КАРТОЧКА ПРОЕКТА,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

 

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ


Номер 21-74-20120

НазваниеВлияние структурирования белков внеклеточного матрикса под действием электрического поля на поведение клеток для задач тканевой инженерии

РуководительНащекин Алексей Викторович, Кандидат физико-математических наук

Организация финансирования, регионФедеральное государственное бюджетное учреждение науки Физико-технический институт им. А.Ф. Иоффе Российской академии наук, г Санкт-Петербург

Годы выполнения при поддержке РНФ 2021 - 2024 

КонкурсКонкурс 2021 года по мероприятию «Проведение исследований на базе существующей научной инфраструктуры мирового уровня» Президентской программы исследовательских проектов, реализуемых ведущими учеными, в том числе молодыми учеными

Объект инфраструктуры Центр клеточных технологий ИНЦ РАН

Область знания, основной код классификатора 04 - Биология и науки о жизни, 04-204 - Биофизика

Ключевые словаСтруктурированный коллаген, фибриллизация, молекулярный коллаген, клетки, внеклеточный матрикс, нативная ткань, электрические поля, роговица глаза.

Код ГРНТИ62.33.31


 

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ


Аннотация
Коллаген – один их главных компонентов внеклеточного матрикса, присущий различным типам тканей, в каждой из которых, он имеет определенную структуру. Он широко используется для приготовления носителей (скаффолдов) для культивирования и трансплантации различного типа клеток при восстановлении повреждённых тканей. В организме внеклеточный матрикс преимущественно состоит из микро- и нанопаттернов, имеющих изотропный или анизотропный характер. Так, строма роговицы глаза - ткань с выраженной топографической структурой. Заболевание (помутнение) роговицы (роговичная слепота) – одно из самых распространенных причин инвалидности по поводу патологии органа зрения, связано именно с нарушением структурной организации коллагена роговицы. По данным ВОЗ, около 8 миллионов человек во всем мире слепы в результате патологии роговицы, при этом ежегодно в мире проводится менее 100.000 операций по трансплантации роговицы. Долгосрочные наблюдения показывают, что судьба роговичного трансплантата не столь оптимистична, как это принято считать. Все это доказывает актуальность работ в данном направлении. Исследования in vitro взаимодействия клеток с рифлёной поверхностью показали влияние топографии поверхности на поведение клеток: на адгезию, морфологию, ориентацию, пролиферацию, миграцию и дифференцировку клеток. К примеру, шероховатость и наноостровки на поверхности могут оказывать влияние на адгезию клеток, а борозды на их морфологию, ориентацию и миграцию. Критическое влияние на оказываемый эффект играет высота, диаметр и расстояние между топографическими элементами. К сожалению, общепринятые методы формирования носителей на основе коллагена не позволяют контролировать структуру носителя, а именно, размеры фибрилл, их упорядочение и ориентацию. Одним из перспективных способов формирования ориентированных фибрилл является электрохимический метод, однако в современной научной литературе данных по применению данного метода ничтожно мало. Это объясняется сложностью фундаментальных механизмов самосборки молекулярного коллагена в условиях внешних полей. Поэтому данный Проект нацелен на исследование возможностей управления поведением клеток, культивируемых на белках, структурированных во внешнем электрическом поле.

Ожидаемые результаты
В течение 2021-22 годов будет проведено физико-математическое моделирование процессов упорядоченной сборки в условиях приложения внешнего электрического поля с учетом равномерного распределения заряженных функциональных групп по всей длине молекулы коллагена. Будет разработана и изготовлена электрохимическая ячейка с золотыми электродами различной конфигурации (обеспечение различной напряженности поля, а также вариации формы прикладываемого потенциала), отработаны условия электрохимического формирования коллагеновых фибрилл, состав рабочего раствора и оптимальные внешние факторы (сила тока, напряжение, частота и напряженность электрического поля). Для формирования поперечных сшивок будет разработан метод химического связывания молекул коллагена и фибрилл. Будет оценена структура сформированных фибрилловых структур и их механическая прочность в зависимости от состава рабочего раствора и условий формирования. В течение 2023 года после отработки электрохимических условий формирования фибрилл в состав рабочего раствора будут введены дополнительные компоненты внеклеточного матрикса и изучены механизмы формирования композиционных структур, максимально идентичных нативной ткани. На заключительном этапе проекта серия композиционных фибриллообразных коллагеновых структур будет протестирована на клеточных культурах. Предполагается изготовление прототипа искусственной роговицы глаза. Научная значимость результатов работы заключается в глубоком фундаментальном понимании механизмов самосборки молекулярного коллагенаи его структурирование при внешнем воздействии электрических полей заданной конфигурации. Прикладное значение полученных результатов сложно переоценить. Разработанные структуры найдут применение для задач офтальмологии, тканевой инженерии, для проведения операций по трансплантации органов животных и человека.


