Аннотация результатов, полученных в 2021 году
Несмотря на высокую социальную значимость психических расстройств, механизмы их развития до конца не ясны, а эффективные методы терапии до сих пор не найдены. Однозначная диагностика и выявление психических расстройств также является сложной задачей, особенно на ранних стадиях. Ввиду отсутствия надёжных генетических маркеров психических расстройств, связанных со значительным повышением вероятности заболевания, необходимы исследования других уровней молекулярной организации. Анализ эпигенетических данных, а именно данных о конформации хромосом, открытости хроматина, экспрессии генов, является одним из наиболее перспективных направлений исследования психических расстройств. Настоящий проект нацелен на получение именно таких данных - карт Hi-C, характеризующих пространственную организацию хромосом в образцах мозга при психических расстройствах и в контрольных образцах, а также данных экспериментов РНК секвенирования и ATAC-seq. Интеграция информации о транскрипционной активности, открытости хроматина и изменениях конформации хромосом при психических расстройствах позволяет получить полную картину изменений регуляторного ландшафта при психических расстройствах. На первом этапе настоящего проекта мы успешно оптимизировали протоколы фиксации, гомогенизации, Hi-C и АТАC-seq для образцов мозга человека. Определение конформации хромосом в образцах мозга осложняется гетерогенным клеточным составом мозговой ткани. В связи с этим, необходимо выделить однородную популяцию целевых клеток (нейронов) из гетерогенной структуры мозговой ткани. Поэтому мы произвели сортировку ядер с помощью проточной цитофлюориметрии, и лишь затем проводили эксперименты Hi-C отдельно для ядер нейронов и глии. Интересно, что для всех образцов шизофрении по сравнению с контрольными образцами была обнаружена повышенная флюоресценция ядер нейрональной популяции клеток (NeuN +/+ по сравнению с NeuN -/-). Это наблюдение может говорить о повышенной доле нейронов относительно глиальных клеток в образцах шизофрении. Мы показали высокое качество полученных с помощью оптимизированных протоколов данных, на основании пилотных экспериментов, а также нескольких экспериментов с глубоким секвенированием. Таким образом, методика полностью отработана. Предварительный анализ полученных нами данных для образцов шизофрении и соответствующих им контролей показывает многообещающие результаты: в локусах некоторых дифференциально экспрессируемых при шизофрении генов заметно изменение структуры хроматина. Наиболее яркий пример - пара близкорасположенных дифференциально экспрессируемых генов: F3 и SLC44A3, оба со значимо сниженной экспрессией при шизофрении. Промоторы этих генов в среднем близко расположены в пространстве, но при шизофрении сигнал от промоторов ослабевает, что особенно заметно для NeuN -/- образцов. Это наблюдение согласуется с моделью "РНК-полимеразы как движущегося барьера", согласно которой РНК полимераза, находящаяся на ДНК, препятствует движению фактора экструзии когезина, в результате чего когезин образует петлю хроматина с полимеразой на одном из концов. Важно отметить, что ассоциация гена F3 с шизофренией уже была ранее показана. Кроме того, мы нашли интересные отличия между нейронами и глиальными клетками: на масштабе ТАДов (до 5 млн. п. о.) нейроны имеют более плотный хроматин, чем глия, а на более крупном масштабе (от 5 млн. п.о.), наоборот, более рыхлый. Это наблюдение определенно заслуживает дальнейшего детального изучения. На первом этапе настоящего проекта мы показали, что образцы пациентов с диагнозом шизофрения являются наиболее подходящим объектом для дальнейшего, более глубокого исследования, т.к.: - для шизофрении нами получены успешные предварительные результаты на основе проведенных нами пилотных экспериментов - образцы шизофрении несут в себе значимо больше генетических замен, ассоциированных с заболеванием, чем соответствующие контроли, на основе проведенного нами генотипирования - нами собрана самая большая выборка образцов для шизофрении (10 образцов мозга пациентов и 10 контрольных образцов мозга, подобранных в соответствии с возрастом и полом пациентов) - результаты глубокого РНК секвенирования для образцов шизофрении выглядят многообещающе (найдены сотни значимых дифференциально экспрессирующихся генов, и их списки и функции согласуются с литературными данными). Поэтому в дальнейшем мы сфокусируемся на исследовании шизофрении и выберем ее объектом для глубокого секвенирования Hi-C экспериментов в настоящем проекте. Поскольку больших отличий между регионами мозга выявлено не было, мы продолжим изучать один регион мозга, для которого по данным РНК-секвенирования мы нашли максимальное количество дифференциально экспрессирующихся генов – BA22p. Мы выполнили глубокое РНК секвенирование в 38 образцах, включающих 10 образцов шизофрении и 10 контрольных образцов, в двух регионах мозга – BA9 и BA22p. Визуализация данных об экспрессии образцов методом главных компонент показывает удивительно хорошее разделение пациентов от контролей, что говорит о сильных изменениях экспрессии при шизофрении. В хорошем соответствии с литературными данными, мы нашли больше генов со значимо сниженной экспрессией, чем со значимо повышенной: 20 повышенных, 62 пониженных для региона BA9 и 196 повышенных, 361 пониженных для региона BA22p. Исследование биологических функций генов, экспрессия которых повышена или понижена при шизофрении, выявило функции, связанные с синаптической передачей и воспалительными реакциями, что прекрасно согласуется с литературными данными. Интересно, что для региона BA22p нашлось в 6 раз больше дифференциально экспрессирующихся генов, чем для региона BA9. Видимо, BA22p является очень перспективным регионом мозга для дальнейшего исследования. Мы ожидаем увидеть сильные отличия в упаковке хроматина при шизофрении для этого региона.

