КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

Номер 18-74-10055

НазваниеАнализ структурных компонентов экзосом молока человека и домашних животных

РуководительСедых Сергей Евгеньевич, Кандидат биологических наук

Организация финансирования, регион Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт химической биологии и фундаментальной медицины Сибирского отделения Российской академии наук, Новосибирская обл

Период выполнения при поддержке РНФ

07.2021 - 06.2023

Конкурс Конкурс на продление сроков выполнения проектов, поддержанных грантами Российского научного фонда по мероприятию «Проведение исследований научными группами под руководством молодых ученых» Президентской программы исследовательских проектов, реализуемых ведущими учеными, в том числе молодыми учеными (30).

Область знания, основной код классификатора 04 - Биология и науки о жизни, 04-208 - Молекулярная биология

Ключевые словаэкзосомы, молоко, везикулы, ДНК, РНК, нуклеиновые кислоты, белки, диагностика

Код ГРНТИ31.27.15

СтатусУспешно завершен

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ

Аннотация
Изучению экзосом молока посвящено около сотни работ, опубликованных в научных журналах. Значительная часть посвящена анализу белков и нуклеиновых кислот экзосом молока. В ходе исследований Проекта 2018 нами были получены интересные результаты, которые свидетельствуют о том, что число белков и нуклеиновых кислот в опубликованных ранее работах может быть чрезмерно преувеличено из-за того, что исследователи работают с недостаточно чистыми препаратами экзосом. Разработанный нами подход [Biochimie Open (2017) 4:61] позволяет получить из больших объемов молока (стартовый объем 1,5 л) препараты экзосом практически не содержащие примесей совыделяющих белков и нуклеиновых кислот [Int Dairy J (2021) 117:104994; Биотехнология (2020) 36:62]. Более того, препараты экзосом после гель-фильтрации не содержат примесей белков-аллергенов (казеин, лактальбумин, лактоглобулин и других), что делает их перспективным средством для доставки терапевтически значимых молекул. В обзоре [Int J Mol Sci (2020) 21:6646] руководителем проекта с соавторами подробно рассматриваются перспективы использования экзосом молока для доставки противораковых препаратов. Десятки статей, опубликованные за последние 5 лет, посвящены использованию экзосом коровьего молока для доставки антоцианов [Cancer Lett (2017) 393:94], куркумина [Pharmaceutics (2020) 12:226], доксорубицина [Carbohydr Res (2020) 493:108032], паклитаксела [Cancer Lett (2016) 371:48], малых интерферирующих РНК [Meth Mol Biol (2018) 1740:187; Cancer Lett (2019) 449:186] в культуры клеток. Использование экзосом коровы имеет определенные недостатки, связанные с их возможность аллергенностью, а также риском передачи прионных заболеваний. Экзосомы, получаемые нами из молока лошади [Biochimie Open (2017) 4:61], не имеют таких недостатков, так как молоко лошади менее аллергенно и не переносит прионы. Последние 20 лет активно изучаются терапевтические олигонуклеотиды, которые рассматривают как инструменты, запускающие в клетке систему РНК-интерференции, деградации мишеней РНКазой Н, изменяющие сплайсинг генов-мишеней, ингибирующие некодирующие РНК, а также активирующие экспрессию определенных генов [Nat Rev Drug Disc (2020) 19:673]. Ряд препаратов на основе терапевтических олигонуклеотидов уже получили разрешение FDA к применению для лечения вирусных и наследственных заболеваний. Вопрос эффективной доставки данных препаратов нельзя назвать решенным, имеющиеся подходы не являются универсальными [Annu Rev Phamacol Toxicol (2019) 59:605]. Использование синтетических мРНК в качестве вакцин до недавнего времени было невозможно из-за нестабильности и низкой эффективности доставки мРНК. В обзоре [Nat Rev Drug Disc (2018) 17:261] мРНК-вакцины названы «новой эрой вакцинологии» и справедливость этих слов всем хорошо известна на примере вакцин Pfizer и Moderna, разработанных в короткие сроки в 2020 году для борьбы с коронавирусной инфекцией. Принципы дизайна мРНК-вакцин, походы для получения мРНК, модификации, приводящие к повышению стабильности РНК, описаны во многих публикациях. Более того, сегодня известны последовательности вакцин BioNTech/Pfizer BNT-162b2 и Moderna mRNA-1273, что позволяет использовать их в качестве «золотого стандарта» для разработки аналогов. Использование экзосом для доставки противовирусных вакцин подробно обсуждается в недавнем обзоре [Biology (2021) 10:94], авторы которого указывает на возможные перспективы разработки клеточных линий, секретирующие экзосомы, содержащие белки-антигены. Решение задач, поставленных в данном проекте, позволит приблизиться к разработке новых способов доставки мРНК-вакцин, терапевтически значимых нуклеиновых кислот и противораковых препаратов in vitro в клетки и in vivo организмы экспериментальных животных с помощью экзосом молока. Имеющийся у коллектива заявителей задел позволит достичь эти цели в обозначенный срок. Запланированные результаты актуальны широкому кругу исследователей в России и за рубежом.

