Аннотация результатов, полученных в 2021 году
В основе проекта лежит гипотеза о том, что мы можем улучшить чувствительность иммуноаналитических систем, если реакции проводятся не на донышке планшета, как в традиционном иммуноферментном анализе (ИФА), а на поверхности пористой мембраны. Для получения мембран нами был использован метод электроспиннинга (электроформования). Были изготовлены электроформованные мембраны из полилактида (ПЛА), поликапролактона (ПКЛ) и нейлона-6. Все эти мембраны состояли из гладких цилиндрических волокон с диаметрами в субмикронном диапазоне (670 ± 270 нм - ПЛА, 355 ± 165 нм - ПКЛ, 430 ± 190 нм - нейлон-6) без явных дефектов (утолщений или капель). С помощью измерения краевого угла смачивания и времени впитывания капли была оценена гидрофильность мембран в исходном состоянии и после их обработки кислородной плазме. Необработанные полиэфирные мембраны (ПЛА и ПКЛ) проявляли гидрофобные свойства: средние значения их краевых углов смачивания превышали 120°, капля не впитывалась во время наблюдения (100 секунд). Нейлоновые мембраны были гидрофильными - значение краевого угла постепенно уменьшалось с приблизительно 120° до 0° (полное впитывание капли) в течение 50-60 секунд. Плазменная обработка электроформованных мембран значительно улучшала гидрофильность мембран. Для всех типов мембран (ПЛА, ПКЛ, нейлон-6) начальный краевой угол смачивания сразу после обработки составлял менее 60°, а время впитывания капли не превышало 10 секунд. Эффект от плазменной обработки мембран сохранялся спустя сутки. Хорошая смачиваемость мембран благоприятна для разработки сенсора, т.к. она обеспечит однородность адсорбции антител, а также позволит использовать всю толщину мембран, а не только поверхностные слои волокон. С помощью спектрофлуорометрии и флуоресцентной микроскопии была исследована автофлуоресценция использованных полимеров. И для мембран, и для растворов полимеров наибольшая интенсивность автофлуоресценции наблюдалась в диапазоне 400-500 нм при возбуждении 320-400 нм. Соответственно, для флуоресцентной детекции могут быть использованы флуорофоры Cy3 или Alexa Fluor 555, максимумы эмиссии (565-570 нм) и возбуждения (555 нм) которых не входят в указанные диапазоны. Количественно описана способность электроформованных мембран из нейлона-6 адсорбировать антитела класса IgG. Показано, что при концентрации антител в диапазоне 2.5-10 мкг/мл связывающая способность мембран имеет порядок ~100 мкг/г, а доля антител, адсорбированных из раствора, составляет 40-45%. Методом конфокальной лазерной сканирующей микроскопии показано, что адсорбированные антитела более эффективно вымываются с внешних слоев мембраны, чем с внутренних. Начаты работы по созданию иммуноаналитической системы для обнаружения и измерения концентрации интерлейкина 1 бета (ИЛ1б). Оказалось, что многие коммерчески доступные антитела против ИЛ1б не взаимодействуют с нативным ИЛ1б, но взаимодействуют с денатурированным. Для проведения экспериментов по исследованию характеристик иммуноанализа на электроформованной мембране при его проведении в проточном режиме, была спроектирована и изготовлена разборная оправка (держатель) мембраны. Оправка выполнена из поликарбоната, акрилового адгезива и полиэтилентерефталата. Детали изготовлены методом лазерной абляции. Оправка позволит концентрировать аналит вблизи поверхности мембраны путем циклического пропускания пробы через нее.

Аннотация результатов, полученных в 2022 году
На данном этапе был разработан набор методических приемов, которые позволяют улучшить характеристики иммуноаналитических систем – снизить время анализа, уменьшить расход дорогостоящих реагентов (улавливающих антител), повысить чувствительность (увеличить тангенс угла наклона калибровочной кривой). Для обычного ИФА это может быть достигнуто за счет изменения процедуры нанесения улавливающих антител на донышко планшета. Для белкового дот-блоттинга обнаружено, что адсорбция антител на нитроцеллюлозные мембраны может быть увеличена в 15-17 раз за счет обработки мембран в тлеющем разряде (в плазме), причем этот эффект слабо зависит от полярности приложенного напряжения. Усиленная адсорбция антител, в свою очередь, позволяет приблизительно в 10 раз поднять чувствительность иммуноанализа. Расход улавливающих антител, используемых для дот-блоттинга, может быть уменьшен при использовании электроформованных мембран из нитроцеллюлозы вместо фабричных. Показано, что циклическое пропускание пробы через полимерную мембрану повышает адсорбцию аналита, причем это справедливо и для неспецифической адсорбции, и для специфической, которая реализуется при наличии аффинного рецепторного слоя на мембране. Сама по себе возможность концентрирования пробы на мембране является нетривиальным фактом, т.к. размер молекулы аналита значительно меньше, чем характерный размер поры в мембране, и можно ожидать, что молекулы будут проникать через поры, не связываясь с поверхностью. Тем не менее, возможность интенсивной адсорбции аналита на поверхность была продемонстрирована с помощью двух аналитов (бычьего сывороточного альбумина для неспецифической адсорбции и интерлейкина 1 бета для специфического связывания) и двух систем пропускания пробы - герметичной, разработанной на предыдущем этапе, и открытой, разработанной на этом этапе. При циклическом пропускании пробы через мембрану доля аналита, осевшего на мембрану из раствора за время эксперимента, возрастала в 2.8-11.5 раз для неспецифического связывания и в 2.4-3.4 раз для специфического. Для исследования структуры мембран предложена оригинальная методика корреляционной микроскопии, объединяющая сканирующую электронную микроскопию (СЭМ) и лазерную сканирующую конфокальную микроскопию (ЛСКМ). Корреляционная микроскопия СЭМ-ЛСКМ позволяет исследовать одну и ту же выбранную область образца двумя методами последовательно, при этом методы дополняют друг друга и позволяют получить наиболее точную информацию о структуре образца. Предложен оригинальный способ обработки данных для экспериментов, выполненных с помощью корреляционной микроскопии. Разработанная методика и соответствующая процедура обработки данных могут быть использованы для широкого класса образцов со сложной нано- и микроструктурой.

