Аннотация результатов, полученных в 2021 году
1. Проведены эксперименты in vitro и in vivo по подтверждению активности регулируемых CART клеток на основе высокоспецифического блока «барназа-барстар». 2. Был произведен поиск новых низкомолекулярных соединений аффинных к рецепторам раковых клеток CD19, HER2, PSMA. В рамках выполнения проекта, совместно с компанией WuXi Apptech, был проведен отбор соединений специфически связывающихся с CD19, PSMA и HER2 из ДНК-кодированных библиотек химических соединений. По результатам проведенной работы была подготовлена статья. 3. Был изучен терапевтический потенциал отобранных соединений для уничтожения раковых клеток с помощью регулируемых CAR T клеток на основе каталитического антитела. Отобранные соединения позволяют дозозависимо контролировать лизис клеток рака простаты и рака молочной железы, а также выброс провоспалительных цитокинов IL-2 и IFN CAR T клетками. 4. В результате многоцентрового международного сотрудничества между ИБХ РАН (Москва, Россия), Республиканского научно-практического центра детской онкологии, гематологии и иммунологии (Минск, р. Беларусь), Витебского областного клинического онкологического диспансера (Витебск, р. Беларусь), ИБОХ НАН (Минск, р. Беларусь), биотехнологической компании Xenetic Biosciences (Фремингхем, США) и исследовательского института Скриппса (Сан-Диего, США) были начаты доклинические испытания персонифицированных CART клеток. В рамках исследования после информированного согласия был произведен забор биопсионного материала опухоли 15 пациентов. В одиннадцати образцах удалось идентифицировать нуклеотидные последовательности В клеточных рецепторов опухолевых клонов пациентов. 5. Совместно с НМИЦ ДГОИ им. Дмитрия Рогачева и Онкологического центра Сейдмана (Кливленд, США), которые выступали в роли двух независимых клинических центров, в была показана высокая воспроизводимость и эффективность мобильная система CliniMACS Prodigy для получения CAR19 T клеток. Вклад участников проекта позволил внести вклад в создание животных моделей, выполнение экспериментов in vivo, а также проведение анализа транскриптома CAR T клеток. По результатам работы была опубликована статья в журнале Nature Communications (IF=14.919). 6. Были созданы два принципиально новых подхода для получения CAR T клеток на основе микросфер, несущих опухолевый антиген CAR, из обычных клеточных линий. Данные искусственные антигенные везикулы могут быть использованы для стимуляции и размножения CAR-T-клеток. Протокол с использованием искусственных антигенных везикул вызывают более сильную стимуляцию, пролиферацию и функциональную активность CAR-T-клеток, чем это возможно с существующими протоколами. Использование искусственных антигенных везикул, меченных флуоресцентным белком, позволяет создавать CAR любого дизайна, так как распознавание CAR T клетки происходит за счет взаимодействия с целевым антигеном и не зависит от структуры химерного рецептора. По результатам работы была опубликована статья в журнале Small (IF=13.281). 7. В ходе выполнения проекта была проведена фенотипическая характеризация зрелости регуляторных В-клеток человека, продуцирующих ИЛ-10, путем анализа уровня экспрессии дополнительных поверхностных маркеров CD24, CD38, CD27 и CD138. Было показано, что количество ИЛ-10 продуцирующих клеток (Breg) составляет в среднем 1.7% от общего пула стимулированных В-клеток. Так же было обнаружено, что количество регуляторных В-клеток резко возрастает в суб-популяции транзиентных В-клеток (CD19(+)CD24(hi)CD38(hi)) в среднем до 5.5%. При этом суб-популяция ИЛ-10 продуцирующих клеток в среднем содержит 8.1% транзиентных В-клеток, а суб-популяция IL10-negative содержит только 2.4% транзиентных В-клеток. Таким образом, было подтверждено, что суб-популяция транзиентных В-клеток обогащена клетками с регуляторными функциями за счет продукции ИЛ-10. 