Ожидаемые результаты
1) Результаты нанотрекингового анализа препаратов экзосом молока (определено содержание частиц диаметром, 40–100 нм), для определения стехиометрии загружаемого в экзосомы содержимого и числа экзосом. 2) Результаты определения наиболее эффективного протокола «загрузки» экзосом молока флуоресцентно мечеными короткими РНК, направляющими РНК и мРНК. Результаты МТТ-анализа и системы прижизненной оценки пролиферации клеток xCelligence различных комбинаций доставляемых нуклеиновых кислот и способов «загрузки» экзосом на культурах клеток. 3) Результаты анализа эффективности прототипов различных мРНК-вакцин на лабораторных мышей (ИФА, проточная цитофлуориметрия). Результаты иммуногистохимического и ПЦР-анализа содержания антигена и нуклеиновых кислот в организме иммунизированного животного. 4) Результаты анализа выключения гена MDR под действием малых интерферирующих РНК, доставляемых экзосомами молока в культуру клеток, экспрессирующую MDR-EGFP. Результаты редактирования гена EGFP под действием направляющей РНК. 5) Результаты анализа цитотоксичности противопухолевых препаратов, вводимых совместно с экзосомами молока к культурам клеток линии MCF-7. Результаты анализа размеров ксенографтов опухолей после введения экзосом совместно с противоопухолевыми препаратами. 6) Результаты анализа экспрессии терапевтически значимых генов-мишеней после введения экзосом, «нагруженных» малыми интерферирующими РНК: ПЦР, NGS-секвенирование и секвенирование по Сэнгеру.

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

Аннотация результатов, полученных в 2021 году
1. Последовательными центрифугированиями, ультрафильтрацией через 0,22 мкм, двухкратным ультрацентрифугированием на 100000×g и дальнейшей гель-фильтрацией на сорбенте Ultrogel A4 из молока лошади, человека и коровы выделены препараты экзосом. Проведен анализ экзосом методами нанотрекингового анализа и просвечивающей электронной микроскопии. 2. Проведен анализ доставки мРНК и коротких РНК экзосомами молока в культуры клеток и организм лабораторных животных, а также сопоставление эффективности с препаратами «Липофектамин 3000», «Липофектамин MessengerMAX», «Липофектамин RNAi/MAX» и аналогами. Для оценки эффективности использованы методы проточной цитофлуориметрии, ОТ-ПЦР-РВ и иммуноферментнного анализа (в случае мРНК-вакцины). Показано, что сочетание экзосом молока с 1/10 по объему липофектамина приводит к эффективной доставке. 3. Получен прототип мРНК-RBD-вакцины, проведена иммунизация лабораторных мышей, проведено сравнение иммунизации препаратом RBD и прототипа мРНК-вакцины, доставляемого с помощью липосом и экзосом молока.

