Аннотация результатов, полученных в 2021 году
- Разработана герметичная жидкостная ячейка методом 3D печати. В конструкции ячейки учитывались следующих требования: герметичность, габаритные размеры под предметное стекло, а также наличие прорезей на торцах ячейки для установки металлических электродов (в виде проволок) с заданным расстоянием между ними. - Рассчитаны и с помощью универсального pH-индикатора определены оптимальные рабочие режимы, обеспечивающие успешное формирование коллагеновых фибрилл в разработанной жидкостной ячейке. - Разработана и методом лазерной литографии изготовлена система золотых электродов на стеклянных подложках для модуляции напряженности электрического поля и формы электрического потенциала. - Методом математического моделирования физического процесса в программной среде ComSol Mathematics рассчитана напряженность прикладываемого электрического поля при напряжении 1 В, расстоянии между электродами 0.5 - 1 мм, толщине электродов 1 мкм в условиях жидкой среды (вода) на стеклянной подложке. - Рассмотрена теоретическая модель формирования пучков фибриллярного коллагена в изоэлектрической точке между двух параллельных электродов, основанная на перезарядке молекулярного коллагена обоюдно в поле градиента pH и внешнего электрического поля. Экспериментально показано, что для формирование фибриллярного коллагена в изоэлектрической точке, необходимо присутствие сильного внешнего электрического поля совместно с высоким градиентом pH. - Показано, что для формирования однородных по размерам фибрилл коллагена во внешнем электрическом поле необходимо использовать бестелопептидный коллаген - С помощью оптимизации поляризационного микроскопа МИН-8 дополнительной фазовой цельноволновой пластинки, показана возможность наблюдения областей сформированных коллагеновых фибрилл между электродами различной геометрии за счет выявления эффекта двулучепреломления. Показано, что область упорядоченных коллагеновых фибрилл связана с формой электродов. - Методом атомно-силовой микроскопии показано формирование анизотропных областей коллагеновых фибрилл в области изоэлектрической фокусировки. - Методом электрофореза подтверждена структура коллагена I типа, полученная из сухожилий крысиных хвостов. В частности, наличие бандов с размером 130 кДа свидетельствует о присутствии α1 и α2 цепей, характерных для молекулы коллагена I типа. - Структура выделенного коллагена I типа подтверждена методом ИК-Фурье спектроскопии. На спектре были выявлены характерные для коллагена сигналы – валентные колебания N-H (Амиды А и В); валентные колебания С=О, С-N и деформационные колебания N-H (Амиды I); деформационные колебания N-H и валентные колебания С-N (Амиды II); валентные колебания С-N (Амиды III). Полученный спектр коллагена согласуется с литературными данными. - На основе полученного молекулярного и фибриллярного коллагена были сформированы пленки и измерены их механические характеристики. - Исследован метод химической сшивки с использованием агента EDC/NHS(1-Этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимид/N-Гидроксисукцинимид). Показано что присутствие сшивающего агента практически не влияет на прочность коллагеновых пленок и на их упругость, при этом в экспериментах по растяжению пленок продемонстрировано незначительное уменьшение их эластичности. - Методом ИК-Фурье спектроскопии показано, что сшивание коллагена с EDC не создает новые связи, однако пик, соответствующий связи С-О заметно снижается при добавлении 10% сшивающего агента. - С помощью просвечивающей электронной микроскопии показано, что белок фибронектин влияет на диаметр образующихся коллагеновых фибрилл. В образце с коллагеновыми фибриллами без добавления фибронектина диаметр фибрилл варьируется от 70 до 90 нм, в то время как в образце с добавлением фибронектина средний диаметр фибрилл коллагена составляет порядка 60 нм. - Исследовано влияние структуры коллагена, а также присутствия фибронектина при взаимодействии клеток линии MSCWJ-1 с полученными субстратами. Показано, что по истечении 1 суток клетки распластаны и имеют веретеновидную форму. На образцах с фибриллярным коллагеном отчетливо проявляются фибриллы коллагена, в то время как на образцах с молекулярным коллагеном таких структур не наблюдали. - Смоделировано влияние свободных радикалов в теле человека на коллаген воздействие свободных радикалов на коллаген, путем добавления разной концентрации перекиси водорода – 0.006%, 0.015%, 0.03% и 0.15%. Показано, что добавление перекиси водорода в нарастающей концентрации приводит к утонению фибрилл коллагена до 2 раз при концентрации 0.15%. Структурные изменения при воздействии перекиси показаны также методом ИК-Фурье спектроскопии и СЭМ. По результатам данной части работы опубликована статья в высокорейтинговом издании Polymers (MDPI): Yuliya Nashchekina, Pavel Nikonov, Nataliya Mikhailova, Alexey Nashchekin. Collagen Scaffolds Treated by Hydrogen Peroxide for Cell CultivationPolymers. 2021, 13(23), 4134; DOI:10.3390/polym13234134 (Q1). - Показано с помощью СЭМ, что удаление остатков глюкозы и галактозы в результате воздействия перекиси водорода на молекулы коллагена уменьшает расстояние между молекулами, что приводит к уменьшению диаметра фибрилл коллагена. - Путем использования клеток различного тканевого происхождения, включая первичную культуру (ASC) и трансформированные клеточные линии, что в течение 1 часа после посева на поверхность, модифицированную фибриллами коллагена, было прикреплено больше клеток по сравнению с положительным контролем (стекло). Обработка низкой концентрацией раствора перекиси увеличивает адгезию всех типов исследуемых культур клеток, при этом увеличение концентрации перекиси приводит к уменьшению количества прикрепленных клеток MG-63. - Путем обработки пепсином получен бестелопептидный коллаген I типа. - Показано, что удаление концевых телопептидов можно контролировать по изменению ИК-спектра в области характерной для аминокислоты тирозин, благодаря присутствию этой аминокислоты в телопептидах и отсутствии ее в коллагеновых цепях. - Методом МТТ показано отсутствие токсического эффекта коллагена с телопептидами и без телопептидов на клетках линий FetMSCs и Sirc. - Методом конфокальной микроскопии показано отсутствие влияния обработки коллагена пепсином на организацию актинового цитоскелета клеток.