 

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ


Аннотация результатов, полученных в 2021 году
- Разработана герметичная жидкостная ячейка методом 3D печати. В конструкции ячейки учитывались следующих требования: герметичность, габаритные размеры под предметное стекло, а также наличие прорезей на торцах ячейки для установки металлических электродов (в виде проволок) с заданным расстоянием между ними. - Рассчитаны и с помощью универсального pH-индикатора определены оптимальные рабочие режимы, обеспечивающие успешное формирование коллагеновых фибрилл в разработанной жидкостной ячейке. - Разработана и методом лазерной литографии изготовлена система золотых электродов на стеклянных подложках для модуляции напряженности электрического поля и формы электрического потенциала. - Методом математического моделирования физического процесса в программной среде ComSol Mathematics рассчитана напряженность прикладываемого электрического поля при напряжении 1 В, расстоянии между электродами 0.5 - 1 мм, толщине электродов 1 мкм в условиях жидкой среды (вода) на стеклянной подложке. - Рассмотрена теоретическая модель формирования пучков фибриллярного коллагена в изоэлектрической точке между двух параллельных электродов, основанная на перезарядке молекулярного коллагена обоюдно в поле градиента pH и внешнего электрического поля. Экспериментально показано, что для формирование фибриллярного коллагена в изоэлектрической точке, необходимо присутствие сильного внешнего электрического поля совместно с высоким градиентом pH. - Показано, что для формирования однородных по размерам фибрилл коллагена во внешнем электрическом поле необходимо использовать бестелопептидный коллаген - С помощью оптимизации поляризационного микроскопа МИН-8 дополнительной фазовой цельноволновой пластинки, показана возможность наблюдения областей сформированных коллагеновых фибрилл между электродами различной геометрии за счет выявления эффекта двулучепреломления. Показано, что область упорядоченных коллагеновых фибрилл связана с формой электродов. - Методом атомно-силовой микроскопии показано формирование анизотропных областей коллагеновых фибрилл в области изоэлектрической фокусировки. - Методом электрофореза подтверждена структура коллагена I типа, полученная из сухожилий крысиных хвостов. В частности, наличие бандов с размером 130 кДа свидетельствует о присутствии α1 и α2 цепей, характерных для молекулы коллагена I типа. - Структура выделенного коллагена I типа подтверждена методом ИК-Фурье спектроскопии. На спектре были выявлены характерные для коллагена сигналы – валентные колебания N-H (Амиды А и В); валентные колебания С=О, С-N и деформационные колебания N-H (Амиды I); деформационные колебания N-H и валентные колебания С-N (Амиды II); валентные колебания С-N (Амиды III). Полученный спектр коллагена согласуется с литературными данными. - На основе полученного молекулярного и фибриллярного коллагена были сформированы пленки и измерены их механические характеристики. - Исследован метод химической сшивки с использованием агента EDC/NHS(1-Этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимид/N-Гидроксисукцинимид). Показано что присутствие сшивающего агента практически не влияет на прочность коллагеновых пленок и на их упругость, при этом в экспериментах по растяжению пленок продемонстрировано незначительное уменьшение их эластичности. - Методом ИК-Фурье спектроскопии показано, что сшивание коллагена с EDC не создает новые связи, однако пик, соответствующий связи С-О заметно снижается при добавлении 10% сшивающего агента. - С помощью просвечивающей электронной микроскопии показано, что белок фибронектин влияет на диаметр образующихся коллагеновых фибрилл. В образце с коллагеновыми фибриллами без добавления фибронектина диаметр фибрилл варьируется от 70 до 90 нм, в то время как в образце с добавлением фибронектина средний диаметр фибрилл коллагена составляет порядка 60 нм. - Исследовано влияние структуры коллагена, а также присутствия фибронектина при взаимодействии клеток линии MSCWJ-1 с полученными субстратами. Показано, что по истечении 1 суток клетки распластаны и имеют веретеновидную форму. На образцах с фибриллярным коллагеном отчетливо проявляются фибриллы коллагена, в то время как на образцах с молекулярным коллагеном таких структур не наблюдали. - Смоделировано влияние свободных радикалов в теле человека на коллаген воздействие свободных радикалов на коллаген, путем добавления разной концентрации перекиси водорода – 0.006%, 0.015%, 0.03% и 0.15%. Показано, что добавление перекиси водорода в нарастающей концентрации приводит к утонению фибрилл коллагена до 2 раз при концентрации 0.15%. Структурные изменения при воздействии перекиси показаны также методом ИК-Фурье спектроскопии и СЭМ. По результатам данной части работы опубликована статья в высокорейтинговом издании Polymers (MDPI): Yuliya Nashchekina, Pavel Nikonov, Nataliya Mikhailova, Alexey Nashchekin. Collagen Scaffolds Treated by Hydrogen Peroxide for Cell CultivationPolymers. 2021, 13(23), 4134; DOI:10.3390/polym13234134 (Q1). - Показано с помощью СЭМ, что удаление остатков глюкозы и галактозы в результате воздействия перекиси водорода на молекулы коллагена уменьшает расстояние между молекулами, что приводит к уменьшению диаметра фибрилл коллагена. - Путем использования клеток различного тканевого происхождения, включая первичную культуру (ASC) и трансформированные клеточные линии, что в течение 1 часа после посева на поверхность, модифицированную фибриллами коллагена, было прикреплено больше клеток по сравнению с положительным контролем (стекло). Обработка низкой концентрацией раствора перекиси увеличивает адгезию всех типов исследуемых культур клеток, при этом увеличение концентрации перекиси приводит к уменьшению количества прикрепленных клеток MG-63. - Путем обработки пепсином получен бестелопептидный коллаген I типа. - Показано, что удаление концевых телопептидов можно контролировать по изменению ИК-спектра в области характерной для аминокислоты тирозин, благодаря присутствию этой аминокислоты в телопептидах и отсутствии ее в коллагеновых цепях. - Методом МТТ показано отсутствие токсического эффекта коллагена с телопептидами и без телопептидов на клетках линий FetMSCs и Sirc. - Методом конфокальной микроскопии показано отсутствие влияния обработки коллагена пепсином на организацию актинового цитоскелета клеток.