Публикации

1. Седых С.Е., Пурвиньш Л.В., Буркова Е.Е., Дмитренок П.С., Рябчикова Е.И., Невинский Г. А. Analysis of peptides and proteins of highly purified horse milk exosomes isolated on anti-CD9- and anti-CD63-Sepharose International Journal of Molecular Sciences, P. (год публикации - 2022)

2. Седых С.Е.,Тимофеева А.М., Кулешова А.Е., Невинский Г.А. Экзосомы молока в качестве агентов доставки терапевтически значимых препаратов при онкологических заболеваниях Успехи молекулярной онкологии, - (год публикации - 2022)

3. Компанеец И.Ю., Ермаков Е.А., Седых С.Е., Невинский Г.А. Antibodies from human milk hydrolyze microRNAs FEBS Open Bio, V. 11, S. 1, P. 122 (год публикации - 2021)

4. Кулешова А.Е., Пурвиньш Л.В., Буркова Е.Е., Седых С.Е., Невинский Г.А. Study of Milk Exosomes Nucleic Acids FEBS Open Bio, V.11, S.1, P. 326 (год публикации - 2021) https://doi.org/10.1002/2211-5463.13205

5. Парамоник А.П. Анализ микроРНК липидной фракции молока коровы Материалы 60-й Международной научной студенческой конференции. Новосибирск, 2022, С. (год публикации - 2022)

6. Пурвиньш Л.В., Ситникова А.И., Седых С.Е. Протеомный анализ экзосом молока лошади - перспективных средств адресной доставки VIII МЕЖДУНАРОДНАЯ НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКАЯ КОНФЕРЕНЦИЯ МОЛОДЫХ УЧЕНЫХ: БИОФИЗИКОВ, БИОТЕХНОЛОГОВ, МОЛЕКУЛЯРНЫХ БИОЛОГОВ И ВИРУСОЛОГОВ - 2021, С. 51 (год публикации - 2021)

7. Седых С.Е., Кулешова А.Е., Пурвиньш Л.В., Невинский Г.А. Human and horse milk extracellular vesicles: proteins and peptides FEBS Open Bio, V.11, S.1, P.326 (год публикации - 2021)

8. Черенко В.А. Экзосомы молока для доставки лекарственных препаратов Материалы 60-й Международной научной студенческой конференции. Новосибирск, 2022, С. (год публикации - 2022)

Аннотация результатов, полученных в 2022 году
Из молока лошади сочетанием методов центрифугирования, ультрацентрифугирования, ультрафильтрации, гель-фильтрации и аффинной хроматографии на сефарозе, содержащей иммобилизованные поликлональные антитела кролика против тетраспанинов CD9 и CD63, получены препараты экзосом, содержащие на своей поверхности оба тетраспанина. Полученные препараты экзосом изучены методом просвечивающей электронной микроскопии и нанотрекинговым анализом. Разработаны протоколы "загрузки" в экзосомы молока лошади после гель-фильтрации препаратов мРНК-вакцин и ДНК-вакцин, при этом достигнуты уровни наработки антител, сопоставимые с таковыми при иммунизации соответствующим рекомбинантным белком. Показано, что экзосомы молока лошади могут быть использованы для доставки в культуру клеток направляющих siRNA против генов-мишеней, что приводит к кратному снижению экспрессии, концентрация siRNA через сутки после трансфекции составляет до 50% от уровня, наблюдаемого через 4 часа, а статистически значимое снижение экспрессии гена наблюдается более 10 дней после трансфекции. Цитостатические препараты доксорубицин, тамоксифен, циклофосфамид, доцетаксел, эупаторин могут быть успешно инкапсулированы в экзосомы молока лошади, что приводит к достоверному изменению экспрессии генов Bcl-2, BAX и р53 в сравнении с неинкапсулированным препаратом, а использование инкапсулированных препаратов позволяет достоверно снизить жизнеспособность опухолевых клеток по сравнению с неинкапсулированными

Публикации

1. Седых С. Е., Пурвиньш Л. В., Буркова Е. Е., Дмитренок П. С., Рябчикова Е. И., Невинский Г. А. Analysis of Proteins and Peptides of Highly Purified CD9+ and CD63+ Horse Milk Exosomes Isolated by Affinity Chromatography International Journal of Molecular Sciences, V.23, P.16106 (год публикации - 2022) https://doi.org/10.3390/ijms232416106

2. Тимофеева АМ, Парамоник АП, Седых СЕ, Невинский ГА Milk exosomes: next-generation agents for delivery of anti-cancer drugs and therapeutic nucleic acids Int. J. Mol. Sci., 2023 (год публикации - 2023)