Аннотация результатов, полученных в 2023 году
Пористые полимерные мембраны активно используют в разных видах лабораторных анализов, в том числе в дот-блоттинге и вестерн-блоттинге. Обычно для этого используют мембраны, пористость которых создана с помощью осадителя или соли. В литературе активно обсуждается гипотеза о том, что электроформованные мембраны могут быть более эффективными подложками для иммуноанализов, чем пористые стандартные полимерные мембраны. В то же время, прямой адекватной проверки этого утверждения до настоящего времени не проводилось, и этот методический пробел был восполнен в рамках данного проекта. Мы использовали стандартную коммерческую нитроцеллюлозную мембрану в качестве сырья для изготовления полимерной мембраны с помощью электроспиннинга. Оба типа мембран были протестированы в экспериментах по обнаружению мелатонина в пробах. Прямое сравнение показало, что мембраны обоих типов обеспечили одинаковую чувствительность анализа и ширину динамического диапазона. В некоторых экспериментах анализируемые растворы пропускают через пористые мембраны за очень малое время (порядка ~1 мин), и это радикально меньше, чем характерное время инкубации раствора в ячейке планшета при обычном иммуноферментном анализе (ИФА, приблизительно ~1 ч). На качественном уровне такая возможность объясняется тем, что мембрана обеспечивает большее количество сайтов связывания, и за счет этого может эффективно улавливать аналит из пробы. Однако теоретической модели, которая бы количественно объясняла такую возможность, в литературе найти не удалось. В рамках данного проекта мы разработали такую модель – она позволила подробно объяснить многие закономерности, наблюдаемые в экспериментах. Путем численного решения системы из двух дифференциальных уравнений наша модель позволяет рассчитать концентрации распределения свободного и связанного аналита в мембране в разные моменты времени. В дальнейшем эта модель может быть использована для разработки мембранных сорбентов и биосенсоров. Обработка поверхности в плазме и, в частности, в тлеющем разряде может значительно изменять ее сорбционные свойства. Многие поверхности гидрофилизуют или активируют в плазме, чтобы усилить адгезию. Мы показали, что эффект плазменной обработки не универсален: в некоторых случаях обработка поверхности в тлеющем разряде не влияла на адсорбцию (в качестве сорбента НЦ мембрана, в качестве адсорбата краситель акридиновый оранжевый), а в некоторых – ухудшает ее (в качестве сорбента донышко полистирольного планшета, в качестве адсорбата улавливающие антитела против мелатонина). Заключительная часть исследования посвящена развитию корреляционной микроскопии, сочетающей сканирующую электронную и конфокальную лазерную сканирующую микроскопию (СЭМ и КЛСМ). Результатом каждого эксперимента является пара изображений, полученных двумя методами, и эти изображения показывают один и тот же выбранный участок поверхности с размером порядка ~10x10 мкм или ~100x100 мкм. Корреляционная микроскопия была проведена на электроформованных мембранах и на отдельных полимерных волокнах, нанесенных на металлизированное стекло. Было показано, что методы СЭМ и КЛСМ могут быть использованы в разной последовательности, но предпочтительнее сначала проводить СЭМ, а затем КЛСМ. Данные о диаметрах волокон, определяемые методами СЭМ и КЛСМ, практически совпали, и это подчеркивает возможности КЛСМ как инструмента для характеризации электроформованных мембран, даже когда измерения проводятся на пределе разрешения, при диаметре волокон менее 500 нм. Алгоритм обработки данных, полученных с помощью корреляционной микроскопии, был обобщен таким образом, чтобы он был применим не только к отдельным конфокальным срезам, но и к z-стекам, и их можно было количественно сопоставлять с изображениями, полученными методом СЭМ. Разработанная методика корреляционной микроскопии, хотя и требует введения флуоресцентной метки в образец, может быть использована для исследования структуры широкого класса объектов.