8. В ходе выполнения проекта на основании обнаруженного снижения количества соматических мутаций в вариабельном фрагменте тяжелой цепи иммуноглобулинов в суб-популяции транзиентных В-клеток у пациентов с РС по сравнению со здоровыми донорами была выдвинута гипотеза о нарушении процесса созревания В-клеточного звена при развитии аутоиммунных заболеваний. 9. В ходе выполнения проекта была налажена и оптимизирована микрофлюидная платформа, позволяющая анализировать и отбирать нативно «запаренные» вариабельные фрагменты тяжелых и лѐгких цепей иммуноглобулинов человека (VH-VL), участвующих в развитии заболевания или подавляющих его. На основании полученных ампликонов, кодирующий правильное сочетание VH-VL, возможно создание функциональных фаг-дисплейных, дрожжевых и лентивирусных библиотек антител человека. В результате широкомасштабного анализа В-клеточного репертуара пациентов, переболевших COVID-19, и иммунизированных доноров был получен ряд антител, нейтрализующих проникновение вируса SARS-CoV2.¬ Были измерены их константы связывания с RBD и/или S-белком, определены эпитопы связывания. В результате была получена панель моноклональных антител человека, способных нейтрализовать проникновение вируса SARS-CoV2 разных штаммов в концентрациях¬ менее 1 мкг/мл. Для одного из нейтрализующих антител был проведен структурный анализ и подтвержден его терапевтический потенциал на модели rhesus macaque SARS-CoV2. 10. Была получена библиотека лентивирусных генетических конструкций, кодирующих открытые рамки считывания вируса SARS-CoV-2 (NSP1-16, E, M, N, S, ORF3a, ORF3b, ORF6, ORF7a, ORF7b, ORF8, ORF9b, ORF9c, ORF10) слитные с Strep-tag II. За исключением NSP1, NSP6, NSP11, ORF3b, ORF7b, ORF9c и ORF10, в результате иммуноблотинга наблюдались полосы, соответствующие предсказанным размерам белков (24 из 31 белка). Было обнаружено, что ингибитор лизосомы не оказывает существенного влияния на внутриклеточное количество белков SARS-CoV-2, в то же время ORF6, NSP7, NSP12 в значительной степени накапливаются в присутствие ингибиторов MG-132 и TAK-243, что говорит о том, что данный вирусные белки подвергаются убиквитин-зависимой деградации протеасомой. В случае NSP3, который проявляет деубиквитиназную активность, а также способен снимать с белковых субстратов модификацию ISG15, при добавлении ингибитора системы убиквитинирования TAK-243 происходит драматическое уменьшение количества данного белка. 11. Было обнаружено около 300 белков-партнеров вирусных белков SARS-CoV-2. Было установлено, что ORF3a взаимодействует с E3-лигазой TRIM59, NSP9 – с E3-лигазой MIB1, ORF10 – c белком ZYG11B E3-лигазного комплекса cullin-2 (CUL2). Один из самый интересных партнером ORF6 является белок NMI (N-Myc And STAT Interactor). NMI в комплексе с IFI35 ингибирует индуцированную вирусом продукцию IFNb типа I, при этом он проявляет подобную активность только будучи убиквитинированным E3-лигазой TRIM21. Для NSP7 и NSP12 не удалось обнаружить белков-партнеров. 12. В результате анализа 155 пациентов Московской области, обследованных в Центральной клинической больнице РАН во время первой волны пандемии, было обнаружено, что уровень иммуноглобулина A является самым ранним серологическим критерием развития инфекции SARS-CoV-2. Мы продемонстрировали, что скорость сероконверсии «ранних» N-белок-специфических антител IgM и IgA сравнима с таковой у антител, специфичных к конформационным эпитопам RBD. В то же время сероконверсия иммуноглобулинов класса G, специфичных к N-белку SARS-CoV-2, протекала значительно быстрее, чем у других специфических антител. Анализ распределения подклассов иммуноглобулинов в сыворотках серопозитивных пациентов выявил равномерную индукцию N-белок-специфических IgG подклассов G1 – G4 и IgA подклассов A1 – A2 в группах пациентов с разной степенью тяжести COVID-19. В случае S-белка G1, G3 и A1 были основными подклассами антител, участвующих в иммунном ответе. 