Аннотация результатов, полученных в 2022 году
Механизмы развития психических расстройств не полностью понятны, несмотря на высокую социальную значимость подобных заболеваний, и до сих пор не найдены эффективные методы их лечения. Диагностика и выявление психических расстройств также являются сложными задачами, особенно на ранних стадиях. Исследования мало изученных уровней молекулярной организации могут помочь расширить знания о психических расстройствах и понять причины их возникновения. Настоящий проект направлен на получение данных о пространственной организации хромосом в образцах мозга при психических расстройствах и в контрольных образцах, а также данных об экспрессии генов. Интеграция информации о транскрипционной активности, эпигенетическом ландшафте и изменениях конформации хромосом при психических расстройствах может помочь получить полную картину изменений регуляторных механизмов при психических расстройствах. С использованием оптимизированного на первом этапе настоящего проекта протокола, мы провели эксперименты Hi-C для региона мозга BA22p (зона Вернике) здоровых доноров и больных шизофренией, отдельно для нейронов и для остальных клеток мозга. Первичный анализ карт Hi-C показал их высокое качество, а также очень специфическую организацию хроматина в нейронах, по сравнению с другими клетками мозга. В частности, хромосомные территории в нейронах более выражены, что может частично объясняться их увеличенных размером ядра. Компартменты хроматина, напротив, менее выражены, что может быть связано с увеличенным уровнем когезина в нейронах, который приводит к похожей картине, согласно литературным данным. На более мелком масштабе также заметны отличия в организации хроматина, специфичные для нейронов. Так, плотность топологически ассоциированных доменов (ТАДов) в нейронах увеличена, а нейрон-специфичные хроматиновые петли более длинные. Оба этих наблюдения могут быть объясняться увеличенной активностью когезина, согласно результатам предыдущих исследований. Далее, мы описали отличия между больными шизофренией и контролями в картах Hi-C на всех уровнях организации хроматина, начиная с крупномасштабных и заканчивая наиболее мелкими, которые мы смогли детально изучить благодаря высокому разрешению полученных нами карт Hi-C, - на уровне компартментов, ТАДов и хроматиновых петель. В обнаруженных нами статистически значимых изменениях в организации хроматина находится довольно много генов (суммарно более 100 генов с потенциальными изменениями), которые ассоциированы с шизофренией по данных различных исследований. На уровне отличий в хроматиновых петлях, наиболее интересными примерами ассоциированных с шизофренией генов являются: ген OPCML (имеет однонуклеотидные замены SNP и дифференциально метилирован при шизофрении), несколько представителей семейства ‘solute carrier’ SLC6A17, SLC26A2 (также дифференциально метилированы в шизофрении), ген MYO16 (связан с предрасположенностью к шизофрении и повышенная экспрессия этого гена наблюдалась в лобной коре у пациентов с шизофренией), ген EFNB2 (участвует в развитии нервной системы и дифференциально метилирован в шизофрении). Среди генов, связанных с границами ТАДов, имеющими статистически значимые отличия между здоровыми донорами и больными шизофренией, наиболее интересными являются: представитель семейства ‘solute carrier’ SLC6A11 (ассоциирован с шизофренией и является дифференциально экспрессированным по сравнению со здоровыми донорами), представители семейства нейрексинов NRXN1,NRXN3 (ассоциированы с шизофренией по множеству исследований, изменяют свою экспрессию в шизофрении и необходимы для эффективной нейротрансмиссии), ген GRIN2B (метилирование, изменение копийности и однонуклеотидные варианты ассоциированы с шизофренией). В целом, было обнаружено довольно много статистически значимых изменений в структуре хроматина между здоровыми донорами и больными шизофренией. Однако интерес представляют не только общие изменения, характерные для всех больных шизофренией из нашего анализа, но и индивидуальные для каждого донора изменения, т.к. шизофрения является гетерогенным заболеванием. Такие отличия также были детально изучены на настоящем этапе проекта. Результаты предыдущего этапа настоящего проекта были опубликованы в виде статьи в журнале Q1 (https://doi.org/10.1038/s41419-022-05542-w) и представлены в двух устных докладах на международной конференции. Результаты текущего этапа готовятся к публикации в виде не менее трех статей в журналах Q1. Интеграция полученных нами данных Hi-C с данными о транскрипционной активности и открытости хроматина служит дополнительным подтверждением найденных нами отличий в организации хроматина между больными шизофренией и контролями, в комбинации с литературными данными. На следующем этапе настоящего проекта, мы планируем продолжить валидировать полученные результаты с помощью проведения дополнительных экспериментов и последующего всестороннего анализа различных типов омиксных данных.

