Аннотация результатов, полученных в 2021 году
Мезенхимные стволовые клетки (МСК) из жировой ткани человека были выделены с помощью ферментативной обработки 0,2% раствором коллагеназы. Выделенные МСК имели фибробласто-подобную морфологию и экспрессировали CD-маркеры, специфичные для мезенхимной стволовых. Также данные клетки обладали способностью к направленной дифференцировке в адипо-, остео- и хондрогенном направлениях. Для получения индуцированных мембранных везикул (иМВ) из клеток МСК и SNB-19 был использован цитохалазин В. Для анализа влияния цитохалазина В на везикулы было проведено их сравнение с везикулами естественного (ЕВ) происхождения (без добавления цитохалазина В). Для определения морфологии и размеров иМВ и ЕВ, выделенных из МСК и SNB-19 использовалась сканирующая и просвечивающая электронная микроскопии, которые показали, что везикулы имеют округлую морфологию и размер иМВ МСК в среднем составляет 150 нм, а иМВ SNB-19 около 248 нм. Полученные данные демонстрируют, что иМВ и ЕВ не отличаются размерами друг от друга. С помощью иммуноцитофлуориметрического анализа было показано, что иМВ и ЕВ в большом количестве экспрессируют маркеры везикул CD81 и CD63. Проточная цитофлуориметрия показала, что иМВ МСК несут 1,85% митохондриального компонента, а иМВ SNB-19 несут 2,5% митохондриального компонента. С помощью мультиплексного анализа с использованием набора Bio-Plex Pro Human Chemokine 40-plex Panel (Bio-Rad, США), проведен сравнительный анализ молекулярного состава иМВ, выделенных из МСК и SNB-19. Также проведено сравнение их молекулярного состава с ЕВ и лизатом клеток, из которых они были получены. Было показано, что для 19 аналитов между иМВ МСК и лизате МСК нет статистически значимой разницы в их количественном содержании. Не наблюдалось различий в 29 аналитах между иМВ МСК и ЕВ МСК. Секреция 32 аналитов оставалась без изменений в образцах лизата клеток SNB-19 и иМВ SNB-19, а между иМВ SNB-19 и ЕВ SNB-19 не было разницы в секреции 34 аналитов. Таким образом, были охарактеризованные иМВ МСК и иМВ SNB-19. Был определен размер, проведен анализ основных маркеров, анализ наличия ядерного и митохондриального компонентов и определен молекулярный состав иМВ из различных источников. Далее была проведена оптимизация технологии повышения качества и выхода опухолевых сфероидов с применением иМВ из МСК и опухолевых клеток SNB-19. Культивирование опухолевых сфероидов клеточной линий рака молочной железы MCF-7 и колоректальной аденокарциномы HCT-15 осуществлялось при добавлении разной концентрации иМВ и ЕВ. Окрашивание Annexin V подтвердило, что при добавлении к сфероидам иМВ МСК в концентрации 5 мкг происходит снижение процента жизнеспособных клеток в сфероиде по сравнению с контролем (без добавления иМВ МСК). Добавление иМВ SNB-19 к опухолевым сфероидам приводило к увеличению жизнеспособности опухолевых клеток во всех трех концентрациях. Добавление иМВ МСК к сфероидам MCF7 в концентрациях 5 мкг, 10 мкг, 20 мкг увеличивало их количество. Окрашивание сфероидов Annexin V показало, что концентрация 20 мкг иМВ МСК снижала жизнеспособность опухолевых клеток в данных сфероидах. Добавление иМВ SNB-19 к опухолевым сфероидам MCF7 также увеличивал их количество, однако, концентрация 20 мкг иМВ SNB-19 увеличивала жизнеспособность опухолевых клеток в сфероиде по сравнению с иМВ МСК. Кроме того, нами было показано, что ЕВ МСК и ЕВ SNB-19 также увеличивают количество опухолевых сфероидов MCF7 в суспензии. Таким образом, была проведена оптимизация технологии повышения качества и выхода опухолевых сфероидов с применением иМВ из МСК и опухолевых клеток SNB-19. Было оценено влияние иМВ из МСК и SNB-19 на жизнеспособность опухолевых клеток в сфероидах. Был осуществлен подбор наилучшей концентрации иМВ, которая составила 2 мкг для одиночных сфероидов, культивируемых методом «висячая капля» и 10 мкг для сфероидов, культивируемых в суспензионной культуре. С помощью конфокальной микроскопии было