Аннотация результатов, полученных в 2021 году
Настоящий проект нацелен на определение количественных и качественных параметров редокс-гомеостаза в разных клеточных компартментах в условиях физиологической нормы, а также в условиях окислительного стресса, вызванного эндогенными или экзогенными факторами. Основная задача проекта – выяснить, какие ферментативные пути формируют редокс-ландшафт внутри отдельных органелл клетки и в какой степени он является зависимым от редокс-гомеостаза соседних областей. Методическая основа проекта – использование генетически кодируемого сенсора перекиси водорода HyPer (Belousov et al., Nat Methods. 2006), локализованного в разных клеточных компартментах. В качестве основной клеточной модели в проекте используются суспензионные клетки миелогенной лейкемии человека K-562, позволяющие анализировать флуоресцентный сигнал HyPer с применением метода проточной цитофлуорометрии. В текущем году в своих экспериментах мы использовали цитоплазматическую версию сенсора, и, соответственно, изучали особенности редокс-гомеостаза клеточной цитоплазмы. На первом этапе работы была отработана методика прижизненного цитометрического анализа клеток, позволяющая отслеживать в режиме реального времени процессы окисления/восстановления HyPer в клеточной цитоплазме при увеличении/снижении окислительной нагрузки на клетки. Полученные кинетические данные использовались для определения редокс-параметров клетки: разработаны протоколы анализа кинетики редокс-реакций HyPer с использованием уравнений химической кинетики, позволяющие оценивать цитоплазматический уровень перекиси водорода, индуцируемый внешним окислительным стрессом, а также константы скоростей реакций тиол-дисульфидного обмена в живых клетках. С использованием разработанных протоколов показано, что полноценный состав питательной среды важен для поддержания нормального редокс-метаболизма клетки, а обеднение питательными веществами, вызванное помещением клеток в фосфатно-солевой буферный раствор, способствует снижению активности тиол-дисульфидного обмена в клеточной цитоплазме. С использованием палитры ингибиторов обнаружено, что HyPer в цитоплазме клеток человека восстанавливается преимущественно с участием системы тиоредоксина. Показано, что в условиях внешнего окислительного стресса, при слабых окислительных нагрузках, эффективность системы антиоксидантной защиты клеток зависит от активности системы тиоредоксина, которая обеспечивает работоспособность пероксиредоксинов – ферментов, быстро элиминирующих избыточную перекись. В этих условиях, значение градиента между экстраклеточной и цитоплазматической концентрацией Н2О2 в клетках человека может исчисляться тысячами раз, но зависит от интенсивности окислительного воздействия. При увеличении окислительной нагрузки, приводящей к истощению системы тиоредоксина, градиент снижается до нескольких сотен раз и стабилизируется, поддерживаясь, по-видимому другими участниками системы антиоксидантной защиты (системой глутатиона и каталазой). Таким образом, результаты текущего года показывают, что HyPer может использоваться в клеточной биологии не только как сенсор перекиси водорода, но и как флуоресцентный репортер, характеризующий функциональную активность антиоксидантных и тиол-восстанавливающих систем в живых клетках.

