Аннотация результатов, полученных в 2021 году
На первом году реализации проекта были выделены гены белков ettA, ysxC, era из хромосомной ДНК (S.aureus) и разработаны праймеры для создания конструкций, экспрессирующих белки EttA, YsxC, Era в векторной системе pET28a. Отсутствие мутаций и корректность клонирования в структурных генах ettA, ysxC, era подтвердили секвенированием. Далее проводили подбор условий экспрессии белков EttA, YsxC, Era в штамме E. coli DH5α и трансформации в экспрессионном штамме BL21 (DE3) pLys, после чего оптимизировали протоколы выделения и очистки рекомбинантных белков EttA, YsxC, Era методами металл-хелатной хроматографии и гельфильтрации. В результате были получены образцы белка EttA c концентрацией 11,5 мг/мл и белка Era c концентрацией 30 мг/мл. Установлено, что фьюжант белок YsxC+GB1 выделяется из телец включения методом рефолдинга и данный конструкт стабилен при концентрировании до 10 мг/мл и выше (максимально полученное значение концентрации составляло 20 мг/мл). При протеолитическом отщеплении домена GB1 с помощью фермента TEV-протеазы стабильность белка снижается и при концентрировании свыше 8.5 мг/мл наблюдается агрегация препарата. Для последующих структурных исследований будет использоваться как белок YsxC с доменом GB1, так и без него. Таким образом запланированные на первый год работы по клонированию, подбору условий экспрессии и очистке белков Etta, Era, YsxC из S. aureus в экспрессионной системе E. coli были выполнены в полном объеме, что позволяет перейти к следующему этапу проекта: подбору условий кристаллизации факторов Etta, Era, YsxC из S. aureus методом рентгеноструктурного анализа и анализу делеционных мутантов по генам Etta, Era, YsxC для изучения их роли в формировании биопленок и образовании покоящихся форм.

Аннотация результатов, полученных в 2022 году
Работу по проекту в 2022 году можно условно разделить на четыре глобальных задачи: Задача 1. Белок YsxC. Сборка рибосомных субъединиц в клетке – это высокоточный процесс, который регулируется специализированными факторами созревания. Одним из таких представителей является гуанозинтрифосфат (ГТФ)-связывающий белок YsxC, который выполняет структурную и организационную функции на поздних этапах сборки большой субъединицы рибосомы. Ранее в 2021 году нами был оптимизирован протокол экспрессии, выделения и очистки белка YsxC и установлено, что фьюжант белок YsxC+GB1 выделяется из телец включения методом рефолдинга, и данный конструкт был стабилен при концентрировании до 10 мг/мл и выше. Однако при протеолитическом отщеплении домена GB1 с помощью фермента TEV-протеазы стабильность белка снижалась и при концентрировании свыше 8.5 мг/мл происходила агрегация препарата. По этой причине было принято решение продолжить в 2022 году поиск оптимальных буферных условий для выделения и очистки белкового фактора YsxC с целью увеличить стабильность и концентрацию белка, и возможности перейти к этапу кристаллизации. Был оптимизирован состав буферов как на этапе выделения белка из культуры клеток E. coli, так и на этапах его очистки методом аффинной хроматографии и гельфильтрации. В результате удалось оптимизировать протокол выделения и очистки и получить препарат белка с концентрацией 10 мг/мл, стабильный при 22 °С для дальнейшего поиска условий кристаллизации. Анализ размера, формы и ориентации доменов методом малоуглового рентгеновского рассеяния (МУРР или SAXS) показал, что белок остается мономером при высоких концентрациях. Полученный данным методом вид поверхности электронной плотности указывает на то, что белковая молекула в растворе находится в компактном виде, не имеет неструктурированных частей, которые бы могли мешать дальнейшей её кристаллизации и решению структуры методом РСА. Далее производили поиск условий кристаллизации методом диффузии водяных паров в висячей капле при температуре 22 °С, и были получены монокристаллы белка, для которых на лабораторном дифрактометре Rigaku XtaLAB Synergy-S были зарегистрированы данные дифракции рентгеновских лучей и получена карта электронной плотности с разрешением сначала 3 Å, а после оптимизации условий кристаллизации