3. Тимофеева АМ, Парамоник АП, Седых СЕ, Невинский ГА Milk Exosomes: Next-Generation Agents for Delivery of Anticancer Drugs and Therapeutic Nucleic Acids Int. J. Mol. Sci, V. 24, N.12, P.10194 (год публикации - 2023) https://doi.org/10.3390/ijms241210194

4. Парамоник А.П., Седых С.Е., Невинский Г.А. АНАЛИЗ СОДЕРЖАНИЯ МИКРОРНК НА РАЗНЫХ ЭТАПАХ ВЫДЕЛЕНИЯ ЭКЗОСОМ МОЛОКА КОРОВЫ IX Международная конференция молодых ученых: вирусологов, биотехнологов, биофизиков, молекулярных биологов и биоинформатиков, С. 623 (год публикации - 2022)

5. Парамоник АП АНАЛИЗ МИКРОРНК ЛИПИДНОЙ ФРАКЦИИ МОЛОКА КОРОВЫ Материалы 60-й Международной научной студенческой конференции. Новосибирск, 2022, С. 83 (год публикации - 2022)

6. Парамоник АП Анализ эффективности методов загрузки РНК- и ДНК-олигонуклеотидов в экзосомы молока лошади МНСК-2023. Материалы 61-й Международной научной студенческой конференции. Новосибирск, 2023, 2023 (год публикации - 2023)

7. Парамоник АП, Седых СЕ, Невинский ГА MicroRNA of the bovine milk lipid fraction FEBS, V.12, S1, P.276 (год публикации - 2022) https://doi.org/10.1002/2211-5463.13440

8. Парамоник АП, Седых СЕ, Тимофеева АМ, Невинский ГА Analysis of methods for loading therapeutic nucleic acids into horse milk exosomes FEBS Open Bio, - (год публикации - 2023)

9. Парамоник АП, Седых СЕ, Тимофеева АМ, Невинский ГА Analysis of methods for loading therapeutic nucleic acids into horse milk exosomes FEBS Open Bio, v.13, S2, p.228 (год публикации - 2023) https://doi.org/10.1002/2211-5463.13646

10. Седых СЕ, Тимофеева АМ, Черенко ВА, Пармоник АП, Доме А, Антропов Д, Степанов ГА, Невинский ГА Milk exosomes - perspective agents for drug delivery BIOINFORMATICS OF GENOME REGULATION AND STRUCTURE/SYSTEMS BIOLOGY (BGRS/SB-2022) Abstracts the Thirteenth International Multiconference, С. 841 (год публикации - 2022) https://doi.org/10.18699/SBB-2022-490

11. Черенко ВА ЭКЗОСОМЫ МОЛОКА ДЛЯ ДОСТАВКИ ЛЕКАРСТВЕННЫХ ПРЕПАРАТОВ Материалы 60-й Международной научной студенческой конференции. Новосибирск, 2022, С. 97 (год публикации - 2022)

12. Черенко ВА, Парамоник АП, Седых С.Е., Невинский Г.А. Использование экзосом молока для доставки противоопухолевых препаратов в культуры клеток СИНТЕТИЧЕСКАЯ БИОЛОГИЯ И БИОФАРМАЦЕВТИКА. Материалы всероссийской конференции, С. 240 (год публикации - 2022)

13. Черенко ВА, Седых С.Е., Невинский Г.А ДОСТАВКА ЦИТОСТАТИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ В КЛЕТКИ MCF-7 ПРИ ПОМОЩИ ЭКЗОСОМ МОЛОКА ЛОШАДИ OpenBio-2022. IX Международная конференция молодых ученых: вирусологов, биотехнологов, биофизиков, молекулярных биологов и биоинформатиков, С. 699 (год публикации - 2022)

14. Черенко ВА, Седых СЕ, Невинский ГА Использование экзосом молока для доставки доксорубицина в культуру клеток MCF-7 Научные труды X симпозиума "Белки и пептиды", С. 67-68 (год публикации - 2022)

Возможность практического использования результатов
Планируется патентование способа загрузки терапевтически значимых нуклеиновых кислот в экзосомы молока. Данный продукт может быть востребован для доставки ДНК- и РНК-вакцин