 

Публикации

1. А.А. Гайдаш, М. И. Блинова, С.А. Александрова, Ю.А. Нащекина, В.К. Крутько, О.Н. Мусская, К.В. Скроцкая, А.В. Нащекин, Н.А. Михайлова, А.И. Кулак. Морфогенез остеоидных структур при культивировании мезенхимных стромальных клеток на фибриллярном коллагене в присутствии силикоалюмофосфата. Цитология, - (год публикации - 2021).

2. Нащекин А.В., Лихачев А.И., Луконина О.А., Сироткина М. Ю., Нащекина Ю.А. КОМПОЗИТНЫЕ МАТРИЦЫ НА ОСНОВЕ КОЛЛАГЕНОВ РАЗНЫХ ТИПОВ ДЛЯ ЗАДАЧ ТКАНЕВОЙ ИНЖЕНЕРИИ Нальчик: Издательство «Принт Центр», Новые полимерные композиционные материалы Микитаевские чтения. Материалы ХVII Международной научно-практической конференции. Страница 170. (год публикации - 2021).

3. Нащекина Ю.А., Никонов П.О., Михайлова Н.А., Нащекин А.В. Collagen Scaffolds Treated by Hydrogen Peroxide for Cell Cultivation Polymers (MDPI), - (год публикации - 2021).


Аннотация результатов, полученных в 2022 году
1. Проведено моделирование механизма фибриллообразования на основе расчета зарядового состояния одиночных молекул коллагена I и V в условиях присутствия градиента рН, формируемого за счет гидролиза молекул воды во внешнем электрическом поле. 2. С учетом последовательности аминокислот для участков альфа1 и альфа2 цепей коллагена рассчитана точка изоэлектрической фокусировки коллагена I типа: pH≈10.5. Данная оценка верифицирована экспериментально. 3. С учетом последовательности аминокислот для участков альфа1 и альфа2 цепей коллагена V типа, рассчитана точка изоэлектрической фокусировки коллагена: pH≈4.5. Ввиду отсутствия у коллагена V типа эффекта фибриллогенеза, экспериментально мы не смогли подтвердить полученное значение для изоэлектрической точки. 4. Предложена модель формирования коллагеновых фибрилл перпендикулярно внешнему электрическому полю в изоэлектрической точке за счет связывания двух одиночных молекул коллагена с образованием бимолекулярных комплексов, имеющих нескомпенсированные заряды разного знака на противоположных концах комплекса. Полученный бимолекулярный диполь определяет разворот комплекса в изоточке, где происходит последовательное связывание комплексов между собой с образованием фибриллы. 5. Показано, что в случае различной конфигурации внешнего электрического поля за счет варьирования формы электродов, можно управлять геометрией фибриллярной структуры коллагена I типа, а также композитов на его основе. 6. Методом изоэлектрической фокусировки при сравнении коллагенов I, V и смеси I + V типов показано: • Коллаген V типа не формирует параллельно ориентированной фибриллярной структуры при изоэлектрической фокусировке во внешнем электрическом поле. • смесь коллагенов I и V типов формирует структурированную композитную матрицу в области изоточки, характерной для I типа коллагена. • положение изоточки как для коллагена I типа, так и для смеси коллагенов I и V типов хорошо согласуется с результатом численного моделирования на основе зарядовой модели. • практически идентичное положение изоточки для I типа коллагена и смеси коллагенов двух типов свидетельствует об отсутствии влияния коллагена V типа на процесс изофокусировки коллагена I типа. 7. Методом ферментативной экстракции был выделен коллаген V типа и исследована его структура. На основании выделенных коллагенов I и V типов были сформированы композиционные матрицы и проанализирована их структура. Показано, что в присутствии коллагена V типа диаметр композиционных коллагеновых фибрилл меньше по сравнению с гомогенными коллагеновыми фибриллами. 8. При сравнительном анализе ИК-Фурье спектров коллагена I и V типов, деконволюция полосы амида I в ИК спектрах позволяет различать типы коллагенов между собой. В этой полосе содержится информация о вторичной структуре вещества. Измерены процентные соотношения α-спиралей и β-структур для коллагенов I и V типа 9. Методом МТТ показано, что композиционные матрицы не оказывают токсического влияния на мезенхимные стромальные клетки человека (клеточная линия FetMSCs) и клеток роговицы SIRC. Морфология клеток, культивируемых на композиционных коллагеновых матрицах, изменяется пропорционально содержанию коллагена V типа в композиционных матрицах. Чем больше коллагена V типа в композитных матрицах, тем меньше степень распластанности. Наибольшую степень распластанности клеток роговицы наблюдали на композитных фибриллах, содержащий 20% коллагена V типа. В присутствии коллагена V типа клетки клетки роговицы собираются в колонии, характерные для эпителиальных клеток, к которым относится и роговица. В результате формирования таких колоний должны образовываться плотные межклеточные контакты.

