Аннотация результатов, полученных в 2021 году
В отчетном периоде мы исследовали роль 3’- нетранслируемой области (3'UTR) генов orb и orb2 в дифференциации половых клеток семенников и яичников дрозофил, участие 3'UTR гена orb2 в нормальном функционировании мозга дрозофил. Orb2 выполняет важные функции во время мейоза и в последующей дифференцировке сперматид. Мы обнаружили, что делеция 3'UTR гена orb2 не оказывает видимого влияния на мейоз сперматоцитов, и 64-клеточные сперматидные цисты формировались без каких-либо опознаваемых дефектов. Мы идентифицировали 2 потенциальных транскрипта-мишени Orb2, участвующих в сперматогенезе. Нарушение авторегуляции гена orb2, вызванное делецией участка его 3'UTR, изменяело экспрессию генов Grip75 и Yuri. Оба гена необходимы для функционирования цитоскелета и образования жгутиков сперматозоидов. Мы предполагаем, что изменение экспрессии Grip75 и Yuri приводит к нарушениям правильной сборки элементов жгутиков, что влечет за собой дефекты поляризации сперматид в линии мух с делецией 3'UTR гена orb2 (orb2R). Мы исследовали влияние генетического взаимодействия атипичной протеинкиназы С (aPKC) с геном orb на дифференциацию ооцитов в яичниках дрозофил. При окрашивании яичников мух антителами к белку Orb, который является маркером дифференцировки ооцитов, мы обнаружили, что присутствие одной копии нуль-мутации aPKC[k06403] на фоне частично функциональной аллели orb-XN/orb-XN приводит к нарушению распределения белка Orb и дифференцировки ооцитов в гермарии. Белок Orb практически полностью исчезает из клеток гермария, и ооциты не дифференцируются. Сходный эффект наблюдался в яйцевых камерах на ранних стадиях оогенеза, где в 100% проанализированных яйцевых камер мы выявили 16 питающих клеток и отсутствие ооцитов. Ранее показано, что мутации aPKC влияют на фосфорилирование белка Orb в яичниках на средних стадиях оогенеза (Barr et al., 2019). При анализе соотношения фосфорилированной и дефосфорилированной форм Orb в яичниках мы не выявили корреляции между снижением уровня фосфорилирования Orb и дифференцировкой ооцитов. Уровень фосфорилирования белка достоверно не менялся при наличии одной копии гипоморфной мутации aPKC[exc55] или нуль-мутации aPKC[k06403] на фоне orb-XN от уровня фосфорилирования в линии orb-XN/orb-XN, хотя присутствие aPKC[k06403] приводило к практически полной стерильности мух. Отсутствие яиц было отмечено также в случае гомозигот по гипоморфной мутации aPKC[exc55] на фоне orb-XN/orb-XN. В этом случае, уровень фосфорилирования был минимальным из всех исследуемых образцов. На основании этого мы делаем вывод, что изменение уровня фосфорилирования Orb не является основной причиной снижения частоты дифференцированных ооцитов в яичниках с частично функциональной аллелью orb-XN. Вентрализация и дорзализация яиц может свидетельствовать как о сниженной функциональности orb, так и о нарушении распределения мРНК и белка Orb в ооците. В яичниках для полиаденилирования и активации трансляции белок Orb, связанный с СРЕ на мРНК, взаимодействует с одной из поли(А)-полимераз (PAP или Wispy, в зависимости от стадии оогенеза), формируя с ними комплекс. Мы предполагаем, что эффективное расстояние от СРЕ до сайта полиаденилирования у дрозофилы отличается от известного расстояния для транскриптов Xenopus laevis (менее 120 нуклеотидов). За отчетный период мы получили 7 линий дрозофил с различными мутациями в 3'UTR гена orb. Наши данные показали, что в линии orb СРЕ-3, в которой удален ближайший к сайту полиаденилирования СРЕ, нарушение полярности яиц происходит с частотой, сходной с таковой у линии мух orb delta CPE, у которой удалены все СРЕ сайты на orb 3’UTR. При этом в линии orb СРЕ-1, в которой удален самый дальний от сайта полиаденилирования СРЕ, частота нарушения полярности яиц была сходна с линией orb 23-1091, в которой присутствуют все СРЕ. Относительно невысокую частоту нормальной полярности яиц в линии orb 23-1091 (57%) мы связываем с тем, что при встройке генетической конструкции по att-сайту между фрагментом orb 3’UTR и сайтом полиаденилирования появляются дополнительные 68 нуклеотидов конструкции. Мы также получили две линии, orb Hpn1 и orb Hpn2, которые содержат по одному сайту СРЕ и составляют около 50% длины последовательности orb 3’UTR. В линии orb Hpn1 91% яиц имели нормальную морфологию, тогда как мухи линии orb Hpn2 были стерильны. Эти данные свидетельствуют о том, что для авторегуляции orb достаточно одного сайта СРЕ, при этом для нормальной локализации мРНК и экспрессии гена orb важны различные цис-регуляторные элементы на 3’UTR и их расположение относительно друг друга, включая вторичную структуру мРНК. В рамках выполнения этого проекта мы оптимизировали протокол для выделения мРНК из разных фракций нейронов. Мы предполагаем, что этот метод позволит нам проводить количественную оценку соотношений мРНК в разных компартментах нервных клеток. Мы проанализировали распределение мРНК orb2 в головном мозге мух дикого типа и в линии мух с делецией 3'UTR гена orb2. На основании полученных результатов по окраске мРНК orb2 в головном мозге дрозофил мы можем сделать вывод о том, что последовательность 3’UTR orb2 важна для локализации мРНК orb2 в зоне синаптических контактов, в частности, в зоне синаптических бутонов клеток Кеньона грибовидных тел дрозофилы. Результатом этой локализации является активация локальной трансляции, что выражается в появлении белка Orb2 в синапсах. У мух линии orb2R не происходит локализация мРНК orb2 и активация трансляции в зоне синапсов, что приводит к нарушениям в процессах активации локальной трансляции мРНК-мишеней белка Orb2 и нарушении формирования долговременной памяти.

