КАРТОЧКА
ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ
Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.
ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ
Номер 21-74-20178
НазваниеРЕДОКС-ГОМЕОСТАЗ ВНУТРЕННИХ КОМПАРТМЕНТОВ КЛЕТКИ
РуководительЛюблинская Ольга Геннадьевна, Кандидат физико-математических наук
Организация финансирования, регион Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт цитологии Российской академии наук, г Санкт-Петербург
Период выполнения при поддержке РНФ | 2021 г. - 2024 г. |
Конкурс№51 - Конкурс 2021 года по мероприятию «Проведение исследований на базе существующей научной инфраструктуры мирового уровня» Президентской программы исследовательских проектов, реализуемых ведущими учеными, в том числе молодыми учеными.
Объект инфраструктуры Центр клеточных технологий ИНЦ РАН.
Область знания, основной код классификатора 04 - Биология и науки о жизни, 04-205 - Клеточная биология, цитология, гистология
Ключевые словагенетически кодируемые биосенсоры, HyPer, перекись водорода, редокс-гомеостаз, клеточные компартменты
Код ГРНТИ34.19.00
ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ
Аннотация
Окислительно-восстановительные реакции являются одним из наиболее распространенных типов химических реакций в живых клетках. Масштабная программа исследований внутриклеточных редокс-процессов, проведенная в прошлом, позволила разобраться в многообразии биологически значимых внутриклеточных окислителей и редокс-активных ферментативных систем, функционирующих в живой клетке. Значительная доля этих исследований была проведена в системе in vitro. Актуальная задача сегодняшнего дня, на решение которой и направлен настоящий проект – транслировать полученные знания в систему in vivo и выяснить, как это многообразие редокс-активных соединений сосуществует и взаимодействует друг с другом в живой клетке, как формируется редокс-ландшафт внутри отдельных органелл клетки, и в какой степени он является зависимым от редокс-гомеостаза соседних областей. Настоящий проект предполагает проведение комплексного исследования, призванного детализировать характеристики редокс-гомеостаза в цитоплазме, ядре и митохондриях живых клеток в условиях физиологической нормы, а также в условиях окислительного стресса, вызванного эндогенными или экзогенными факторами. Методической основой проекта является оригинальный подход, разработанный авторами, позволяющий с помощью генетически-кодируемого биосенсора перекиси водорода HyPer (Belousov et al., Nat Methods. 2006), слитого с сигналом локализации в разных клеточных органеллах, проводить количественные измерения ключевых параметров редокс-гомеостаза внутренних компартментов живых клеток: базальной и индуцированной стрессом молярной концентрации перекиси водорода, а также констант скоростей редокс-реакций, протекающих с участием пероксида. Проведение подобных экспериментов на фоне агентов, ингибирующих или стимулирующих различные редокс-активные ферментативные системы клетки, а также использование в экспериментах клеток с нокдауном генов-участников этих ферментативных путей, позволит определить номенклатуру ферментативных путей, контролирующих редокс-гомеостаз в клеточных компартментах. Проведенные исследования позволят впервые в мире определить, как изменяется базальная концентрация перекиси водорода в ядре, митохондриях и цитоплазме в условиях повседневного культивирования клеток, какие ферменты антиоксидантной защиты и тиол-дисульфидного обмена контролируют уровень внутриклеточной перекиси водорода в этих компартментах и какие ферменты вовлечены в процесс восстановления тиоловых групп редокс-активных белков. С использованием палитры siRNA планируется выяснить, насколько возмущения окислительно-восстановительного метаболизма, вызванные снижением уровня ключевых редокс-регуляторов и происходящие внутри одного компартмента клетки, влияют на редокс-гомеостаз соседних компартментов. Помимо этого, редокс-гомеостаз клеточных компартментов будет охарактеризован в условиях локального суб-цитотоксического и цитотоксического окислительного стресса, вызванного нарушением работы клеточных митохондрий. В качестве индукторов митохондриальной дисфункции будут использованы различные агенты, ингибирующие дыхательную цепь и/или индуцирующие состояние повышенной проницаемости митохондриальной мембраны. Планируется выяснить, как распределяется перекись водорода по клетке в условиях митохондриальной дисфункции и какое превышение уровня эндогенного пероксида над уровнем физиологической нормы приводит к фатальным последствиям – повреждению ДНК и гибели клеток. В итоге, в результате выполнения проекта будет составлена «редокс-карта» клетки, отражающая концентрацию перекиси водорода, скорость реакций тиол-дисульфидного обмена в разных компартментах, перечислены участники основных ферментативных путей, контролирующих редокс-гомеостаз этих компартментов в нормальных физиологических условиях, а также в условиях окислительного стресса, вызванного экзогенными или эндогенными факторами.