 

Публикации

1. Гайдаш А.А., Крутько В.К., Блинов М.И., Нащекин А.В., Мусская О.Н., Скротская К.В., Сычева О.А., Кубитская Л.В., Токальчик Ю.П., Кудак А.И. Physicochemical Properties of Paravertebral Tendons Cell and Tissue Biology, Cell and Tissue Biology, 2022, Vol. 16, No. 5, pp. 487–498 (год публикации - 2022).

2. Нащекин А.В., Лихачев А.И., Марков Д.А., Нащекина Ю.А., Павлов С.И., Сироткина М.Ю. ОСОБЕННОСТИ ФОРМИРОВАНИЯ ФИБРИЛЛЯРНОГО КОЛЛАГЕНА ПОД ДЕЙСТВИЕМ ВНЕШНИХ ЭЛЕКТРИЧЕСКИХ ПОЛЕЙ IN-VITRO г. Нальчик: Издательство «Принт Центр», 4-9 июля 2022 г. Р67, стр. 239 (год публикации - 2022).

3. Нащекина Ю., Чабина А., Москалюк О., Воронкина И., Евстигнеева П., Ваганов Г., Нащекин А., Юдин В., Михайлова Н. Effect of Functionalization of the Polycaprolactone Film Surface on the Mechanical and Biological Properties of the Film Itself Polymers, Polymers 2022, 14, 4654 (год публикации - 2022).

4. Нащекина Ю.А., Никонов П., Прасолов Н., Сулатский М., Чабина А., Нащекин А. The Structural Interactions of Molecular and Fibrillar Collagen Type I with Fibronectin and Its Role in the Regulation of Mesenchymal Stem Cell Morphology and Functional Activity Int. J. Mol. Sci., Int.J.Mol.Sci. 2022, 23, 12577, 1-14 (год публикации - 2022).

5. Сироткина М.Ю., Зенкова А. К., Шабельников С. В., Нащекин А. В., Нащекина Ю. А. КОМПОЗИТНЫЕ КОЛЛАГЕНОВЫЕ ПЛЕНКИ ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ КЛЕТОК РОГОВИЦЫ Цитология, ЦИТОЛОГИЯ том 64 № 7 2022, стр 752-753 (год публикации - 2022).

6. Сироткина М.Ю., Зенкова А.К., Шабельников С.В., Нащекин А.В., Нащекина Ю.А. ИССЛЕДОВАНИЕ БИОСОВМЕСТИМОСТИ МАТРИЦ НА ОСНОВЕ ГИБРИДНЫХ ФИБРИЛЛ КОЛЛАГЕНОВ I И V ТИПА Гены и клетки. МАТЕРИАЛЫ V НАЦИОНАЛЬНОГО КОНГРЕССА ПО РЕГЕНЕРАТИВНОЙ МЕДИЦИНЕ Москва, 23–25 ноября 2022 г., Том XVII, № 3, 2022, стр. 210-211 (год публикации - 2022).

7. Сироткина М.Ю., Нащекина Ю.А. Collagen Fibrils of Various Diameters: Formation Conditions and Principles of Functioning Cell and Tissue Biology, Cell and Tissue Biology, 2022, Vol. 16, No. 6, pp. 513–520 (год публикации - 2022).