и криопротекции с разрешением 2.0 Å. В результате методом РСА была впервые установлена структура белка YsxC из Staphylococcus aureus с высоким разрешением. Поскольку на предыдущем году реализации проекта не удавалось получить стабильного препарата для кристаллизации, параллельно с поиском условий для кристаллизации производился поиск условий для выделения белка YsxC на минимальной синтетической среде М9 для возможности проведения экспериментов по установлению структуры меченого по изотопам 13С и 15N белка в растворе методом спектроскопии ЯМР. Был оптимизирован протокол выделения и очистки меченного белка и в итоге получен образец объемом 250 мкл с концентрацией 2 мМ для последующих экспериментов по спектроскопии ЯМР. Задача 2. Белок Era Созревание малой 30S-субъединицы рибосомы в бактериальной клетке регулируется определенными факторами сборки, работающими в строгой последовательности. Одним из таких факторов является гуанозинтрифосфатсвязывающая гидролаза (ГТФаза) Era (Escherichia coli Ras-like protein), отвечающая за поздние этапы сборки рибосомной частицы и контролирующая таким образом клеточный рост и деление. На предыдущем году реализации проекта в 2021 году нами были подобраны условия выделения и очистки белка Etta из Staphylococcus aureus и в текущем 2022 году проводился поиск условий кристаллизации и анализ образцов белка методом МУРР (SAXS). Полученная 3D-модель электронной плотности свидетельствует о том, что белок Era из золотистого стафилококка находится в растворе при высоких концентрациях виде мономера. Далее мы перешли к подбору условий кристаллизации методом диффузии водяных паров в висячей капле и были получены монокристаллы белка Era размером 80 × 50 × 40 мкм. Для подтверждения того, что полученные кристаллы являются кристаллами целевого белка, использовали методику отмывки, растворения кристаллов в воде и анализ полученного раствора с помощью денатурирующего электрофореза в ПААГ. Дифракционная картина, полученная на лабораторном дифрактометре Rigaku XtaLAB Synergy-S, соответствовала дифракции рентгеновского излучения на элементарной ячейке белкового кристалла с разрешением ~4 Å. На данный момент полученные условия не позволяют получить структуру белка Era с высоким разрешением и необходима дальнейшая оптимизация условий кристаллизации и криопротекции кристалла, а также регистрация данных на более интенсивном синхротронном источнике излучения, что будет выполняться в следующем году выполнения проекта. Задача 3. Белок Etta На первом году реализации проекта был разработан протокол выделения и очистки белка, позволяющий получить препарат Etta из Staphylococcus aureus c концентрацией 11,5 мг/мл. Однако оказалось, что данный препарат не подходит для кристаллизации, так как белок был стабилен в течении 12-18 часов при температуре 4 °С и поиск условий кристаллизации белка Etta методом диффузии водяных паров в висячей капле не дал результатов. По этой причине было принято решение продолжить оптимизацию буферных условий для стабилизации белка. В результате удалось получить образец белка с концентрацией 20 мг/мл стабильный в течение длительного времени (более 48 часов) при комнатной температуре, что позволяло возобновить поиск условий кристаллизации. Для данного белка были получены иглообразные кристаллы. На данный момент размер кристаллов не позволяет получить дифракцию с высоким разрешением и необходима дальнейшая оптимизация условий кристаллизации и сбор данных на синхротронном источнике, что будет выполняться в следующем году выполнения проекта. Задача 4. Делеционные мутанты по генам era, etta, ysxC Для получения делеционных мутантов прокартиот использовался метод делеции через гомологическую рекомбинацию. Были созданы конструкции, содержащию в себе фланкирующие участки гена, который необходимо было удалить из генома. Эти фланкирующие участки представляли собой последовательности в геноме справа и слева от целевого гена, размером не менее 1 тысячи нуклеотидов длиной. Если ДНК с данными последовательностями попадает в клетки, есть вероятность, что произойдет гомологическая рекомбинация между ней и участком генома (который помимо данных