Аннотация результатов, полученных в 2022 году
В отчетном периоде мы исследовали роль 3’- нетранслируемой области (3'UTR) генов orb и orb2 в дифференциации половых клеток яичников дрозофил и участие 3'UTR гена orb2 в нормальном функционировании мозга дрозофил. Известно, что дифференцировка ооцитов зависит от количества белка Orb. При низком внутриклеточном уровне Orb зародышевые клетки цист не дифференцируются в ооциты, а становятся питающими клетками. За настоящий отчетный период мы установили, что функционирование белка aPKC, входящего в комплекс белков полярности Par, не влияет на уровень мРНК orb, но снижает уровень белка Orb в яичниках мух. Мы предполагаем, что негативный эффект мутантных аллелей aPKC на генетическом фоне orb-XN/orb-XN обусловлен снижением уровня трансляции Orb по сравнению с orb-XN/orb-XN и, соответственно, снижением частоты появления дифференцированных ооцитов или их полному отсутствию. Наши результаты подтверждают гипотезу о дозозависимом влиянии белка Orb на дифференцировку ооцитов и демонстрируют необходимость генетического взаимодействия orb и aPKC в этом процессе. Мы определили, что белок Orb может взаимодействовать с мРНК, кодирующими белки Par, как это было показано для мРНК aPKC. За отчетный период мы установили, что помимо aPKC Orb взаимодействует с мРНК таких белков комплекса Par, как baz и par-6. Таким образом, получено еще одно подтверждение, что в ходе оогенеза белок Orb взаимодействует с мРНК белков Par, что, вероятно, необходимо для регуляции трансляции этих мРНК и, соответственно, для реализации молекулярных механизмов дифференцировки и поляризации ооцитов. Вентрализация и дорзализация яиц может свидетельствовать как о сниженной функциональности orb, так и о нарушении распределения мРНК и белка Orb в ооците. Мы провели морфометрический анализ яиц мух, гомозиготных по мутантной аллели orb-XN, несущих одну копию мутантной аллели cup8 репрессора трансляции Cup, который должен активировать синтез белка Orb. Наши данные позволяют заключить, что мутантная аллель cup8 не влияет на дорзо-вентральную полярность яиц мух линии orb-XN. В линии orb-XN транскрипция и трансляция белка Orb значительно снижена относительно дикого типа. Мы предполагаем, что введение одной копии мутантной аллели cup8 либо не повышает уровень экспрессии Orb до уровня, необходимого для определения полярности ооцитов, либо на поздних стадиях оогенеза не происходит локализация белка Orb должным образом в линии orb-XN даже при повышении его экспрессии в присутствии cup8. Мы показали, что последовательности СРЕ в 3’UTR orb, с которыми связывается белок Orb, необходимы для стабильности его мРНК. Удаление СРЕ последовательностей приводит к снижению стабильности мРНК orb и нарушению дифференцировки ооцитов в яичниках мух. Во всех трех стерильных линиях при удалении фрагмента 3’UTR c 24 по 1091 нт. в 3’UTR остается одна последовательность СРЕ. По-видимому, одной последовательности СРЕ недостаточно для поддержания стабильности мРНК orb. Нами получены результаты, свидетельствующие о необходимости 3’UTR мРНК orb2 для внутриклеточного распределения белка Orb2 в нейронах головного мозга дрозофилы. Согласно полученным данным, удаленный фрагмент 3’UTR в линии orb2R необходим для того, чтобы белок Orb2 мог быть эффективно транспортирован в зону синапсов. При недостатке белка Orb2 в синапсах нарушается формирование долговременной памяти. Встройка последовательности 3’UTR тубулина вместо удаленного фрагмента 3’UTR orb2R не приводит к восстановлению содержания белка Orb2 в синапсах, долговременная память не восстанавливается. При этом встройка последовательности 3’UTR мРНК другого CPEB белка - Orb, приводит к восстановлению количества белка Orb2 в синаптическом компартменте, а также возможности формирования долговременной памяти. На основании полученных результатов мы предложили модель, согласно которой 3’UTR гена orb2 участвует во внутриклеточном транспорте белка Orb2 в синапсы в составе рибонуклеопротеинового комплекса. Кроме того, Orb2 белок может участвовать в транспорте мРНК некоторых генов-мишеней в зону синапсов (act5C). Однако не все потенциальные мишени белка Orb2 транспортируются в синапс. Попав в синапс, белок Orb2 участвует в регуляции локальной трансляции. В неактивированном состоянии он выступает в роли репрессора трансляции, и снижение его содержания может приводить к активации трансляции некоторых локализованных мРНК (csp, pyd). Этот дисбаланс в локальной экспрессии транскриптов-мишеней Orb2 приводит к невозможности формирования долговременной памяти, нарушение которой наблюдается у мух линий orb2R и orb2tub. В последовательностях 3’UTR orb2 и orb находятся цис-элементы для связывания белков Bruno, Musashi и Pumilio в совокупности со множеством неканонических CPE последовательностей, с которыми связывается Orb2 (количество неканонических СРЕ в линии orb2orb меньше, чем в 3’UTR гена orb2 мух дикого типа, но значительно больше, чем в линиях orb2R и orb2tub). Мы предполагаем, что эти цис-элементы выступают в качестве платформы для сборки комплекса белков, который далее переносится в область синапсов, где происходит его разборка и входящие в его состав белки уже участвуют в регуляции трансляции.