Аннотация результатов, полученных в 2021 году
Загрязнители, проявляющие биотоксичность в малых (порядка нг/л) концентрациях, получили особое название – опасные микрополлютанты (ОМП; в англоязычной литературе – emerging/hazardous micropollutants). Они представлены лекарствами, антисептиками, средствами личной гигиены, пищевыми добавками, пестицидами, пластификаторами, природными и синтетическими гормонами, тяжелыми металлами, а также наночастицами. Антибиотики, НЧ и наноматериалы все шире применяются в промышленных и бытовых целях, что влечет неуклонный рост их производства и выбросов в окружающую среду. В ходе реализации проекта подготовлен и опубликован обзор литературы как попытка сжато систематизировать сведения о наиболее распространенных типах НЧ, связанных с ними рисках, поступлении в водную среду и путях биотрансформации в клетках гидробионтов. Так, неполная, медленная деградация ОМП приводит к их повышенной стойкости в окружающей среде и обогащению природных сообществ и очистных сооружений патогенными и условно-патогенными микроорганизмами, устойчивыми к антибиотикам, под воздействием ОМП, поступающих из сточных вод. Хотя концентрации ОМП, встречающиеся в настоящее время в потоках отходов, невелики по сравнению с их общим содержанием органики, ОМП представляют серьезную угрозу для окружающей среды из-за их высокой биотоксичности. Хотя концентрации ОМП, характерные для окружающей среды редко бывают остро токсичными для водных организмов, были задокументированы долгосрочные негативные последствия для отдельных организмов и популяций, включая воздействие на микробные консорциумы. Несмотря на непосредственные и долгосрочные риски, связанные с ОМП, маловероятно, что человечество откажется от использования этих соединений в ближайшем будущем, поскольку они необходимы для поддержания здоровья населения и безопасности пищевых продуктов. Проблема усугубляется ограниченной способностью традиционных технологий очистки сточных вод удалять ОМП. Эффективные технологии удаления ОМП, основанные на сорбции и/или окислении, являются дорогостоящими и не могут быть по доступной цене воспроизведены на обычных очистных сооружениях для сточных вод. С другой стороны, биотехнологии, основанные на микроводорослях и водорослево-бактериальных консорциумах, являются многообещающей альтернативой для переработки сточных вод, содержащих ОМП. Дополнительные преимущества этого подхода —стимулирования социального и экономического роста, сохранения природных ресурсов и снижения воздействия на окружающую среду. Поиск толерантных штаммов, способных разрушать ОМП, является основным узким местом в разработке биотехнологий для устранения этих поллютантов. Выделение штаммов с высокой чувствительностью к ОМП также важно для разработки чувствительных методов биоиндикации. Решение этих проблем требует тестирования большого количества изолятов для отбора лучших кандидатов для дальнейшего изучения. В отчётном периоде требовалось выбрать модельные объекты (альгологические и цианобактериальные монокультуры, природные и искусственные сообщества), также сформирован список модельных ОМП, включающий наночастицы, антибиотики, и другие фармсубстанции. Для модельных культур требовалось определить потенциальную толерантность к действию ОМП, а также оценить влияние отдельных ОМП на изъятие культурой макронутриентов (фосфата и нитрата). Также планировалось определить таксономическую структуру нативных модельных сообществ и влияние на неё ОМП в модельных культивационных системах (по данным 16S/18S rRNA-метабаркодинга). На первом этапе исследования основные усилия были сосредоточены на выбор модельных объектов (альгологических и цианобактериальных монокультур а также водорослёво-бактериальных сообществ). Из четырёх исследованных штаммов микроводорослей был выбран штамм Lobosphaera, резервным объектом может быть Desmodesmus sp. Эти культуры демонстрировали широкий динамический диапазон значений наблюдаемых эффектов ОМП в