Аннотация результатов, полученных в 2021 году
Несмотря на высокую социальную значимость психических расстройств, механизмы их развития до конца не ясны, а эффективные методы терапии до сих пор не найдены. Однозначная диагностика и выявление психических расстройств также является сложной задачей, особенно на ранних стадиях. Ввиду отсутствия надёжных генетических маркеров психических расстройств, связанных со значительным повышением вероятности заболевания, необходимы исследования других уровней молекулярной организации. Анализ эпигенетических данных, а именно данных о конформации хромосом, открытости хроматина, экспрессии генов, является одним из наиболее перспективных направлений исследования психических расстройств. Настоящий проект нацелен на получение именно таких данных - карт Hi-C, характеризующих пространственную организацию хромосом в образцах мозга при психических расстройствах и в контрольных образцах, а также данных экспериментов РНК секвенирования и ATAC-seq. Интеграция информации о транскрипционной активности, открытости хроматина и изменениях конформации хромосом при психических расстройствах позволяет получить полную картину изменений регуляторного ландшафта при психических расстройствах. На первом этапе настоящего проекта мы успешно оптимизировали протоколы фиксации, гомогенизации, Hi-C и АТАC-seq для образцов мозга человека. Определение конформации хромосом в образцах мозга осложняется гетерогенным клеточным составом мозговой ткани. В связи с этим, необходимо выделить однородную популяцию целевых клеток (нейронов) из гетерогенной структуры мозговой ткани. Поэтому мы произвели сортировку ядер с помощью проточной цитофлюориметрии, и лишь затем проводили эксперименты Hi-C отдельно для ядер нейронов и глии. Интересно, что для всех образцов шизофрении по сравнению с контрольными образцами была обнаружена повышенная флюоресценция ядер нейрональной популяции клеток (NeuN +/+ по сравнению с NeuN -/-). Это наблюдение может говорить о повышенной доле нейронов относительно глиальных клеток в образцах шизофрении. Мы показали высокое качество полученных с помощью оптимизированных протоколов данных, на основании пилотных экспериментов, а также нескольких экспериментов с глубоким секвенированием. Таким образом, методика полностью отработана. Предварительный анализ полученных нами данных для образцов шизофрении и соответствующих им контролей показывает многообещающие результаты: в локусах некоторых дифференциально экспрессируемых при шизофрении генов заметно изменение структуры хроматина. Наиболее яркий пример - пара близкорасположенных дифференциально экспрессируемых генов: F3 и SLC44A3, оба со значимо сниженной экспрессией при шизофрении. Промоторы этих генов в среднем близко расположены в пространстве, но при шизофрении сигнал от промоторов ослабевает, что особенно заметно для NeuN -/- образцов. Это наблюдение согласуется с моделью "РНК-полимеразы как движущегося барьера", согласно которой РНК полимераза, находящаяся на ДНК, препятствует движению фактора экструзии когезина, в результате чего когезин образует петлю хроматина с полимеразой на одном из концов. Важно отметить, что ассоциация гена F3 с шизофренией уже была ранее показана. Кроме того, мы нашли интересные отличия между нейронами и глиальными клетками: на масштабе ТАДов (до 5 млн. п. о.) нейроны имеют более плотный хроматин, чем глия, а на более крупном масштабе (от 5 млн. п.о.), наоборот, более рыхлый. Это наблюдение определенно заслуживает дальнейшего детального изучения. На первом этапе настоящего проекта мы показали, что образцы пациентов с диагнозом шизофрения являются наиболее подходящим объектом для дальнейшего, более глубокого исследования, т.к.: - для шизофрении нами получены успешные предварительные результаты на основе проведенных нами пилотных экспериментов - образцы шизофрении несут в себе значимо больше генетических замен, ассоциированных с заболеванием, чем соответствующие контроли, на основе проведенного нами генотипирования - нами собрана самая большая выборка образцов для шизофрении (10 образцов мозга пациентов и 10 контрольных образцов мозга, подобранных в соответствии с возрастом и полом пациентов) - результаты глубокого РНК секвенирования для образцов шизофрении выглядят многообещающе (найдены сотни значимых дифференциально экспрессирующихся генов, и их списки и функции согласуются с литературными данными). Поэтому в дальнейшем мы сфокусируемся на исследовании шизофрении и выберем ее объектом для глубокого секвенирования Hi-C экспериментов в настоящем проекте. Поскольку больших отличий между регионами мозга выявлено не было, мы продолжим изучать один регион мозга, для которого по данным РНК-секвенирования мы нашли максимальное количество дифференциально экспрессирующихся генов – BA22p. Мы выполнили глубокое РНК секвенирование в 38 образцах, включающих 10 образцов шизофрении и 10 контрольных образцов, в двух регионах мозга – BA9 и BA22p. Визуализация данных об экспрессии образцов методом главных компонент показывает удивительно хорошее разделение пациентов от контролей, что говорит о сильных изменениях экспрессии при шизофрении. В хорошем соответствии с литературными данными, мы нашли больше генов со значимо сниженной экспрессией, чем со значимо повышенной: 20 повышенных, 62 пониженных для региона BA9 и 196 повышенных, 361 пониженных для региона BA22p. Исследование биологических функций генов, экспрессия которых повышена или понижена при шизофрении, выявило функции, связанные с синаптической передачей и воспалительными реакциями, что прекрасно согласуется с литературными данными. Интересно, что для региона BA22p нашлось в 6 раз больше дифференциально экспрессирующихся генов, чем для региона BA9. Видимо, BA22p является очень перспективным регионом мозга для дальнейшего исследования. Мы ожидаем увидеть сильные отличия в упаковке хроматина при шизофрении для этого региона.