13. В результате комплексного анализа сыворотки крови и грудного молока на основе ИФА у беременных, переболевших COVID-19 в разных триместрах беременности, было обнаружено, что пациенты преимущественно содержали иммуноглобулины, специфичные к N-белку SARS-CoV-2, и антитела ко всем тестируемым антигенам в зависимости от белка и времени. Женщины, выздоровевшие от COVID-19 в I – II триместрах, показали заметное уменьшение количества образцов молока с sIgA, специфичным к N-белку, линейным эпитопам NTD и RBD-SD1, а также увеличение количества образцов с sIgA, зависимым от конформации структуры RBD. Было обнаружено, что только S-антигены вызывают ответ sIgA1, тогда как подклассы sIgA1 и sIgA2 к N-белку участвуют в 100% и 33% случаев. 14. Анализ тепловых карт взаимодействия пептида с TCR показал, что в случае с комплексами, ассоциированными с сигналингом, образуются взаимодействия бета-цепи TCR с пептидом в области аминокислотных остатков 50-58, чего не наблюдается в моделировании неактивных систем. Анализ тепловых карт взаимодействия pMHC-TCR показал, что существуют контакты, которые практически не образуются в системе 1 (обеспечивающей сигналинг), но образуются в системах 3 и 4, и наоборот. Две области pMHC, одна из которых участвует во взаимодействии с TCR в системе 1, а вторая — в системах 3 и 4, являются участками альфа-спиралей α1 и α2 pMHC, лежащими по разные стороны от связанного пептида. Наши наблюдения показывают, что в то время как в системах без сигнала 3 и 4 нет предпочтительной спирали, в системах с сигналом 1 и 2 есть явное предпочтение взаимодействий TCR со спиралью 137-180 (α2). 15. На данном этапе работы был получен TCR D3 с выходом около 4,3 мг с литра буфера рефолдинга и чистотой не менее 98% в системе E. Coli, а также TCR D3, HLA-A2 и HLA-B57 с выходом около 0,5 мг с литра среды и чистотой не менее 98% в клетках насекомых S2 Drosophila melanogaster. 16. Для каждой аллели было увеличено количество полученных в рекомбинантной форме лигандов – 6 для DRB1*0101 и 9 для DRB1*1501 - для которых было оценено относительное связывание с конкретной аллелью MHCII in vitro. Пептиды Melanoma, Estrogen и Acidic имеют высокое сродство к DR1, тогда как пептиды Calmodulin и Tyrosin обладают низкой аффинностью, а пептид Peroxisome не связывается вообще. Также важно отметить, что пептид Acidic связывается с высокой скоростью, как и вирусный пептид HA, тогда как при высокой аффиности пептиды Melanoma и Estrogen связываются с низкой скоростью. Похожая ситуация и для DR15: высокое сродство у пептидов EGR1, Multidrug, Ninein, Apoliprotein, Envoplakin и Cyclin, среднее у Estrogen, и практически не связываются Dipeptidyl и Insulin. При высоком сродстве пептиды EGR1, Multidrug, Ninein, Apoliprotein и Estrogen связывается с высокой скоростью, а пептиды Envoplakin и Cyclin связываются с низкой скоростью. 17. Для отборов лигандов на аллели MHC II DRB1*0101 и DRB1*1501, проведенных на предыдущем этапе работы, был осуществлен дополнительный биоинформатический скрининг с помощью ресурса NetMHCIIPan, результаты которого коррелировали с данными экспериментального отбора. Дополнительно была определена теоретическая аффинность отобранных лигандов и уточнен их эпитоп связывания с MHC II. 18. В соответствии с подобранными в прошлом году условиями были проведены отборы пептидов для двух аллелей MHCII DR4 (HLA-DRB1*0401) и DR8 (HLA-DRB1*0801) c использованием аутоиммунной фаговой библиотеки 44-членных пептидов на базе вектора FADL, созданной на предыдущих этапах проекта. Были проведены два раунда отбора для каждой аллели из аутоиммунной библиотеки. Параллельно проводили раунды отрицательно контрольного отбора, где в смеси не содержался рекомбинантный белок DR. 19. Было проведено широкомасштабное секвенирование около 100000 клонов с определением первичной структуры отобранных фрагментов аутоантигенов для каждого раунда отбора как для DRB1*0401, так и для DRB1*0801, а также для контрольного отбора. В результате анализа секвенирования с использованием нескольких критериев были определены потенциальные антигенные пептиды для DR4 и DR8. Для каждого HLA-DR были выбраны по 3-5 перспективных аутоантигенных пептида для дальнейшего анализа.