Аннотация результатов, полученных в 2022 году
Настоящий проект нацелен на определение количественных и качественных параметров редокс-гомеостаза в разных клеточных компартментах в условиях физиологической нормы, а также в условиях окислительного стресса, вызванного эндогенными или экзогенными факторами. Основная задача проекта – выяснить, какие ферментативные пути формируют редокс-ландшафт внутри отдельных органелл клетки и в какой степени он является зависимым от редокс-гомеостаза смежных областей. Методическая основа проекта – использование генетически кодируемого сенсора перекиси водорода HyPer (Belousov et al., Nat Methods. 2006), локализованного в разных клеточных компартментах. В качестве основной клеточной модели в проекте используются суспензионные клетки миелогенной лейкемии человека K562, позволяющие анализировать флуоресцентный сигнал HyPer с применением метода проточной цитофлуорометрии. В текущем году в своих экспериментах мы использовали митохондриальную и ядерную версию сенсора, и, соответственно, изучали особенности редокс-гомеостаза клеточного ядра и митохондрий. С использованием палитры ингибиторов систем тиол-дисульфидного обмена обнаружено, что HyPer в ядре и митохондриях клеток человека восстанавливается преимущественно с участием системы тиоредоксина. Показано, что в условиях внешнего окислительного стресса, при слабых окислительных нагрузках, эффективность системы антиоксидантной защиты клеточного ядра и митохондрий зависит от активности системы тиоредоксина, которая обеспечивает работоспособность пероксидредоксинов – ферментов, наиболее быстро элиминирующих избыточную перекись. При увеличении окислительной нагрузки, приводящей к истощению системы тиоредоксина, градиент снижается и стабилизируется, поддерживаясь, по-видимому другими участниками системы антиоксидантной защиты (системой глутатиона и каталазой). Помимо этого, результаты проведенных в этом году экспериментов были сопоставлены с данными, полученными в прошлом году в аналогичных опытах с клетками, экспрессирующими цитоплазматический вариант сенсора. Проведенный анализ показал, что в условиях внешнего Н2О2-индуцированного стресса наименьший уровень Н2О2 обнаружен в клеточной цитоплазме, а наибольший – в ядре клеток К562. Активность системы тиоредоксина оказалась наибольшей в цитоплазме и наименьшей в митохондриях – как в отсутствие окислительной нагрузки, так в условиях окислительного стресса. В целом, полученные результаты позволяют сделать вывод о том, что цитоплазматическая система антиоксидантной защиты эффективнее справляется с избыточной перекисью водорода, чем ядерные и митохондриальные системы клеток К562.

Аннотация результатов, полученных в 2023 году
Настоящий проект нацелен на определение количественных и качественных параметров редокс-гомеостаза в разных клеточных компартментах в условиях физиологической нормы, а также в условиях окислительного стресса, вызванного эндогенными или экзогенными факторами. Основная задача проекта – выяснить, какие ферментативные пути формируют редокс-ландшафт внутри отдельных органелл клетки и в какой степени он является зависимым от редокс-гомеостаза смежных областей. Методическая основа проекта – использование генетически кодируемого сенсора перекиси водорода HyPer (Belousov et al., Nat Methods. 2006), локализованного в разных клеточных компартментах. В качестве основной клеточной модели в проекте используются суспензионные клетки миелогенной лейкемии человека K-562, позволяющие анализировать флуоресцентный сигнал HyPer с применением метода проточной цитофлуорометрии. В ходе выполнения проекта в 2023 г. были протестированы агенты, нарушающий митохондриальный редокс-метаболизм – ротенон (ингибитор дыхательной цепи митохондрий) и менадион (индуктор неспецифической митохондриальной поры). Оказалось, что нарушение редокс-гомеостаза в матриксе митохондрий не обязательно приводит к значительным окислительным возмущениям в цитоплазме и ядре клеток. Кратковременные инкубации с ротеноном вызывали увеличение уровня Н2О2 в митохондриальном матриксе и падение потенциала на внутренней митохондриальной мембране, однако приводили к очень слабому возмущению редокс-метаболизма в клеточной цитоплазме, которое становилось заметным только при ингибировании тиоредоксин-зависимой системы тиол-дисульфидного обмена. Напротив, воздействие менадиона на клетки приводило к резкому и синхронному росту уровня Н2О2 во всех протестированных клеточных компартментах, а также нарушению тиоредоксин-зависимой дисльфидредуктазной активности. Эти наблюдения хорошо согласуются с описанием менадиона как индуктора неспецифической митохондриальной поры. По-видимому, под действием этого агента, в результате индукции поры, происходит утечка в цитоплазму митохондриальных АФК, что приводит к резкому увеличению содержания Н2О2 в клеточном ядре и цитоплазме, а также нарушению работы систем тиол-дисульфидного обмена. Эксперименты с хелатором железа, дефероксамином, доказали, что именно менадион-индуцированное повышение уровня Н2О2 обуславливает гено- и цитотоксичность этого препарата при использовании в экспериментах его высоких, микромолярных концентраций. Обнаружено, что индуцированные менадионом гено- и цитотоксические концентрации Н2О2 в цитоплазме и ядре клеток К-562 исчисляются десятками нМ, в то время как повышение в пределах нескольких нМ не приводит к повреждающим эффектам.