Аннотация результатов, полученных в 2022 году
1. Проведено моделирование механизма фибриллообразования на основе расчета зарядового состояния одиночных молекул коллагена I и V в условиях присутствия градиента рН, формируемого за счет гидролиза молекул воды во внешнем электрическом поле. 2. С учетом последовательности аминокислот для участков альфа1 и альфа2 цепей коллагена рассчитана точка изоэлектрической фокусировки коллагена I типа: pH≈10.5. Данная оценка верифицирована экспериментально. 3. С учетом последовательности аминокислот для участков альфа1 и альфа2 цепей коллагена V типа, рассчитана точка изоэлектрической фокусировки коллагена: pH≈4.5. Ввиду отсутствия у коллагена V типа эффекта фибриллогенеза, экспериментально мы не смогли подтвердить полученное значение для изоэлектрической точки. 4. Предложена модель формирования коллагеновых фибрилл перпендикулярно внешнему электрическому полю в изоэлектрической точке за счет связывания двух одиночных молекул коллагена с образованием бимолекулярных комплексов, имеющих нескомпенсированные заряды разного знака на противоположных концах комплекса. Полученный бимолекулярный диполь определяет разворот комплекса в изоточке, где происходит последовательное связывание комплексов между собой с образованием фибриллы. 5. Показано, что в случае различной конфигурации внешнего электрического поля за счет варьирования формы электродов, можно управлять геометрией фибриллярной структуры коллагена I типа, а также композитов на его основе. 6. Методом изоэлектрической фокусировки при сравнении коллагенов I, V и смеси I + V типов показано: • Коллаген V типа не формирует параллельно ориентированной фибриллярной структуры при изоэлектрической фокусировке во внешнем электрическом поле. • смесь коллагенов I и V типов формирует структурированную композитную матрицу в области изоточки, характерной для I типа коллагена. • положение изоточки как для коллагена I типа, так и для смеси коллагенов I и V типов хорошо согласуется с результатом численного моделирования на основе зарядовой модели. • практически идентичное положение изоточки для I типа коллагена и смеси коллагенов двух типов свидетельствует об отсутствии влияния коллагена V типа на процесс изофокусировки коллагена I типа. 7. Методом ферментативной экстракции был выделен коллаген V типа и исследована его структура. На основании выделенных коллагенов I и V типов были сформированы композиционные матрицы и проанализирована их структура. Показано, что в присутствии коллагена V типа диаметр композиционных коллагеновых фибрилл меньше по сравнению с гомогенными коллагеновыми фибриллами. 8. При сравнительном анализе ИК-Фурье спектров коллагена I и V типов, деконволюция полосы амида I в ИК спектрах позволяет различать типы коллагенов между собой. В этой полосе содержится информация о вторичной структуре вещества. Измерены процентные соотношения α-спиралей и β-структур для коллагенов I и V типа 9. Методом МТТ показано, что композиционные матрицы не оказывают токсического влияния на мезенхимные стромальные клетки человека (клеточная линия FetMSCs) и клеток роговицы SIRC. Морфология клеток, культивируемых на композиционных коллагеновых матрицах, изменяется пропорционально содержанию коллагена V типа в композиционных матрицах. Чем больше коллагена V типа в композитных матрицах, тем меньше степень распластанности. Наибольшую степень распластанности клеток роговицы наблюдали на композитных фибриллах, содержащий 20% коллагена V типа. В присутствии коллагена V типа клетки клетки роговицы собираются в колонии, характерные для эпителиальных клеток, к которым относится и роговица. В результате формирования таких колоний должны образовываться плотные межклеточные контакты.