Аннотация результатов, полученных в 2022 году
1. Проведены эксперименты in vivo подтверждающие активность регулируемых BsCAR-T клеток на основе высокоспецифичного взаимодействия барназы с барстаром. Подтвердили универсальность данной модульной системы для EpCAM опухолевых клеток in vitro. 2. Были получены В-клеточные рецепторы опухолевых клонов пациентов в формате полноразмерных антител. С этими антителами были проведены отборы VHH с помощью фагового дисплея. 3. Были охарактеризованы клоны в ИФА, определена нуклеотидная последовательность VHH в клонах, получены кривые ингибирования в конкурентном ИФА и получены KD с помощью системы BlitZ ForteBio. 4. Была создана панель уникальных конструкций CAR, каждая из которых содержит специфичное для B-клеточного рецептора опухолевых клеток VHH. 5. Экспериментально была выбрана конструкция CAR третьего поколения – VHH-CD8-CD28-BBz для дальнейших экспериментов. Конструкция с природной цепью mu IgM с доменами VH и VL B-клеточного рецептора из опухолевых клеток пациента экспериментально была выбрана для создания клеток-мишеней. 6. Была проведена терапия 5 пациентов с острым лимфобластным лейкозом CD45RA-деплецированными Т-клетками (CAR19-Tm) и в сравнении со стандартными CAR19-T и впервые на людях была показана их ограниченная персистенция, связанная с хронической активацией и истощением Т-клеток. 7. На различных видах рака была показана высокая эффективность терапии онколитическими вирусами OV-OX40L/IL12 в комбинации с опухоль инфильтрирующими Т клетками. 8. В ходе выполнения проекта была получена панель из 13 моноклональных RBD-специфичных полноразмерных антител человека, обладающих нейтрализующей активностью SARS-CoV2 с IN50 в диапазоне 0.1 – 40 nM. Данные антитела были получены с использованием разработанной в ходе выполнения проекта системы идентификации антиген-специфичных В-клеток, основанной на сочетании проточной цитофлуорометрии и фагового дисплея. Для решения этой задачи была создана фаговая мини-библиотека пептидов S-белка SARS-CoV2, содержащих потенциальные эпитопы нейтрализующих антител длиной от 45 до 200 а.о.. Дополнительно была создана фаг-дисплейная библиотека S-белка SARS-CoV2 штамма омикрон. Было показано, что с использованием мини-библиотеки пептидов RBD, экспонированных на поверхности бактериофага, получается идентифицировать сопоставимый репертуар антител, что и при обогащении на полноразмерную молекулу RBD. При этом в случае новой масштабной эпидемии получение нейтрализующих антител на пептидные фрагменты всех белков анализируемого вируса можно произвести намного быстрее, чем идентификация точного эпитопа и белка, на который образуется большинство вируснейтрализующих антител. Было показано, что комбинированный перебор различных сочетаний вариабельных фрагментов тяжелых и легких цепей антиген-специфичных В-клеток не способствует получению более аффинных антиген-специфичных антител. Правильное сочетание тяжелых и легких цепей иммуноглобулинов, встречаемое в природе, обеспечивает наиболее высокую аффинность и нейтрализующую активность антител в наблюдаемых экспериментах. 9. При сравнении репертуара моноклональных RBD-специфичных антител, развивающихся после инфекции COVID-19 или после вакцинации Sputnik-V, была подтверждена высокая протективность вакцины Sputnik и доказано наличие высокоаффинных и высоконейтрализцющих антител в сыворотке вакцинированных на моноклональном уровне. 