнаружения сенсоров оценен как 600 VP/мл для вируса гриппа А, 70 VP/мл для аденовирусов типов 3 и 5, 3·10^4 VP/мл для RSV. Пределы обнаружения сопоставимы с ПЦР с обратной транскрипцией (600-1200 VP/мл для вируса гриппа А), при этом возможно создание мультиплексного сенсора с несколькими зонами, функционализированными разными аптамерами. 4 SERS-зоны были выгравированы на одной подложке, разделенные несмачиваемым полимером, что позволило функционализировать их разными аптамерами независимо. Именно этот вариант был использован для создания мультиплексного сенсора. Зоны литографической SERS-подложки инкубировали с одним из аптамеров к вирусу гриппа А / SARS-CoV-2 / RSV / к аденовирусу типов 3 и 5, затем SERS-подложки инкубировали со смесями 2-3 вирусов. Отношение SERS к SEL использовалось в качестве основного параметра для оценки из-за его воспроизводимости от образца к образцу. Этот параметр уменьшался в присутствии вируса-мишени в случаях RBD-1C с SARS-CoV-2, RHA0385 с вирусом гриппа A и H8 с RSV. Аналитический сигнал увеличивался при образовании комплекса ADV-20 с аденовирусом 5-го типа. Граничные значения отношения SERS к SEL были оценены как самые высокие/самые низкие значения в образцах без целевого вируса. Различия между вирусоположительными и вирусотрицательными образцами были статистически значимыми со значениями p-value около 0,99. Разработанный сенсор успешно различил все предложенные смеси вирусов. Аптасенсор имеет минимальную кросс-специфичность, в текущем варианте он обеспечивает только качественную оценку наличия вирусов. Принципиально возможна полуколичественная оценка, что было продемонстрировано для одиночны сенсоров. Дальнейшая оптимизация сенсоров может обеспечить это важное свойство тестовой системы. Третий вариант - с использованием мембраны с SERS-активным слоем, через которую проходят белки и низкомолекулярные примеси, но остаются вирусы и сорбированные на их поверхности аптамеры. Трековые мембраны, покрытые наночастицами Ag/Cr, были функционализированы SH-RHA0385-Cy3 аптамера к вирусу гриппа А. Через мембрану образцы с разным количеством вирусов гриппа А и контрольных биологических жидкостей. В присутствии вируса гриппа А увеличивался ГКР сигнал и флуоресценция. Одна из причин кратного увеличения сигнала – образование агрегатов из вирусов и наночастиц. Интенсивность спектров сначала увеличивается с увеличением концентрации вируса, а затем несколько снижается. Предел обнаружения сенсора – 10 вирусных частиц на мл (VP/мл) вируса гриппа А или 2 VP/мл в образце. Это значение даже ниже, чем предел обнаружения метода ПЦР с обратной транскрипцией (∼10^3 VP/мл). Предложенный принцип работает на вирусах гриппа А и В, a также RSV, и гипотетически может быть использован для создания мультисенсора. Хотя трековые мембраны давали наименьший предел обнаружения, однако, попытки нанести на одну мембрану 3-4 зоны с разными аптамерами пока не увенчались успехом. В связи с этим работающий мультиплексный сенсор на этом принципе не был разработан. Результаты проекта представлены в ряде публикаций: https://scientificrussia.ru/articles/novyj-krasitel-pomog-bystro-i-tocno-vyavit-virus-grippa-i-mikrobnoe-zagraznenie http://www.chem.msu.ru/rus/advances/2022-10-20-virus/ https://poisknews.ru/wp-content/uploads/2022/08/poisk_34-35_20220826.pdf