Аннотация результатов, полученных в 2022 году
Механизмы развития психических расстройств не полностью понятны, несмотря на высокую социальную значимость подобных заболеваний, и до сих пор не найдены эффективные методы их лечения. Диагностика и выявление психических расстройств также являются сложными задачами, особенно на ранних стадиях. Исследования мало изученных уровней молекулярной организации могут помочь расширить знания о психических расстройствах и понять причины их возникновения. Настоящий проект направлен на получение данных о пространственной организации хромосом в образцах мозга при психических расстройствах и в контрольных образцах, а также данных об экспрессии генов. Интеграция информации о транскрипционной активности, эпигенетическом ландшафте и изменениях конформации хромосом при психических расстройствах может помочь получить полную картину изменений регуляторных механизмов при психических расстройствах. С использованием оптимизированного на первом этапе настоящего проекта протокола, мы провели эксперименты Hi-C для региона мозга BA22p (зона Вернике) здоровых доноров и больных шизофренией, отдельно для нейронов и для остальных клеток мозга. Первичный анализ карт Hi-C показал их высокое качество, а также очень специфическую организацию хроматина в нейронах, по сравнению с другими клетками мозга. В частности, хромосомные территории в нейронах более выражены, что может частично объясняться их увеличенных размером ядра. Компартменты хроматина, напротив, менее выражены, что может быть связано с увеличенным уровнем когезина в нейронах, который приводит к похожей картине, согласно литературным данным. На более мелком масштабе также заметны отличия в организации хроматина, специфичные для нейронов. Так, плотность топологически ассоциированных доменов (ТАДов) в нейронах увеличена, а нейрон-специфичные хроматиновые петли более длинные. Оба этих наблюдения могут быть объясняться увеличенной активностью когезина, согласно результатам предыдущих исследований. Далее, мы описали отличия между больными шизофренией и контролями в картах Hi-C на всех уровнях организации хроматина, начиная с крупномасштабных и заканчивая наиболее мелкими, которые мы смогли детально изучить благодаря высокому разрешению полученных нами карт Hi-C, - на уровне компартментов, ТАДов и хроматиновых петель. В обнаруженных нами статистически значимых изменениях в организации хроматина находится довольно много генов (суммарно более 100 генов с потенциальными изменениями), которые ассоциированы с шизофренией по данных различных исследований. На уровне отличий в хроматиновых петлях, наиболее интересными примерами ассоциированных с шизофренией генов являются: ген OPCML (имеет однонуклеотидные замены SNP и дифференциально метилирован при шизофрении), несколько представителей семейства ‘solute carrier’ SLC6A17, SLC26A2 (также дифференциально метилированы в шизофрении), ген MYO16 (связан с предрасположенностью к шизофрении и повышенная экспрессия этого гена наблюдалась в лобной коре у пациентов с шизофренией), ген EFNB2 (участвует в развитии нервной системы и дифференциально метилирован в шизофрении). Среди генов, связанных с границами ТАДов, имеющими статистически значимые отличия между здоровыми донорами и больными шизофренией, наиболее интересными являются: представитель семейства ‘solute carrier’ SLC6A11 (ассоциирован с шизофренией и является дифференциально экспрессированным по сравнению со здоровыми донорами), представители семейства нейрексинов NRXN1,NRXN3 (ассоциированы с шизофренией по множеству исследований, изменяют свою экспрессию в шизофрении и необходимы для эффективной нейротрансмиссии), ген GRIN2B (метилирование, изменение копийности и однонуклеотидные варианты ассоциированы с шизофренией). В целом, было обнаружено довольно много статистически значимых изменений в структуре хроматина между здоровыми донорами и больными шизофренией. Однако интерес представляют не только общие изменения, характерные для всех больных шизофренией из нашего анализа, но и индивидуальные для каждого донора изменения, т.к. шизофрения является гетерогенным заболеванием. Такие отличия также были детально изучены на настоящем этапе проекта. Результаты предыдущего этапа настоящего проекта были опубликованы в виде статьи в журнале Q1 (https://doi.org/10.1038/s41419-022-05542-w) и представлены в двух устных докладах на международной конференции. Результаты текущего этапа готовятся к публикации в виде не менее трех статей в журналах Q1. Интеграция полученных нами данных Hi-C с данными о транскрипционной активности и открытости хроматина служит дополнительным подтверждением найденных нами отличий в организации хроматина между больными шизофренией и контролями, в комбинации с литературными данными. На следующем этапе настоящего проекта, мы планируем продолжить валидировать полученные результаты с помощью проведения дополнительных экспериментов и последующего всестороннего анализа различных типов омиксных данных.