10. В ходе выполнения проекта для анализа вклада транзиентных регуляторных В-клеток в развитие рассеянного склероза была увеличена выборка анализируемых пациентов с РС и здоровых доноров. В результате было показано повышенное содержание транзиентных регуляторных В-клеток в периферической крови при развитии злокачественного течения РС. Было показано, что субпопуляция CD19+CD24highCD38high у больных РС характеризуется менее зрелым фенотипическим портретом. Было обнаружено, что содержание клеток CD27+ в субпопуляции CD19+CD24highCD38high tBregs у больных РС достоверно снижено (1,0±0,5 %) по сравнению со здоровыми донорами (2,2±1,4 %). Также было показано, что CD19+CD24highCD38high В-клетки характеризуются повышенной продукцией ИЛ-10 у больных РС и здоровых доноров. В субпопуляциях В-клеток, продуцирующих ИЛ-10, между РС и здоровыми донорами не было статистически значимых различий. 11. Проведен анализ физиологической значимости обнаруженных ферментативных каскадов на клетках млекопитающих путем комбинаторной коэкспресии обнаруженных троек антиген-E3-SARS-CoV-2 PLpro на клетках линий HEK293T и А549 Наши данные свидетельствуют о том, что указанные вирусные белки эффективно убиквитинируются соответствующими E3-лигазами, а оверэкспрессия Papain-like proteinase (PLpro) защищает антигены SARS-CoV-2 от гидролиза в протеасоме (за исключением S-WWP1). Подтверждено, что PLpro in vitro избирательно разрушает К48 полиубиквитиновые цепочки, присоединенные к антигенам. Таким образом, нами была подтверждена реверсивная активность вирусной Papain-like proteinase в терминах деубиквитинирования. 12. В ходе работы был предложен метод для предсказания того, является ли тот или иной третичный комплекс pMHCI-TCR сигнялящим. Метод был валидирован суммарно на 9 системах и показал потенциальную применимость. Кроме того, корректность использования исходной метрики и ее физический смысл были подтверждены дополнительными расчетами альтернативным методом молекулярного моделирования. 13. В результате экспрессии клеточных линий культуры S2 Drosophila melanogaster были получены и далее очищены белковые препараты мутантов HLA-A2 H114Q, HLA-B57 V97R и HLA-B57 L156R, а также TCR AAA83 и TCR AAA83F/J. Выход составил около 0,5 мг с литра среды, а чистота не менее 80%. Полученные белки были ферментативно биотинилированы. 14. Проведён анализ взаимодействия вирусных ВИЧ-антигенов с HLA-A2 и HLA-B57 и их мутантами (HLA-A2 H114Q, HLA-B57 V97R, HLA-B57 L156R) методом функционального ИФА, по результатам которого было выяснено, что HLA-A2 в комплексе с пептидом ВИЧ SL9 связывается с TCR D3 лучше, чем в комплексе с пептидом гриппа GL9. Мутантная форма HLA-A2 H114Q, которая по литературным данным является контролером ВИЧ-инфекции, имеет большее сродство к пептиду SL9, чем дикий тип. HLA-B57 и его мутанты показали неспецифическое связывание. 15. Белковые продукты аллелей MHC II HLA-DR1 (DRB1*0101), HLA-DR15 (DRB1*1501), HLA-DR4 (DRB1*0401), HLA-DR8 (DRB1*0801), HLA-DR3 (DRB1*0301) были наработаны в суспензионных клетках HEK293F. 16. Для каждой аллели HLA-DR4 (DRB1*0401) и HLA-DR8 (DRB1*0801) были получены пептиды-лиганды в рекомбинантной форме, для которых было оценено относительное связывание с конкретной аллелью MHCII in vitro. Для аллели DR4 пептиды P761 и P998 имеют высокое сродство к DR4, остальные исследуемые пептиды характеризуются также положительным, отличным от контроля сигналом связывания с DR4, кроме P1920 и P7030. Также важно отметить, что пептиды P761 и P998 связываются с высокой скоростью с MHC II, как и вирусный пептид HA, тогда как при довольно высокой аффиности пептиды P11100 и P10478 связываются с низкой скоростью. 17. Пептиды, не отобравшиеся в процессе фагового дисплея на аллели HLA-DR1, HLA-DR15, HLA-DR4, HLA-DR8, но обладающие высоким теоретическим сродством к данным аллелям, определенным с помощью виртуального скрининга библиотеки, были также получены в рекомбинантной форме в виде аналогичных белков, слитных с бактериальным тиоредоксином (по 4 для каждой аллели). В результате экспериментов по определению их взаимодействия с молекулами HLA было показано, что они по большей части эффективно связываются с белковыми продуктами советующих аллелей.