исследованных концентрациях. Из двух исследованных штаммов цианобактерий применимым оказался только один штамм Synechoccus. Также был сформирован список модельных ОМП, включающий наночастицы, антибиотики, и другие фармсубстанции. При формировании списка исходил из соображений доступности, удобства введения в среду, а также удобства мониторинга остаточной концентрации ОМП в среде и наблюдаемых физиолого-биохимических эффектов. Оптимальным для экспериментальных исследований, с учётом полученных результатов, оказались цефтриаксон и диклофенак, а также НЧ CuO, TiO2, МУНТ и оксида графена. Первоначальный список отобранных для работы модельных объектов и ОМП будет уточняться. Хотя использованная в ходе экспериментов по скринингу эффектов ОМП оценка содержания и состава фотосинтетических пигментов является стандартным методом мониторинга роста и продуктивности культур микроводорослей, этот метод является деструктивными и трудоемким. В этой связи в дополнение к основным работам (скрининг эффектов ОМП по составу и содержанию фотосинтетических пигментов) тестировали альтернативный неинвазивный экспресс-метод функциональной диагностики фотосинтетического аппарата, основанный на визуализации параметров переменной флуоресценции Chl. В частности, мы выбрали мониторинг потенциального максимального фотохимического квантового выхода фотосистемы II (Qy), параметра, который является наиболее распространенным и простым для измерения и интерпретации. Поскольку этот метод является неразрушающим, удалось зафиксировать не только начальные и конечные условия культивирования, но и проследить динамику изменений, индуцированную воздействием ОМП. Были получены экспериментальные данные о толерантности суспензионных модельных культур к действию ОМП и зарегистрирована кинетика изъятия макронутриентов (фосфата и нитрата) модельными организмами. Было установлено, что, независимо от природы исследованных ОМП, зелёные микроводоросли более толерантны к действию ОМП, чем цианобактерии. Ингибирующие эффекты ОМП проявляют концентрационную зависимость. При этом низкие концентрации фармпрепаратаов в отдельных случаях демонстрировали стимулирующий эффекта, чего не отмечали в случае инкубации культур с НЧ. В целом, при использовании «реалистичных» концентраций ОМП (сопоставимых с концентрациями, рутинно обнаруживаемых в окружающей среде и на очистных сооружениях), значимых изменений в способности микроорганизмов поглощать неорганический азот и фосфор в наших экспериментальных условиях не наблюдали, однако этот вопрос нуждается в более тщательном, систематическом исследовании. Дополнительно планируется провести тестирование эффектов НЧ на уровне сообществ. Поскольку представляется более корректным оценивать потенциальное влияние ОМП на природные системы не по монокультурам, а по сообществам, проводили анализ таксономической структуры модельных сообществ методом rRNA-метабаркодинга, а также оценивали влияние ОМП на таксономическую структуру модельных сообществ. Как следует из сравнительного анализа данных, исследованные ОМП в низких («реалистичных») концентрациях не оказывали радикального влияния на состав модельных сообществ, хотя изменения в составе минорных таксономических групп наблюдались. На втором этапе работ данные исследования планируется продолжить. В заключение следует отметить, что первый этап реализации проекта позволил собрать эффективные «инструменты» для исследования эффектов ОМП на уровне отдельных культур и сообществ, а также подобрать модельные объекты и субстанции. Уже на этапе предварительных исследований стало ясно, что разные ОМП, в зависимости от концентрации, могут не только ингибировать, но и стимулировать рост и накопление пигментов микроводорослей. При этом влияние на отдельные культуры не всегда совпадало с эффектами, наблюдаемыми на уровне сообществ. Мы надеемся найти ответы на возникшие вопросы и проверить выдвинутые гипотезы в ходе дальнейших исследований в рамках данного проекта.