показано, что иМВ, как и ЕВ могут взаимодействовать с опухолевыми клетками HCT-15 и MCF7. Также было подтверждено, что пролиферативная активность клеток в сфероиде увеличивается при добавлении иМВ МСК и иМВ SNB-19. С помощью ПЦР-РВ была показана экспрессия таких генов как OCT4, SOX2, NANOG (гены стволовости или транскрипционных факторов стволовых клеток) и E-кадгерин (E-CAD), N-кадгерин (N-CAD), SLUG, SNAIL (гены эпителиально-мезенхимного перехода (ЭМП)). Было показано, что иМВ МСК влияют на экспрессию гена SOX2 в одиночных сфероидах HCT-15 и на экспрессию генов OCT4 и NANOG в сфероидах в суспензии. При добавлении иМВ SNB-19 увеличивается экспрессия генов OCT4 и SOX2 в сфероидах MCF7, культивировавшихся в суспензии. Увеличение экспрессии мРНК гена SNAIL происходила при добавлении иМВ SNB-19 в одиночные сфероиды. Также статистически достоверная разница в экспрессии гена SLUG по сравнению с контролем наблюдалась при добавлении иМВ SNB-19 к сфероидам в суспензии. Валидация результатов ПЦР-РВ проводилась с помощью вестер-блот анализа. Был проведен транскриптомный анализ уровней мРНК генов N-CAD, E-CAD, SNAIL, SOX2, PTEN, P53, MMP2 в сфероидах HCT-15. Который показал, что есть статистически значимая разница в экспрессии данных генов при добавлении иМВ по сравнению с контролем. С помощью мультиплексного анализа с использованием набора Bio-Plex Pro Human Chemokine 40-plex Panel (Bio-Rad, США), проведен сравнительный анализ секреции цитокинов/хемокинов и факторов роста в опухолевых сфероидах после влияния на них иМВ. Было показано, что при добавлении иМВ МСК и иМВ SNB-19, как в одиночные, так и суспензионные опухолевые сфероиды изменяется секреция таких цитокинов: Eotaxin/CCL11, IFN-gamma, IL-16, MCP-3/CCL7, MIP-3beta/CCL19, TARC/CCL17 и TECK/CCL25 по сравнению с контролем. Таким образом, было подтверждено, что иМВ могут взаимодействовать с опухолевыми клетками в сфероидах, тем самым влияя на экспрессии генов, белков, повышая пролиферативную активность сфероидов. Далее проводили исследование влияния цитотоксичности химиотерапевтических препаратов (цисплатин и паклитаксел) на опухолевых сфероидах, обработанных иМВ в условиях нормоксии (содержание кислорода около 21%) и гипоксии (пониженное содержание кислорода). К опухолевым сфероидам был добавлен цисплатин (CDDP) в концентрации 10 мкг/мл, паклитаксел в концентрации 10 нг/мл (PTX 1) и в концентрации 85 мкг/мл (PTX 2). Результаты MTS-теста показали, что иМВ МСК и иМВ SNB-19 увеличивают пролиферативную активность клеток в сфероидах. При добавлении PTX 2 было показано, что происходит разрушение плотной структуры сфероидов и можно наблюдать только клеточные агрегаты во всех группах. Однако, пролиферативная активность данных агрегатов при добавлении иМВ-SNB-19 была увеличена по сравнению с контролем (без добавления иМВ). Жизнеспособность опухолевых клеток в сфероидах HCT-15 после влияния противоопухолевых препаратов уменьшалась в группе с добавлением PTX 2. Однако, при добавлении иМВ МСК и иМВ SNB-19 жизнеспособность опухолевых сфероидов была выше по сравнению с контролем. Было подтверждено, что экспрессия гена CASPASE 3 была увеличена в контрольных сфероидах, что подтвердилось результатом вестер-блот анализа. Таким образом, были проведены исследования влияния цитотоксичности химиотерапевтических препаратов (цисплатин и паклитаксел) на опухолевых сфероидах, обработанных иМВ в условиях нормоксии и гипоксии, которые показали, что иМВ МСК и иМВ SNB-19 могут играть роль в придании устойчивости к данным препаратам. Информация о публикациях в СМИ, посвященных результатам проекта: 1. https://universmotri.ru/index.php/programms/17-nauka/2710-valeriya-soloveva-chto-predstavlyaet-soboj-personifitsirovannaya-meditsina-nastoyashchego-i-budushchego 2. https://nkckfu.ru/digest/tpost/ccd05yvp81-novie-vozmozhnosti-dlya-skrininga-protiv Таким образом, были выполнены все запланированные работы и выполнены все заявленные научные результаты на конец отчетного периода.

