Аннотация результатов, полученных в 2021 году
1. Проанализирован жирнокислотный (ЖК) состав 135 штаммов эукариотических микроводорослей, принадлежащих к семи разным семействам, и 15 штаммов цианобактерий на предмет наличия ЖК с длинной цепью (от 20 атомов углерода и более). Среди исследованных штаммов выделены штамм Vischeria sp., продуцирующий до 27% ЭПК от суммы всех ЖК и штаммы Lobosphaera sp., подуцирующие АРК до 16%. Для некоторых штаммов оценен ЖК состав ТАГ, выявлены закономерности изменений липидного состава клеток в условияз азотного голодания. 2. Разработан и введен в эксплуатацию фотобиореактор (ФБР) нового типа, пригодный для прямого масштабирования. Биолого-технические испытания разработанного ФБР, проведенные на культуре Chlorella sorokiniana IPPAS C-1, показали, что заложенные технические решения и конструкция реактора обеспечивают эффективное использование светового потока от искусственных источников света, высокую степень утилизации СО2, барботируемой в составе ГВС в суспензию, а также обеспечивают надежное поддержание заданных параметров культивирования и возможность варьировать их в широких пределах. Разработанный ФБР может использоваться для производства ценных и особо ценных продуктов биосинтеза, в качестве инокуляторов при крупнотоннажном производстве биомассы микроводорослей, а также для отработки технологии производства различных штаммов микроводорослей и отработки режимов, реализующих направленный синтез ценных метаболитов. Конструкция разработанного ФБР допускает его масштабирование до 50-150 литров суспензии на 1 модуль. 3. Начаты работы по оптимизации режимов культивирования микроводорослей для обеспечения максимального выхода триацилглицеридов, обогащенных длинными ПНЖК. 4. Отработаны лабораторные режимы культивирования цианобактерии Limnospira platensis для получения биомассы, содержащей координированные атомы йода, селена, цинка. 5. Определен оптимальный субстрат для выращивания растений амаранта в условиях фитотрона. Показано, что урожайность растений A. caudatus, выращенных при температуре 30ºС, оказалась почти на 40% выше, чем урожайность при 20ºС. Растения амаранта, выращенные при 30ºС превосходили растения А. caudatus, выращенные при 20ºС по содержанию крахмала в 6 раз, белка – в 1,5 раза, сахаров – на 20%, α-линоленовой кислоты (18:3) – на 1,4%, антиоксидантной активности листьев – на 4%. Растения амаранта при повышенной температуре выращивания (30ºС) оказались способны не только увеличивать свою продуктивность, но и повышать пищевую ценность листовой биомассы по сравнению с температурой выращивания 20ºС. Такая особенность делает растения А. caudatus перспективной сельскохозяйственной культурой для выращивания в условиях глобального потепления и аридизации климата

Аннотация результатов, полученных в 2022 году
1.5.1. Исследована специфичность образования двойной связи Δ6-десатуразой жирных кислот. Десатуразы жирных кислот (ДЖК) играют важную роль в различных метаболических и адаптивных путях во всех живых организмах. Они представляют собой надсемейство оксигеназ, которые вводят двойные связи в ацильные цепи жирных кислот (ЖК). Эти ферменты высоко специфичны к длине углеродной цепи, положению образования двойных связей и т. д. Способы, с помощью которых ДЖК «отсчитывают» положение образования двойных связей, могут различаться. Первая двойная связь обычно образуется между 9 и 10-м атомами углерода (положение Δ9), считая от карбоксильного конца ЖК. Другие ДЖК, участвующие в синтезе полиненасыщенных ЖК, могут вводить двойные связи, считая от карбоксильного (Δ) или метильного (ω) конца, или от ранее существовавшей двойной связи по направлению к карбоксильному или метильному концу цепи ЖК. Способ отсчета Δ6-ДЖК, являющейся