Ожидаемые результаты
Количественные оценки редокс-параметров клеток необходимы для понимания основных принципов окислительно-восстановительных взаимодействий, определяющих протекание редокс-зависимых метаболических и сигнальных процессов в живых клетках. До недавнего времени задача экспериментального численного определения редокс-параметров живых клеток была практически невыполнимой. Окислительно-восстановительные реакции, протекающие в клетках, изучались преимущественно in vitro. В 2019 году авторским коллективом проекта была разработана методика, позволяющая использовать генетически кодируемый биосенсор перекиси водорода HyPer (Belousov et al., Nat Methods. 2006) для количественной оценки внутриклеточной концентрации пероксида в живых клетках (Lyublinskaya and Antunes, Redox Biol. 2019). В рамках настоящего проекта предлагается расширить возможности предложенного метода и использовать HyPer не только как инструмент для измерения внутриклеточной концентрации перекиси на суб-клеточном уровне, но и как флуоресцентный репортер для проведения функциональных тестов, характеризующих активность разных ферментативных редокс-систем клетки. Запланированные в проекте исследования позволят количественно и качественно описать редокс-процессы, протекающие внутри отдельных компарментов клетки, выяснить, насколько они влияют на редокс-гомеостаз соседних компартментов и охарактеризовать их вклад в формирование внутриклеточного редокс-ландшафта. Практическая значимость и актуальность решения задач проекта обусловлена вовлеченностью нарушений редокс-метаболизма клеток в патогенез целого ряда заболеваний человека, а также в развитие процессов клеточного и организменного старения. Без понимания биохимических основ нормального редокс-метаболизма клеток и тканей организма человека невозможна разработка подходов для коррекции патологий, ассоциированных с нарушениями редокс-гомеостаза, и способов противодействия старению.
ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ
Аннотация результатов, полученных в 2021 году
Настоящий проект нацелен на определение количественных и качественных параметров редокс-гомеостаза в разных клеточных компартментах в условиях физиологической нормы, а также в условиях окислительного стресса, вызванного эндогенными или экзогенными факторами. Основная задача проекта – выяснить, какие ферментативные пути формируют редокс-ландшафт внутри отдельных органелл клетки и в какой степени он является зависимым от редокс-гомеостаза соседних областей. Методическая основа проекта – использование генетически кодируемого сенсора перекиси водорода HyPer (Belousov et al., Nat Methods. 2006), локализованного в разных клеточных компартментах. В качестве основной клеточной модели в проекте используются суспензионные клетки миелогенной лейкемии человека K-562, позволяющие анализировать флуоресцентный сигнал HyPer с применением метода проточной цитофлуорометрии. В текущем году в своих экспериментах мы использовали цитоплазматическую версию сенсора, и, соответственно, изучали особенности редокс-гомеостаза клеточной цитоплазмы. На первом этапе работы была отработана методика прижизненного цитометрического анализа клеток, позволяющая отслеживать в режиме реального времени процессы окисления/восстановления HyPer в клеточной цитоплазме при увеличении/снижении окислительной нагрузки на клетки. Полученные кинетические данные использовались для определения редокс-параметров клетки: разработаны протоколы анализа кинетики редокс-реакций HyPer с использованием уравнений химической кинетики, позволяющие оценивать цитоплазматический уровень перекиси водорода, индуцируемый внешним окислительным стрессом, а также константы скоростей реакций тиол-дисульфидного обмена в живых клетках. С использованием разработанных протоколов показано, что полноценный состав питательной среды важен для поддержания нормального редокс-метаболизма клетки, а обеднение питательными веществами, вызванное помещением клеток в фосфатно-солевой буферный раствор, способствует снижению активности тиол-дисульфидного обмена в клеточной цитоплазме. С использованием палитры ингибиторов обнаружено, что HyPer в цитоплазме клеток человека восстанавливается преимущественно с участием системы тиоредоксина. Показано, что в условиях внешнего окислительного стресса, при слабых окислительных нагрузках, эффективность системы антиоксидантной защиты клеток зависит от активности системы тиоредоксина, которая обеспечивает работоспособность пероксиредоксинов – ферментов, быстро элиминирующих избыточную перекись. В этих условиях, значение градиента между экстраклеточной и цитоплазматической концентрацией Н2О2 в клетках человека может исчисляться тысячами раз, но зависит от интенсивности окислительного воздействия. При увеличении окислительной нагрузки, приводящей к истощению системы тиоредоксина, градиент снижается до нескольких сотен раз и стабилизируется, поддерживаясь, по-видимому другими участниками системы антиоксидантной защиты (системой глутатиона и каталазой). Таким образом, результаты текущего года показывают, что HyPer может использоваться в клеточной биологии не только как сенсор перекиси водорода, но и как флуоресцентный репортер, характеризующий функциональную активность антиоксидантных и тиол-восстанавливающих систем в живых клетках.