Аннотация результатов, полученных в 2023 году
1. Добавление 10 и 30% гиалуроновой кислоты в раствор коллагена 1 типа в процессе формирования фибрилл не препятствует фибриллобразованию, в то время как добавление 50% гиалуроновой кислоты от массы коллагена полностью блокирует формирование коллагеновых фибрилл. 2. Добавление гиалуроновой кислоты в коллаген при формировании фибрилл приводит к уменьшению жизнеспособности клеток, что обусловлено снижением рН подложки из-за добавления соляной кислоты (необходимо для растворения гиалуроновой кислоты). Действительно, после тщательной промывки жизнеспособность клеток линии FetMSC и SIRC, после 3 суток культивирования не уменьшается. 3. Методами оптической и конфокальной микроскопии показано, что морфология клеток, культивируемых в течение 1 суток на исследуемых подложках, не имеет существенных отличий от контрольного образца. Мезенхимные стромальные клетки имеют характерную вытянутую, веретенообразую форму. При увеличении содержания гиалуроновой кислоты в составе композитных коллагеновых подложек количество прикрепившихся клеток уменьшается. 4. Композитные гели на основе коллагена и гиалуроновой кислоты (ГК) имитируют внеклеточный матрикс. Из-за хорошей растворимости ГК в водных средах ее необходимо фиксировать в фибриллах коллагенового геля. Высокую десорбцию из композитных гелей гиалуроновой кислоты можно избежать путем сшивания коллагеновых гелей фитиновой кислотой. 5. Определение методом Фурье-спектроскопии пика амида I позволило оценить конформацию молекул коллагена в нативном и денатурированном состояниях. Кроме того, этим методом было показано формирование перекрестных связей между фибриллами коллагена при добавлении фитиевой и гиалуроновых кислот. 6. Методом дифференциальной сканирующей калориметрии показано, что добавление фитиевой кислоты (в том числе и гиалуроновой кислоты) повышает значения температуры плавления относительно чистого коллагена. Это свидетельствует об увеличении степени сшивания коллагена после обработки. 7. Методом термогравиметрического анализа показано, что сшивание фитиевой кислотой (ФК) приводит к структурным изменениям композитной матрицы и может способствовать более сильному взаимодействию между молекулами коллагена, что приводит к повышенной термостойкости каркаса до температуры 150°C (температура термического разложения из-за карбонизации и удаления из ФК ОН-групп). 8. Результаты СЭМ показали, что присутствие фитиевой кислоты в коллагеновом геле не изменяет нативную структуру коллагеновых фибрилл. При этом нативная структура сшитых коллагеновых фибрилл кислотой не разрушалась после 2 дней инкубации в условиях постоянного фосфатного буфера и 7 дней инкубации в постоянных условиях. 9. Методами флуоресценции показано успешное присоединение флуоресцентных меток (активированный AF 488 NHS-эфир) к молекулам коллагена (сайт связывания лизина), в том числе продемонстрирована возможность 60-ти кратного разбавления раствора коллагенов с метками. Методом СЭМ показано, что привязанные метки не изменяют способность коллагенов формировать фибриллярные структуры с нативной структурой. 10. Фитиновая кислота не оказывает токсического воздействия на организм человека, в то время как гиалуроновая кислота влияет на морфологию клеток, культивируемых в коллагеновых гелях с добавлением фитиевой и/или гиалуроновой кислот. 11. Сшитые фитиновой кислотой коллагеновые гели обладают повышенной жесткостью по сравнению с контрольным образцом (без добавления фитиновой кислоты). 12. Клетки Hos и HepG2 чувствительны к ФК по сравнению с нормальной, несформировавшейся линией FetMSCs. Можно предположить, что сформированные гидрогели с фитиновой кислотой могут быть использованы в области тканей после удаления раковых опухолей. Гиалуроновая кислота, выделяющаяся из гидрогеля в процессе деградации, будет подавлять рост метастазов. 13. Методом флуоресцентной микроскопии и СЭМ показано выстраивание клеток на ориентированных во внешнем электрическом поле коллагеновых бандлах. 14. Разработана и методом 3D-принтинга изготовлена герметичная жидкостная ячейка с золотыми планарными электродами для осаждения тканеподобной коллагеновой структуры во внешнем электрическом поле. 15. Методом СЭМ показано, что на плоских тканеподобных коллагеновых структурах, полученных методом ориентирования во внешнем электрическом поле не формируется нативной фибриллярной структуры коллагена. При этом культивирование клеток FetMSC в течение 3 часов показало dscjre. распластываемость и пролиферацию клеток на таких поверхностях.