Аннотация результатов, полученных в 2022 году
Загрязнители, проявляющие биотоксичность в малых (порядка нг/л) концентрациях, получили особое название – опасные микрополлютанты (ОМП; в англоязычной литературе – emerging/hazardous micropollutants). Они представлены лекарствами, антисептиками, средствами личной гигиены, пищевыми добавками, пестицидами, пластификаторами, природными и синтетическими гормонами, тяжелыми металлами, а также наночастицами. Антибиотики, НЧ и наноматериалы все шире применяются в промышленных и бытовых целях, что влечет неуклонный рост их производства и выбросов в окружающую среду. Неполная, медленная деградация ОМП приводит к их повышенной стойкости в окружающей среде и обогащению природных сообществ и очистных сооружений патогенными и условно-патогенными микроорганизмами, устойчивыми к антибиотикам, под воздействием ОМП, поступающих из сточных вод. Хотя концентрации ОМП, встречающиеся в настоящее время в потоках отходов, невелики по сравнению с их общим содержанием органики, ОМП представляют серьезную угрозу для окружающей среды из-за их высокой биотоксичности. Хотя концентрации ОМП, характерные для окружающей среды редко бывают остро токсичными для водных организмов, были задокументированы долгосрочные негативные последствия для отдельных организмов и популяций, включая воздействие на микробные консорциумы. Несмотря на непосредственные и долгосрочные риски, связанные с ОМП, маловероятно, что человечество откажется от использования этих соединений в ближайшем будущем, поскольку они необходимы для поддержания здоровья населения и безопасности пищевых продуктов. Проблема усугубляется ограниченной способностью традиционных технологий очистки сточных вод удалять ОМП. Эффективные технологии удаления ОМП, основанные на сорбции и/или окислении, являются дорогостоящими и не могут быть по доступной цене воспроизведены на обычных очистных сооружениях для сточных вод. С другой стороны, биотехнологии, основанные на микроводорослях и водорослево-бактериальных консорциумах, являются многообещающей альтернативой для переработки сточных вод, содержащих ОМП. Дополнительные преимущества этого подхода —стимулирования социального и экономического роста, сохранения природных ресурсов и снижения воздействия на окружающую среду. Недостаток фундаментальных знаний об эффектах ОМП на уровне микробных сообществ в природных и созданных человеком система, а также дефицит толерантных штаммов, способных разрушать ОМП, сдерживают разработку биотехнологий для устранения этих поллютантов. Первый этап проекта завершился побором «инструментов» (штаммов, модельных ОМП, методов анализа и экспериментальных протоколов) для решения этих задач. Второй этап был посвящён конкретным проблемам оценки деградации ОМП культурами микроводорослей, а также сообществами, включающими микроводоросли, цианобактерии и гетеротрофные бактерии. Особое внимание уделяли сравнению эффективности суспензионных культур и культур, иммобилизованных на биодеградируемых носителях из хитозана. Показано, что незаряженный полимер, полученный в результате реацетилирования хитозана, лучше иммобилизует клетки Lobosphaera в сравнении с заряженным хитозановым носителем. Существенно, что клетки Lobosphaera не только активно иммобилизовались на хитозановых полимерах, но и сохраняли способность к росту и делению в этом состоянии. Наряду с биохимическими и физиологическими показателями культур (рост, содержание фотосинтетических пигментов, активность фотосинтетического аппарата, скорость поглощения ортофосфата из среды) оценивали влияние ОМП на структуру микробных сообществ методом rRNA-метабаркодинга. Для независимого подтверждения результатов рутинного спектрофотометрического анализа также был разработан и опробован метод точного количественного определения остаточного содержания цефтиаксона в культуральной жидкости с использованием ВЭЖХ-МС. Установлено, что «реалистичные» концентрации ОМП (сопоставимые с концентрациями, детектируемыми в окружающей среде) не вызывают, как правило, значительных изменений функционального статуса (например, скорости утилизации ортофосфата или фотосинтетической активности) микробных сообществ (как лабораторных культур, так и консорциумов очистных сооружений). Только высокие концентрации ОМП (наночастиц), особенно в присутствии тяжелых металлов, таких как Pb и Cd, вызывают острый токсический эффект. По всей видимости, сравнительно высокая толерантность исследованных объектов к действию ОМП имеет комплексную природу. Поскольку многие ОМП (такие как использованный нами в качестве модельного антибиотик цефтриаксон, а также нестероидный противовоспалительный препарат диклофенак) подвергаются окислению растворённым в воде кислородом, выделяемый клетками микроводоросли при фотосинтезе кислород ускоряет деградацию ОМП. Другие возможные причины — поглощение (интернализация) ОМП клетками и (или) деградация ОМП внеклеточными литическими ферментами. Важным наблюдением является повышение полноты и скорости деградации цефтриаксона иммобилизованной культурой Lobosphaera по сравнению с суспензионной культурой той же микроводоросли. Также нельзя исключить адсорбцию цефтриаксона носителем на основе хитозана. Анализ таксономической структуры микробиома микроводоросли Lobasphaera incisa показал, что иммобилизация на носителе влияет на состав сообщества больше, чем инкубация с цефтриаксоном в концентрации до 20 мг/л. В случае иммобилизованных культур в микробиоме преобладали микроорганизмы, способные к деградации и утилизации хитозанового носителя. Цефтриаксон и диклофенак в концентрациях 5 мг/л (это сопоставимо с концентрациями этих веществ в реальных городских сточных водах) оказывают разноплановое действие на таксономический состав микробных сообществ. Данные эффекты проявлялись в течение первых двух недель инкубации сообществ в присутствие фармпрепаратов в реальных сточных водах. Так, в присутствии 5 мг/л диклофенака увеличивался вклад фототрофного компонента сообществ – представителей класса Cyanobacteria. Напротив, добавление 5 мг/л цефтриаксона приводило к сокращению представленности цианобактерий и росту биоразнообразия эукариотических микроводорослей. В целом, как и в прежних экспериментах (см. отчёт за 1 год реализации проекта), значимых изменений в способности микроорганизмов поглощать неорганический азот и фосфор в наших экспериментальных условиях не наблюдали. При этом увеличивалась представленность микроорганизмов, несущих гены устойчивости к антибиотикам и иным фармпрепаратам. Таким образом, микробиомы сообществ, постоянно подвергающихся воздействию даже сравнительно невысоких концентраций фармпрепаратов, не вызывающих измеримых функциональных изменений, со временим могут становиться «резервуаром» организмов с высокой устойчивостью, например, к антибиотикам. Распространение таких микроорганизмов в окружающей среде несет в себе существенные риски для здоровья населения.