Публикации
1. Зенин В.В., Иванова Ю.С., Пуговкина Н.А., Шатрова А.Н., Аксенов Н.Д., Тюряева И.И., Кунеев И.К., Журавлев А.Д., Осяева Е.Н., Люблинская Е.А., Газиова И.Ф., Гуриев Н.А., Люблинская О.Г. Resistance to H2O2-induced oxidative stress in human cells of different phenotypes Redox Biology, - (год публикации - 2022)
2. Люблинская О.Г., Корниенко Ю.С., Иванова Ю.С. , Пуговкина Н.А., Алексеенко Л.Л., Люблинская Е.А., Тюряева И.И., Смирнова И.С., Гринчук Т.М., Шорохова М.А., Красненко А.Ю., Плотников Н.А., Никольский Н.Н. Induction of Premature Cell Senescence Stimulated by High Doses of Antioxidants Is Mediated by Endoplasmic Reticulum Stress International Journal of Molecular Sciences, Т. 22. № 21:11851 (год публикации - 2021) https://doi.org/10.3390/ijms222111851
Аннотация результатов, полученных в 2022 году
Настоящий проект нацелен на определение количественных и качественных параметров редокс-гомеостаза в разных клеточных компартментах в условиях физиологической нормы, а также в условиях окислительного стресса, вызванного эндогенными или экзогенными факторами. Основная задача проекта – выяснить, какие ферментативные пути формируют редокс-ландшафт внутри отдельных органелл клетки и в какой степени он является зависимым от редокс-гомеостаза смежных областей. Методическая основа проекта – использование генетически кодируемого сенсора перекиси водорода HyPer (Belousov et al., Nat Methods. 2006), локализованного в разных клеточных компартментах. В качестве основной клеточной модели в проекте используются суспензионные клетки миелогенной лейкемии человека K562, позволяющие анализировать флуоресцентный сигнал HyPer с применением метода проточной цитофлуорометрии. В текущем году в своих экспериментах мы использовали митохондриальную и ядерную версию сенсора, и, соответственно, изучали особенности редокс-гомеостаза клеточного ядра и митохондрий. С использованием палитры ингибиторов систем тиол-дисульфидного обмена обнаружено, что HyPer в ядре и митохондриях клеток человека восстанавливается преимущественно с участием системы тиоредоксина. Показано, что в условиях внешнего окислительного стресса, при слабых окислительных нагрузках, эффективность системы антиоксидантной защиты клеточного ядра и митохондрий зависит от активности системы тиоредоксина, которая обеспечивает работоспособность пероксидредоксинов – ферментов, наиболее быстро элиминирующих избыточную перекись. При увеличении окислительной нагрузки, приводящей к истощению системы тиоредоксина, градиент снижается и стабилизируется, поддерживаясь, по-видимому другими участниками системы антиоксидантной защиты (системой глутатиона и каталазой). Помимо этого, результаты проведенных в этом году экспериментов были сопоставлены с данными, полученными в прошлом году в аналогичных опытах с клетками, экспрессирующими цитоплазматический вариант сенсора. Проведенный анализ показал, что в условиях внешнего Н2О2-индуцированного стресса наименьший уровень Н2О2 обнаружен в клеточной цитоплазме, а наибольший – в ядре клеток К562. Активность системы тиоредоксина оказалась наибольшей в цитоплазме и наименьшей в митохондриях – как в отсутствие окислительной нагрузки, так в условиях окислительного стресса. В целом, полученные результаты позволяют сделать вывод о том, что цитоплазматическая система антиоксидантной защиты эффективнее справляется с избыточной перекисью водорода, чем ядерные и митохондриальные системы клеток К562.