Аннотация результатов, полученных в 2023 году
1. Был разработан протокол получения натуральных экзосом из лимфомных клеток и подтверждено наличие в мембране везикул CD19. В ходе in vitro экспериментов было показано, что CD19-позитивные экзосомы снижают цитотоксическую активность CAR19 T-клеток и способствуют их истощению. 2. Была получена панель гидовых РНК для нокаута Т-клеток по генам CD45, CD3ε и ТКР. После нокаута с помощью системы CRISPR-Cas в ходе in vitro экспериментов было показано, что нокаут CD45 не влияет на цитотоксическую активность Т-клеток, но снижает выброс провоспалительных цитокинов, а нокаут CD3ε и ТКР полностью нарушают активацию Т-клеток посредством ТКР и снижают их аллореактивность. 3. В ходе in vitro и in vivo экспериментов было продемонстрировано, что отсутствие на Т и CAR T-клетках ведет к снижению провоспалительной активности, но не влияет на их способность к лизису опухолевых клеток. На основании полученных данных был разработан протокол создания CD45 специфичных CAR45 T клеток и подтверждена их способность к элиминации CD45-позитивных как опухолевых, так и гемопоэтических клеток человека in vivo. Получен ряд животных моделей онкогематологических заболеваний и РТПХ. 4. Была разработан протокол невирусной доставки генов химерных антигенных рецепторов в Т лимфоциты на основе транспозазы Sleeping Beaty. В экспериментах in vitro была подтверждена функциональная активность CAR19 и BCR-специфичных CAR-FL Т клеток. 5. В экспериментах на мышах линии NSG с подкожно привитыми опухолевыми клетками Ramos-FL/ffluc была показана высокая эффективность BCR-специфичных CAR Т клеток, сопоставимая с классическими CAR19. 6. В ходе выполнения проекта из лентивирусных библиотек иммуноглобулинов, сконструированных на основе В-клеток крови переболевших COVID-19 и вакцинированных Sputnik-V доноров, было получено 25 моноклональных полноразмерных антител человека IgG1 путем обогащения на фаговую библиотеку фрагментов RBD. Из полученных антител 7 клонов обладали способностью одновременно нейтрализовать дикий штамм SARS-CoV-2 Wuhan, а также его более позднюю версию Delta. Два клона одновременно нейтрализовали Wuhan и omicron. И одно антитело, полученное из донора, вакцинированного Sputnik-V, обладало способностью нейтрализовать все 3 протестированных штамма SARS-CoV-2: Wuhan (IC50 = 0,6 nM), Delta (IC50 = 100 nM), Omicron (IC50 = 3,4 nM). Таким образом, было получено моноклональное антитело, являющееся потенциальными терапевтическим агентом. Более того, факт обнаружения данного антитела у донора, вакцинированного Sputnik-V, указывает на возможность образования противовирусных протективных антител при проведении вакцинации Sputnik-V. 7. У пациентов с РС было показано наличие моноклональных кросс-реактивных антител, взаимодействующих одновременно с РС-ассоциированным фрагментом белка EBNA1 вируса Эпштейн-Барр и LMP1. 8. Наши данные показывают, что исходные варианты RBD и особенно штаммы, родственные Delta, в отличии от Omicron, характеризуются аномальным обратным соотношением генерируемых эпитопов HLA I класса конститутивными протеасомами и иммунопротеасомами. Анализ накопления мутаций четко показывает, что эволюция SARS-CoV-2 направлена на уменьшение способности связывания гаплотипов HLA I класса с пептидами RBD, генерируемыми протеасомами. Среди текущих вариантов SARS-CoV-2, представляющих интерес и находящихся под наблюдением (variants of interest and under monitoring), пептиды Omicron BA.2.86, также известный как недавно появившийся штамм SARS-CoV2 «Pirola», обладают самым низким потенциалом связывания c HLA I класса, что предполагает значительную потерю основных и второстепенных антигенных детерминант RBD у этих штаммов, но, вероятно, более сфокусированный Т-клеточный ответ. 