ключевым ферментом синтеза гамма-линоленовой кислоты, ранее не изучался. В этой работе мы экспрессировали Δ6-ДЖК из Synechocystis sp. PCC 6803 в клетках Synechococcus elongatus PCC 7942 (способного синтезировать только ЖК с одной двойной связью в положении Δ9) и наблюдали появление необычных ЖК с одной двойной связью в положении Δ6, а также двумя двойными связями в положениях Δ6,9. Добавленная цис-10-гептадеценовая кислота (17:1∆10) превращалась в цис,цис-6,10-гептадеценовую (17:2∆6,10) [1]. Эти данные показывают способность Δ6-ДЖК вводить первую двойную связь в ненасыщенные субстраты и «отсчитывать» 6 атомов углерода, начиная от карбоксильного конца независимо от наличия или отсутствия предшествующей двойной связи в цепи ЖК. Результаты могут быть использованы при дизайне молекул жирных кислот в маслах, полученных генно-инженерным способом. 1.5.2. Отработана технология интенсивного культивирования микроводоросли Chlorella sorokiniana IPPAS C-1 в закрытых фотобиоректорах для пилотного производства биомассы. Биомасса микроводорослей используется для получения продуктов различного назначения: кормов и пищевых добавок; пигментов и красителей; медицинских препаратов и биотоплива нового поколения. Технология культивирования хорошо встраивается в системы утилизации отходов и востребована в замкнутых системах жизнеобеспечения. Главные задачи при этом – создание конкурентно способных технических решений и отработка технологии промышленного культивирования. В отделе молекулярных биосистем ИФР РАН разработаны фотобиореакторы (ФБР) для интенсивного культивирования микроводорослей и цианобактерий, проведена отработка технологических режимов и условий культивирования приближенных к промышленным. Результаты получены при культивировании зеленой микроводоросли Chlorella sorokiniana IPPAS С-1 [2,3]. Показано, что выращивание в накопительном режиме предпочтительнее для достижения большей урожайности при кратковременном культивировании (3-5 суток). Полу-проточный режим лучше подходит для длительного культивирования (более 5 суток) из-за периодического снятия урожая и обновления культуры в фотобиореакторе. Получен прирост биомассы микроводорослей в 367 раз от первоначального (с 0,6 до 196 г. сухого веса) за 13 суток культивирования при отработке технологии масштабирования рабочего объема от 0,25 до 70 литров [2]. Для оптимизации работы фотобиореакторов была проведена серия экспериментов по выявлению зависимости продуктивности культуры C. sorokiniana IPPAS С-1 от условий подачи газо-воздушной смеси (ГВС) [3]. Показано, что режим подачи ГВС в суспензию микроводорослей существенно влияет на их рост и прирост биомассы. Недостаточная подача СО2 и высокая степень перемешивания приводили к пенообразованию, а отсутствие надлежащего перемешивания суспензии приводило к заметному осаждению клеток водорослей на дне ФБР. Крайне важно избегать данных эффектов при интенсивном культивировании биомассы. Для культивирования C. sorokiniana IPPAS C-1 были определены оптимальные условия подачи ГВС – 3 мл CO2 на 1 л суспензии в минуту (при температуре около 36 °С и уровне облученности 900 мкмоль/м2с). Выявленные оптимальные условия культивирования обеспечили эффективный выход биомассы с продуктивностью в 1,51±0,07 г. сухого веса на литр суспензии в сутки и относительно высокую эффективность поглощения СО2 в 35%. Разработанные ФБР отличаются простотой изготовления и высокой эффективностью работы, а описанные выше принципы повышения эффективности интенсивного культивирования C. sorokiniana IPPAS С-1 актуальны для разработки технологических режимов промышленного производства хлореллы в плоскостных ФБР различных объемов. 