Публикации
1. Кожухарова И.В., Минкевич Н.В., Алексеенко Л.Л., Домнина А.П., Люблинская О.Г. Paracrine and Autocrine Effects of VEGF Are Enhanced in Human eMSC Spheroids International journal of molecular sciences, Int. J. Mol. Sci. v.23 №22 p.14324 (год публикации - 2022) https://doi.org/10.3390/ijms232214324
2. - В Институте цитологии РАН придумали метод, позволяющий оценить способность клетки противостоять окислительному стрессу Пресс-релиз на сайте РАН, сайт Российской Академии Наук, раздел "Новости", 03.03.2022 (год публикации - )
Аннотация результатов, полученных в 2023 году
Настоящий проект нацелен на определение количественных и качественных параметров редокс-гомеостаза в разных клеточных компартментах в условиях физиологической нормы, а также в условиях окислительного стресса, вызванного эндогенными или экзогенными факторами. Основная задача проекта – выяснить, какие ферментативные пути формируют редокс-ландшафт внутри отдельных органелл клетки и в какой степени он является зависимым от редокс-гомеостаза смежных областей. Методическая основа проекта – использование генетически кодируемого сенсора перекиси водорода HyPer (Belousov et al., Nat Methods. 2006), локализованного в разных клеточных компартментах. В качестве основной клеточной модели в проекте используются суспензионные клетки миелогенной лейкемии человека K-562, позволяющие анализировать флуоресцентный сигнал HyPer с применением метода проточной цитофлуорометрии. В ходе выполнения проекта в 2023 г. были протестированы агенты, нарушающий митохондриальный редокс-метаболизм – ротенон (ингибитор дыхательной цепи митохондрий) и менадион (индуктор неспецифической митохондриальной поры). Оказалось, что нарушение редокс-гомеостаза в матриксе митохондрий не обязательно приводит к значительным окислительным возмущениям в цитоплазме и ядре клеток. Кратковременные инкубации с ротеноном вызывали увеличение уровня Н2О2 в митохондриальном матриксе и падение потенциала на внутренней митохондриальной мембране, однако приводили к очень слабому возмущению редокс-метаболизма в клеточной цитоплазме, которое становилось заметным только при ингибировании тиоредоксин-зависимой системы тиол-дисульфидного обмена. Напротив, воздействие менадиона на клетки приводило к резкому и синхронному росту уровня Н2О2 во всех протестированных клеточных компартментах, а также нарушению тиоредоксин-зависимой дисльфидредуктазной активности. Эти наблюдения хорошо согласуются с описанием менадиона как индуктора неспецифической митохондриальной поры. По-видимому, под действием этого агента, в результате индукции поры, происходит утечка в цитоплазму митохондриальных АФК, что приводит к резкому увеличению содержания Н2О2 в клеточном ядре и цитоплазме, а также нарушению работы систем тиол-дисульфидного обмена. Эксперименты с хелатором железа, дефероксамином, доказали, что именно менадион-индуцированное повышение уровня Н2О2 обуславливает гено- и цитотоксичность этого препарата при использовании в экспериментах его высоких, микромолярных концентраций. Обнаружено, что индуцированные менадионом гено- и цитотоксические концентрации Н2О2 в цитоплазме и ядре клеток К-562 исчисляются десятками нМ, в то время как повышение в пределах нескольких нМ не приводит к повреждающим эффектам.
Публикации
1. Люблинская О.Г. Генетически кодируемый биосенсор HyPer как инструмент для количественного определения внутриклеточного уровня перекиси водорода Цитология, - (год публикации - 2024)
2. Тюряева И.И., Люблинская О.Г. Expected and unexpected effects of pharmacological antioxidants International Journal of Molecular Sciences, Int J Mol Sci. 2023 Jun; 24(11): 9303. (год публикации - 2023) https://doi.org/10.3390/ijms24119303