Аннотация результатов, полученных в 2022 году
Биоптаты опухолевой ткани молочной железы были предоставлены ГАУЗ «Республиканский клинический онкологический диспансер Министерства здравоохранения Республики Татарстан имени профессора М.З. Сигала». Из полученных биоптатов в дальнейшем были выделены первичные опухолевые клетки, которые затем были охарактеризованы на представленность специфических маркеров, скорость пролиферации и жизнеспособность. Было отмечено, что полученные биоптаты можно условно разделить на две группы, содержащие (1) опухолевые клетки с высоким пролиферативным потенциалом (скорость пролиферации более чем в 6 раз выше клеток MCF-7) и (2) опухолевые клетки с пролиферацией, сходной с клетками MCF-7. Далее в качестве примера будут рассмотрены два биоптата, различающихся по скорости пролиферации опухолевых клеток, а также эффектами иМВ на опухолевые сфероиды. Первичные опухолевых клетки из биоптатов молочной железы были выделены при помощи коммерческого набора для выделения опухолевых клеток (Кат. №CI00XX, Panomics, США) по методике, рекомендуемой производителем. Выделенные клетки имели фибробласто-подобную морфологию и отличались от морфологии коммерческой опухолевой клеточной линии аденокарциномы молочной железы MCF-7, которые имели эпителиоподобную морфологию. Оценку фенотипа первичных культур опухолевых клеток проводили с помощью проточной цитофлуориметрии. Обнаруживалась экспрессия Ki-67, Bcl2 и p53, а также эстрогенового рецептора (ER). Для анализа пролиферативной активности использовали прибор xCELLigence RTCA DP (Agilent, США). Было показано, что пролиферативная активность клеток биоптата 1 (636.49 ± 56.22%) была значительно выше, чем пролиферативная активность клеток биоптата 2 (238.51 ± 0.39%) и контрольной клеточной линии MCF-7 (принята за 100%). Оценку жизнеспособности первичных культур опухолевых клеток из биоптатов опухолевой ткани пациентов и клеток MCF-7 проводили с использованием проточной цитофлуориметрии (окрашивание Annexin V/PI) и окрашиванием трипановым синим, которые показали, что данные клетки имеют более 90% жизнеспособных клеток. Таким образом, из биоптатов молочной железы человека были выделены опухолевые клетки и проведена характеристика данных клеток. Было показано, что при культивировании сфероидов из клеток биоптатов методом «висячая капля» образуются плотные сфероиды с преобладающей округлой формой. Далее проводили исследования влияния индуцированных цитохалазином B мембранных везикул (иМВ) из мезенхимных стволовых клеток (МСК) и клеток глиобластомы (SNB-19) человека на опухолевые сфероиды, полученные из клеток биоптатов. иМВ из МСК и клеток SNB-19 добавляли в концентрации 66 мкг/мл (данная концентрация выбрана как оптимальная по результатам прошлого этапа работы). Ранее нами было показано, что иМВ, как и естественные везикулы могут поглощаться опухолевыми клетками (Gilazieva, Chulpanova et al. 2022). Это поглощение может привести к изменениям в характеристиках опухолевых сфероидов (Gilazieva, Ponomarev et al. 2022). Было показано, что иМВ из МСК и клеток SNB-19 не влияют на размер опухолевых сфероидов, но могут влиять на жизнеспособность опухолевых клеток в сфероиде. При добавлении иМВ-МСК к сфероидам из опухолевых клеток биоптата 1, процент жизнеспособных клеток составил 94.9 ± 0.5%, в сравнении с контролем (без добавления иМВ) – 90 ± 0.23%. При добавлении иМВ-SNB-19 жизнеспособные клетки составляли 94.9 ± 1.2%. При добавлении иМВ-МСК к сфероидам из опухолевых клеток биоптата 2, процент жизнеспособных клеток составил 84.7 ± 0.21%, иМВ-SNB-19 – 88.8 ± 0.31%. В контроле жизнеспособность клеток сфероидов составила 81 ± 0.8%. Для того, чтобы понять как иМВ влияют