Аннотация результатов, полученных в 2023 году
Хроматин — это комплекс ДНК и белков, который определяет структуру и функцию хромосом в ядре клетки. Нарушения в структуре и функции хроматина могут приводить к изменениям в экспрессии генов, что, в свою очередь, может вызывать различные психические расстройства. Изучение организации хроматина у больных психическими расстройствами является важной задачей, поскольку может привести к лучшему пониманию молекулярных механизмов, лежащих в основе этих заболеваний и выявить специфические изменения, связанные с этими заболеваниями. Это может способствовать разработке новых методов диагностики, лечения и профилактики психических расстройств. Кроме того, изучение организации хроматина может дать представление о механизмах, с помощью которых генетические факторы влияют на развитие и функционирование нервной системы, что может привести к созданию новых подходов к лечению и реабилитации пациентов с психическими расстройствами. С помощью оптимизированной методики, созданной на начальных этапах настоящего проекта, на данном этапе мы провели эксперименты Hi-C в области мозга BA22p (зона Вернике) у здоровых людей и у больных шизофренией. Определение конформации хромосом в образцах мозга осложняется гетерогенным клеточным составом мозговой ткани. Поэтому мы отдельно исследовали нейроны и другие клетки головного мозга. Анализ карт Hi-C показал их высокое качество и выявил особую организацию хроматина в нейронах по сравнению с остальными клетками мозга. Это направление исследований является интересным и новым, поскольку в литературе практически не описаны особенности организации хроматина в нейронах коры головного мозга человека, по сравнению с глиальными клетками. Очевидно, отличия между больными шизофренией и контролями могут по-разному проявляться в нейронах и других типах клеток. Поэтому необходимо было разобраться в деталях организации хроматина в разных типах клеток мозга и, самое главное, установить функциональную роль специфичных для нейронов и глии особенностей структуры хроматина. Логично предположить, что нарушения таких особенностей организации могут оказаться причиной возникновения психических расстройств. Самым важным наблюдением из нашего анализа Hi-C карт для нейронов является наличие ярких дальних взаимодействий между областями, обогащенными H3K27me3, - нейрональными точками. Они формируют специфическую сеть контактов, опосредованных белками группы поликомба, в нейронах, которая практически отсутствует в других клетках мозга. Насколько нам известно, эта особенность структуры хроматина нейронов ранее не была показана. Несмотря на быстрое снижение ожидаемой частоты контактов в нейронах для всего генома, нейрональные точки способны устанавливать контакты даже на больших геномных расстояниях - до 100 Мб. Внутри нейрональных точек значительная часть генов (около 80%) кодирует факторы транскрипции (ТФ), большинство из которых сильно экспрессируются в процессе развития, но слабо - в зрелых нейронах и глиальных клетках. Поскольку метка H3K27me3 связана с репрессией белками поликомба, мы предполагаем, что белки группы поликомба подавляют гены ТФ в нейрональных точках в зрелых нейронах. Таким образом, эти специфические дальние взаимодействия играют важную функциональную роль в нейронах. Являются ли найденные нами отличия на других уровнях организации хроматина насколько же функционально важными? Мы применили регрессию оценки неравновесия по сцеплению (LD) к хроматиновым петлям, специфичным для нейронов, чтобы понять, как эти петли связаны с наследуемыми признаками человека. Интересно, что мы обнаружили выраженное и значительное обогащение якорей нейрон-специфичных петель исключительно когнитивными функциями. Напротив, границы петель, специфичных для не-нейрональных клеток мозга, обогащены признаками, не связанными с мозгом, такими как аутоиммунные заболевания, заболевания крови и сердечно-сосудистой системы. Этот результат согласуется с предыдущими исследованиями, в которых описано обогащение генов, связанных с общими заболеваниями, на границах петель. В совокупности, эти результаты свидетельствуют о том, что специфичные для нейронов петли могут регулировать специализированные программы транскрипции, связанные с когнитивными функциями