Аннотация результатов, полученных в 2023 году
Загрязнители, проявляющие биотоксичность в малых (порядка нг/л) концентрациях, получили особое название – опасные микрополлютанты (ОМП; в англоязычной литературе – emerging/hazardous micropollutants). Они представлены лекарствами, антисептиками, средствами личной гигиены, пищевыми добавками, пестицидами, пластификаторами, природными и синтетическими гормонами, тяжелыми металлами, а также наночастицами (НЧ). Хотя концентрации ОМП, встречающиеся в настоящее время в потоках отходов, невелики по сравнению с их общим содержанием органики, ОМП представляют серьезную угрозу для окружающей среды из-за их высокой биотоксичности. Несмотря на непосредственные и долгосрочные риски, связанные с ОМП, маловероятно, что человечество откажется от использования этих соединений в ближайшем будущем, поскольку они необходимы для поддержания здоровья населения и безопасности пищевых продуктов. Биотехнологии, основанные на микроводорослях (МВ) и водорослево-бактериальных консорциумах, являются многообещающей альтернативой для переработки сточных вод, содержащих ОМП. Даже столь краткое рассмотрение показывает, как велики пробелы в наших знаниях об этих процессах. Необходимость заполнения этих пробелов тем острее, чем быстрее и шире распространяются технологии, использующие антибиотики, НЧ и наноматериалы. При этом НЧ – «обоюдоострое оружие», которое может быть как опасным токсикантом, так и мощным средством устранения загрязнителей из сточных вод и окружающей среды. Основные направления работы в рамках проекта - Анализ токсичности НЧ и антибиотиков для клеток микроводорослей, как свободно плавающих в среде, так и иммобилизованных на полимерных носителях. Особое внимание уделяется анализу таксономической структуры сообществ гетеротрофных микроорганизмов, формирующихся вокруг клеток микроводорослей, поскольку это сообщество в значительной степени определяет эффективность и устойчивость культур в биотехнологических процессах. На третьем этапе было показано, что наночастицы оказывают концентрационно-зависимое действие на динамику численности клеток модельных микроводорослей. В большинстве случаев максимальные концентрации НЧ оказывали ингибирующее действие, причем культура микроводорослей Micractinium оказалась более чувствительной к выбранным наночастицам, чем культура Lobosphaera. Увеличение содержания клеток отмечено в случае наночастиц серебра и оксида графена в концентрации 75 мкг/л для обоих видов микроводорослей. Данные пигментного анализа и мониторинга изменения численности популяции клеток, отмечен разнонаправленный эффект максимальных концентраций наночастиц на данные показатели. Так, высокие концентрации наночастиц значительно снижали общую численность клеток микроводорослей на 14 сутки, однако в то же время, в среднем, наблюдалась стимуляция биосинтеза пигментов в клетках микроводорослей. Установлено, что наночастицы способны как ингибировать, так и стимулировать жизненные процессы в летках микроводорослей в зависимости от концентрации токсиканта и его времени воздействия на тест-объект. Судя по критерию токсичности ЕС50 (концентрации наночастиц, при которой рассматриваемые параметры тест-культур снижались по отношению к контролю в среднем на 50%), более токсичными были частицы оксидов меди и цинка для мелкоклеточных микроводорослей типа Micractinium, в то время как крупноклеточные микроводоросли Lobosphaera были, в среднем, в 100 раз более толерантными к действию наночастиц. Хлоридная засоленность не отразилось на жизнеспособности, содержании белков и пигментов, но снижала численности клеток и усиливало ингибирующее действие наносеребра. Важная характеристика микроводорослей — их способность к изъятию макроэлементов минерального питания, таких как нитратный азот и фосфор. От этого зависит эффективность их применения для биологической очистки сточных вод, в том числе от ОМП. При сравнении поглощения фосфатов и нитратов суспензионными и