на молекулярно-генетические свойства опухолевых сфероидов был определен уровень транскрипции мРНК генов OCT4, SOX2, NANOG (гены транскрипционных факторов стволовых клеток). Данные транскрипционные факторы стволовых клеток играют ключевую роль в регуляции роста опухолевых стволовых клеток (Ponomarev, Gilazieva et al. 2022). Нами было показано, что иМВ из МСК и клеток SNB-19 влияют на уровень транскрипции мРНК генов OCT4 и NANOG у первичных клеток противоположным образом. У сфероидов клеток биоптата 1 уровень мРНК данных генов снижался. У сфероидов клеток биоптата 2 при добавлении как иМВ-МСК, так и иМВ-SNB-19 уровень мРНК данных генов повышался. Далее проводили оценку влияния иМВ из МСК и клеток SNB-19 на изменение чувствительности опухолевых сфероидов, полученных из первичных опухолевых клеток пациентов, к химиотерапевтическим препаратам (цисплатин (CDDP) и паклитаксел (PTX)) с помощью проточной цитофлуориметрии (окрашивание Annexin V/PI). Для этого было необходимо определить полуэффективную дозу (ЭД50) препаратов. Было показано, что ЭД50 сфероидов опухолевых клеток из биоптата 1 составляет 20 мкг/мл для CDDP и 30 мкг/мл для PTX, и является аналогичной для сфероидов опухолевых клеток из биоптата 2. Кроме того, была определена ЭД50 для культуры опухолевых сфероидов, полученных из перевиваемой клеточной линии MCF-7, которая, приблизительно, составила 10 мкг/мл для CDDP и 10 мкг/мл для PTX. Полученные результаты подтверждают, что опухолевые сфероиды из ткани биоптатов более устойчивы к противоопухолевым препаратам, по сравнению со сфероидами клеточной линии MCF-7. После определения ЭД50, мы провели оценку влияния иМВ из МСК и клеток SNB-19 на устойчивость опухолевых клеток биоптатов к противоопухолевым препаратам CDDP (20 мкг/мл) и PTX (30 мкг/мл). Мы обнаружили, что при культивировании с CDDP и при добавлении иМВ-МСК и иМВ-SNB-19 жизнеспособность опухолевых сфероидов из клеток биоптата 1 увеличивалась. У опухолевых сфероидов из клеток биоптата 2 происходило увеличение жизнеспособности опухолевых клеток только в группе с добавлением иМВ-SNB-19. При культивировании сфероидов с препаратом PTX наблюдалась схожая ситуация. Добавление иМВ-МСК и иМВ-SNB-19 увеличивало жизнеспособность опухолевых сфероидов из клеток биоптата 1. Однако, жизнеспособность опухолевых сфероидов из клеток биоптата 2 увеличивалась только при добавлении иМВ-SNB-19. Исходя из полученных данных, можно сделать вывод, что влияние препаратов, а также иМВ на опухолевые клетки может зависеть от особенностей организма пациентов, из которых они были получены. Поэтому создание персонализированных подходов терапии является актуальным. Таким образом, на конец отчетного периода были выполнены все запланированные работы и выполнены все заявленные научные результаты. А именно, были получены и охарактеризованы клеточные культуры из биоптатов опухолевой ткани пациентов. Проведена оптимизация метода культивирования опухолевых сфероидов из первичных культур опухолевых клеток пациентов. Получены уникальные данные сравнительного анализа влияния иМВ из МСК и клеток SNB-19 на формирование и жизнеспособность сфероидов, полученных из первичных опухолевых клеток пациентов, с использованием окрашивания на маркеры апоптоза и оценки размера образовавшихся опухолевых сфероидов. И получены данные по влиянию иМВ из МСК и клеток SNB-19 на опухолевые сфероиды при цитотоксическом воздействии химиотерапевтических препаратов. Информация о публикациях в СМИ, посвященных результатам проекта: https://media.kpfu.ru/news/v-kfu-izuchili-iskusstvenno-sozdannye-vezikuly https://rscf.ru/news/presidential-program/v-kfu-izuchili-iskusstvenno-sozdannye-vezikuly-dlya-adresnoy-dostavki-lekarstv/