фланкирующих последовательностей содержит еще и целевой ген), и в результате этой рекомбинации, последовательности поменяются местами, таким образом, что целевой фрагмент с фланкирующими участками заменит последовательность с целевым геном в геноме. Для проведения делеции в S.aureus была собрана генетическая конструкция, в которую могут быть клонированы фланкирующие последовательности, и с помощью которой можно будет проводить селекцию бактерий, в которых произошла рекомбинация. За основу был взят вектор pKOR1 - шаттл вектор для E.coli/S.aureus. В нем, при индукции окситетрациклином, транскрибируется антисмысловая РНК для одного из жизненно важных генов S.aureus, что позволяет проводить селекцию клонов с рекомбинацией. Таким образом были созданы конструкции pKOR1::fl-del-YsxC, pKOR1::fl-del-Etta, pKOR1::fl-del-Era для трансформации в клетки S. aureus и делеции генов ysxС, era и ettA. Полученные вектора были электропорированы в клетки S. aureus RN4220 и проводили отбор клонов, где произошла вторичная рекомбинация между уже интегрированной в геном плазмидой и участком с геном и фланками, в ходе которой интегрированная плазмида элиминировалась из генома, а участок с геном заменялся на фланки без него. Таким образом были получены делеционные мутанты по генам era, etta, ysxC, которые будут использованы на следующем этапе проекта по анализу роли данных замен на кривые роста бактерий S. aureus

Аннотация результатов, полученных в 2023 году
На третьем году реализации проекта был проведен анализ кривых роста и результаты тестов на формирование биопленок клеток Staphylococcus aureus с делетированными генами ettA, era, ysxC, который показал, что делеция гена ysxC летальна; делетированный по гену ettA мутант не показал значимых отличий в динамике роста клеток от дикого типа Staphylococcus aureus; мутант, делетированный по гену era в свою очередь показал двукратное ухудшение роста и размножения клеток Staphylococcus aureus. На предыдущем году реализации проекта нами были получены иглообразные кристаллы предположительно белка Etta из Staphylococcus aureus. В 2023 году для данных кристаллов были зарегистрированы данные рентгеновской дифракции на синхротронном источнике излучения, которые показали, что дифракционные картины соответствовали дифракции кристаллов сульфата магния. По этой причине было принято решение вернуться к этапу оптимизации буферных условий для белка EttA и продолжить поиск условий кристаллизации. Эксперимент по малоугловому рентгеновскому рассеянию в буферном растворе с pH 8.0, ионной силой буфера 300 мМ показал, что при концентрации 10 мг/мл происходит потеря третичной структуры белка (денатурация), что обуславливает необходимость дальнейшей оптимизации протокола экспрессии. Далее нами был разработан протокол получения белка Etta в апо-форме не связанном молекулами АТФ, который позволил получить стабильный препарат белка для in vitro реконструкции комплекса с 50S субъединицей рибосомы S. aureus. В результате был получен препарат комплекса Etta-50S для последующих экспериментов по крио-электронной микроскопии. Для кристаллов апо-формы белка Era из Staphylococcus aureus был разработан оптимальный протокол криопротекции и зарегистрированы данные рентгеновской дифракции на синхротронном источнике излучения с разрешением 3.46 Å. Также получены кристаллы комплекса белка Era в комплексе с ГДФ пригодные для регистрации данных РСА на следующем году реализации проекта. Был получен меченный по изотопам 13С и 15N образец белка YsxC из Staphylococcus aureus для которого были зарегистрированы спектры ЯМР, однако при высоких концентрациях он оказался не термостабилен и денатурировал, что не позволяет на данном этапе получить спектры ЯМР подходящего качества. Однако ранее методом кристаллографии нами была получена структура апо-формы данного белка с разрешением 2 Å, что позволило перейти к поиску условий кристаллизации белка YsxC с ГТФ, ГДФ и нерасщепляемыми аналогами, а также к in vitro реконструкции комплекса с 50S субъединицей рибосомы S. aureus. В результате был получен препарат комплекса YsxC-50S для последующих экспериментов по крио-электронной микроскопии.