иммобилизованными на хитозановых полимерах клетками установлено, что кинетика биоизъятия нитратов в обоих случаях практически не отличалась, в то время как скорость поглощения фосфатов иммобилизованной культурой была в три раза выше таковой у суспензионной культуры. На начальном этапе (в первые 2 суток) скорость изъятия нитратов и фосфатов в колоннах с иммобилизованными клетками была в 6–10 раз выше, чем в суспензионной культуре, что объясняется сорбцией хитозаном и биоизъятием иммобилизованными клетками. В целом, рост скорости поглощения фосфатов и нитратов клетками микроводоросли при иммобилизации может объясняться большей доступностью нутриентов, концентрирующихся на поверхности и вблизи носителя. Интересно, что антибиотик хитозан снижает скорость изъятия нитратов и фосфатов суспензионной культурой, но повышает её в случае иммобилизованной культуры. Иммобилизация культур, как и добавление в среду культивирования антибиотика цефтриаксона, влияла на морфологию клеток и таксономическую структуру сообществ микроорганизмов, сформированных «вокруг» модельных микроводорослей. На 7 сутки экспозиции количество спорангиев и молодых клеток в суспензионной культуре значительно увеличивается, что указывает на сохранение способности клеток к росту и размножению в присутствии антибиотика. Напротив, у части вегетативных клеток, прикрепленных к поверхности хитозана, выявляются следы плазмолиза, что указывает на временное снижение толерантности культуры Lobosphaera к высоким количествам ЦФ при иммобилизации (возможно, из-за способности хитозана концентрировать цефтриаксон, увеличивая его концентрацию вблизи клеток Lobosphaera). Степень деградации цефтриаксона в среде BG-11 без клеток после 14-ти суток инкубации составила около 40%, что скорее всего связано с окислением антибиотика кислородом воздуха. В присутствие клеток Lobosphaera деградация цефтриаксона протекала с более высокой скоростью, что может быть связано с фотогенерацией кислорода клетками микроводорослей, а также поглощением и/или деградацией ОМП внеклеточными ферментами. Следует отметить, что скорость и полнота деградации цефтриаксона иммобилизованной культурой была значительно выше, чем суспензионной, что может объясняться как частичной адсорбцией цефтриаксона хитозаном, так и большей эффективностью биодеградации цефтриаксона иммобилизованными клетками. Дальнейшее изучение физиологии иммобилизованной на хитозановых полимерах клеток Lobosphaera показало, это клетки этой микроводоросли способны к эффективному изъятия нитратов и фосфатов из среды, а также к деградации самого антибиотика. Существенно, что по окончании процесса очистки «отработавшие» клетки иммобилизованной культуры могут использоваться для получения биомассы, обогащенной ценными ПНЖК, в том числе арахидоновой кислотой. Анализ динамики сообщества гетеротрофных бактерий и культуры микроводоросли Lobosphaera показал, что клетки бактерий активно заселяют, вместе с водорослями, поверхность биополимеров при иммобилизации микроводорослей. Кроме того, на поверхности иммобилизованных клеток микроводоросли наблюдается формирование тяжей внеклеточного полимерного матрикса, а затем — микробных биопленок. В целом, действие антибиотика приводит к направленным сдвигам в структуре популяции бактерий-ассоциантов, а также к сужению их биоразнообразия. Инкубация с цефтриаксоном привела к сужению разнообразия микробиома в течение первой недели. Это может быть признаком сукцессии с заменой исходного микробиома микроорганизмами, устойчивыми к ЦФ или теми, кто получил конкурентное преимущество в результате этого процесса. Более низкое биоразнообразие микробиома иммобилизованных культур может указывать на селекцию микроорганизмов по их способности к иммобилизации на носителе. Интересным представляется вопрос о вариации представленности и обилия генов антибиотикорезистентности в популяции бактерий, ассоциированных с микроводорослями, он будет исследован на завершающем этапе реализации проекта.