человека. Следовательно, нарушения подобных особенностей организации хроматина могут оказаться причиной возникновения психических расстройств. Далее, мы описали различия между пациентами с шизофренией и контрольной группой в картах Hi-C на всех уровнях организации хроматина, от крупномасштабных до мельчайших, которые мы смогли детально изучить благодаря высокому разрешению наших карт Hi-C - на уровне компартментов, ТАДов и петель хроматина. Для отделения эффекта болезни от эффекта возраста, больные и здоровые доноры были поделены на три возрастные группы. На уровне глобальных различий в организации хроматина, мы наблюдаем значительное снижение силы дальних контактов в нейронах больных по сравнению со здоровыми донорами и, напротив, значительное повышение силы дальних контактов в других клетках мозга, во всех возрастных группах. Кроме того, значительно повышается сила дальних контактов в нейронах здоровых доноров с увеличением возраста, из чего можно предположить, что ядро нейронов с возрастом увеличивается в размере. Такой же эффект мы наблюдали в нейронах мышей, когда анализировали карты Hi-C для кортикальных нейронов, полученные нами для молодых, взрослых и старых мышей в качестве задела к настоящему проекту, для оптимизации и апробации экспериментальной методики Hi-C для замороженных постмортальных образцов мозга. Поскольку образцы мозга человека являются очень ценными, их использование для отработки методик являлось нецелесообразным, и мы использовали образцы мозга мыши для этой цели. Кроме того, благодаря наличию наших данных Hi-C для нейронов мыши, аналогичных по экспериментальной методике нашим данным для человека, мы смогли дополнительно валидировать результаты, полученные для мозга человека, и в мозге мыши. Следующим шагом был анализ крупных изменений в активных (А) и неактивных (В) компартментах между больными и здоровыми образцами. Для нейронов, отличия наблюдались в генах, связанных с клеточным ростом, дифференцировкой и развитием нейронов, таких как SOX1, FOXB2, FOXE1, NUDCD3, MYO1G, CDH18, CDH22. Кроме глобальных изменений и отличий в крупных структурах, таких как компартменты, были обнаружены и отличия в более мелких структурах, таких как ТАДы, хроматиновые петли и изменения в инсуляции отдельных участков генома. Интеграция полученных нами данных Hi-C c различными типами омиксных данных позволила нам выполнить более полный анализ изменений в структуре хроматина нейронов и других клеток мозга больных шизофренией. В частности, нам удалось показать, что дифференциально экспрессируемые в шизофрении гены чаще оказываются в геномных участках, в которых усиливается компартмент в шизофрении, независимо от уровня экспрессии гена в данном клеточном типе. Более того, имеется статистически значимая корреляция между дифференциальной экспрессией генов и изменением величины А компартмента в L6, SST и Vip популяциях нейронов, и Pvalb и L6 популяциях для В компартмента. Кроме того, используя данные полногеномного метилирования ДНК нейронов из дорсолатеральной префронтальной коры, были получены более 4500 дифференциальных сайтов метилирования между больными и здоровыми, а также между молодой и старой, и молодой и средней группами здоровых доноров. Значимость данных сайтов была проанализирована при помощи анализа РСА, где как переменные были использованные полученные дифференциальные сайты и величина метилирования в них. При данном анализе удалось успешно разделить образцы больных и здоровых для всех возрастных групп. При пересечении генов, дифференциально метилированных, дифференциально экспрессируемых и дифференциально изменивших компартмент в шизофрении, можно обнаружить большое пересечение между данными группами генов. В этом пересечении оказались значимые для устройства хроматина и функционирования нейронов гены, такие как CDH18, CDH22, NEURL2. Полученные нами результаты были опубликованы в виде трех статей в журналах Q1 (Nature Communications, Nucleic Acids Research, Epigenetics & Chromatin) и представлены в четырех устных докладах на международных конференциях. Кроме того, по результатам настоящего проекта опубликовано два препринта (https://doi.org/10.21203/rs.3.rs-3691075/v1 и https://doi.org/10.1101/2023.03.06.531254). Ещё три статьи находятся на рецензии или готовятся к публикации.