9. В настоящем исследовании у пациентов с системной красной волчанкой (СКВ) без антифосфолипидного синдрома (АФС) были обнаружены значительно более высокие уровни комплекса миелопероксидазы-дезоксирибонуклеиновой кислоты (МПО-ДНК) по сравнению с больными СКВ с АФС, с первичным антифосфолипидным синдромом (ПАФС) и здоровыми людьми. У пациентов с СКВ и положительным уровнем комплекса МПО-ДНК достоверно чаще наблюдались высокая активность СКВ, волчаночный гломерулонефрит и гипокомплементемия. Достоверной связи между положительным уровнем комплекса МПО-ДНК и клинико-лабораторными проявлениями АФС не выявлено. Концентрация нуклеосом была достоверно ниже в группе больных СКВ (±АФС) по сравнению с контролем и ПАФС. У больных СКВ частота низкого уровня нуклеосом ассоциировалась с высокой активностью СКВ, волчаночного нефрита и артрита. Повышенный уровень комплекса МПО-ДНК можно рассматривать как перспективный биомаркер волчаночного нефрита, активности заболевания и иммунологических нарушений у больных СКВ. 10. Анализ термического сдвига белковых комплексов HLA-A*02:01 совместно с пептидами SL9/GL9 и HLA-B*57:03, HLA-B*57:03 V97R, HLA-B*57:03 L156R с пептидами KF11/IW9 показал стабилизацию комплексов HLA-A*02:01 с пептидами SL9/GL9 и HLA-B*57:03 V97R c KF11, а также наблюдалось дестабилизация комплекса HLA-B*57:03 L156R с пептидом KF11. 11. Были оценены константы диссоциации комплексов рМНС и TCR D3 и AАА83 методом поверхностного плазмонного резонанса. По полученным данным можно сказать, что наибольшее сродство к TCR A83 имеют комплексы B57-KF11, B57 V97R-KF11 и B57 V97R-IW9, к TCR D3 - HLA-A2-SL9. 12. Были получены генетические конструкции в векторе pLV2, кодирующие полноразмерные HLA-A2 и HLA-B57, а также TCR D3 и ААА83. Данными плазмидами и упаковочными плазмидами были трансфецированы клетки HEK293T и наработаны вирусы для дальнейшей трансдукции. 13. Методом тандемной масс-спектрометрии был исследован иммунопептидом MHC II АПК из периферической крови больных системной красной волчанкой и ревматоидным артритом, а также здоровых доноров - носителей аллелей MHCII DRB1*1501 и DRB1*0101, DRB1*0401, описанных как аллели, ассоциированные с данными заболеваниями, соответственно. Было проведено сравнение пептидов из аутоантигенной библиотеки, полученных на предыдущих этапах работы фаговым дисплеем на связывание с данными аллелями MHCII, и природных аутоантигенных пептидов, презентируемых на АПК из периферической крови больных РА и СКВ, по данным масс спектрометрии. Пептиды, прошедшие оба варианта отбора и показавшие приемлемое связывание с данной аллелью MHC II по расчётам виртуальной нейросети NetMHCIIPan, были использованы для дальнейших экспериментов с оценкой Т-клеточного ответа у больных РА. 14. Была создана модельная система для оценки Т-клеточного ответа на отобранные пептиды в составе комплекса с MHCII. Для этого было получено 2 модельных линии Т клеток на базе линии Jurcat J76 TRP с белком GFP под индуцибельным промотором, несущие рецептор CD4 и специфические ТКР к комплексу белкового продукта DRB1*01:01 с фрагментом геммаглютинина из вируса гриппа HA306-318 и к DRB15*01:01 с фрагментом основного белка миелина MBP85-99. Также были созданы модельные линии АПК на базе опухолевой линии человека HeLa с встроенными белком CD80 и комплексами человеческих MHCII DRB1_0101 со слитным пептидом HA306-318 и DRB15_0101 со слитным пептидом MBP85-99. Активация модельных Т-клеточных линий, детектируемая по увеличению уровня экспрессии GFP, наблюдалась только в случае инкубации с подходящей линией АПК, несущей комплементарную данному ТКР пару MHCII-пептид. 15. Был измерен Т-клеточный ответ на пул пептидов, выбранных на предыдущих этапах работы, у группы больных РА и здоровых доноров – носителей исследуемых ассоциированных с РА аллелей MHCII DRB1*0101 и DRB1*0401. Статистически значимый Т клеточный ответ, измеренный по продукции IFN- γ и IL-2, у больных РА в отличие от здоровых доноров был получен на фрагмент аннексина 11, презентируемый на белковом продукте аллели DRB1*0101.