1.5.3. Изучена возможность секреции рекомбинантных белков клетками E. coli с помощью лидерного пептида внеклеточной карбоангидразы EcaA цианобактерии Crocosphaera subtropica ATCC 51142. Несколько форм белка EcaA, соответствующих внеклеточной карбоангидразе (КА) α-класса цианобактерии Crocosphaera subtropica ATCC 51142, экспрессировали в клетках Escherichia coli. Рекомбинантные белки без лидерного пептида (EcaA или же ЕсаА в составе фьюжн белка, слитый с тиоредоксином или глутатион-S-трансферазой со стороны своего N-конца) локализовались внутри клеток в полноразмерной форме; эти клетки не проявляли никакой внеклеточной активности КА. Фракция периплазматических белков клеток E. coli, экспрессировавших ЕсаА с собственным лидерным пептидом (L-EcaA), или L-EcaA, слитый с тиоредоксином или глутатион-S-трансферазой со стороны N-конца, содержала процессированную форму белка, не имеющую лидерного пептида – EcaA. Появление зрелого ЕсаА во внешних слоях клеток E. coli, экспрессирующих белки, обладающие лидерным пептидом, было напрямую подтверждено иммунофлуоресцентной микроскопией. Эти клетки также проявляли высокую внеклеточную активность КА. Кроме того, зрелый белок EcaA был обнаружен в культуральной среде. Это свидетельствует о том, что лидерный пептид цианобактерий распознается секреторным аппаратом и лидерной пептидазой E. coli даже как часть фьюжн-белка. Эффективность лидерного пептида EcaA была сопоставима с эффективностью сигнальных пептидов белков PelB и TorA, обычно используемых для биотехнологического получения внеклеточных рекомбинантных белков в E. coli [4]. 1. Starikov A.Y., Sidorov R.A., Goryainov S., Los D.A. (2022) Acyl-lipid Δ6-desaturase may act as a first FAD in cyanobacteria. Biomolecules 12, 1795. doi: 10.3390/biom12121795. (IF=6,064; Q1) 2. Gabrielyan D.A., Sinetova M.A., Gabel B.V., Gabrielian A.K., Markelova A.G., Rodionova M.V., Bedbenov V.S., Shcherbakova N.V., Los D.A. (2022) Cultivation of Chlorella sorokiniana IPPAS C-1 in flat-panel photobioreactors: From a laboratory to a pilot scale. Life 12, 1309. doi: 10.3390/life12091309. (IF 3.253; Q2) 3. Gabrielyan D.A., Gabel B.V., Sinetova M.A., Gabrielian A.K., Markelova A.G., Shcherbakova N.V., Los D.A. (2022) Optimization of CO2 supply for the intensive cultivation of Chlorella sorokiniana IPPAS C-1 in the laboratory and pilot-scale flat-panel photobioreactors. Life 12, 1469. doi: 10.3390/life12101469. (IF 3.253; Q2) 4. Kupriyanova E.V., Sinetova M.A., Leusenko A.V., Voronkov A.S., Los D.A. (2021) A leader peptide of the extracellular cyanobacterial carbonic anhydrase ensures the efficient secretion of recombinant proteins in Escherichia coli. J. Biotechnol. 344, 11-23. doi: 10.1016/j.jbiotec.2021.12.006. (IF 3,503; Q2).

Аннотация результатов, полученных в 2023 году
Изучен способ "отсчета" атомов углерода при образовании двойной связи ацил-липидным омега-3 десатуразами жирных кислот (ДЖК). В отсутствие природного субстрата омега-3 ДЖК – линолевой кислоты (18:2D9.12) этот фермент проявляет неспецифическую активность. Трансформант цианобактерии Synechococcus elongatus PCC 7942, коэкспрессирующий D12- и омега-3 ДЖК из Synechocystis sp. PCC 6803, синтезировал небольшие количества необычных диеновых ЖК: 16:2D9,14 и 16:2D9,13. Последняя кислота, вероятно, является продуктом деятельности омега-3 ДЖК, «считающей» атомы углерода с метильного конца ЖК. Трансформант синтезировал диеновые 16:2D9,12 и триеновые 16:3D9,12,14, что снова указывает на «отсчет» от метильного конца ЖК. Добавление экзогенной кислоты 19:1D10 к клеткам двойного трансформанта приводило к образованию 19:2D10,13, которую продуцировала D12-ДЖК, отсчитывая 3 атома от первой существующей двойной связи. Эти результаты, однако, не проясняют специфичность омега-3 ДЖК, поскольку какие-либо триеновые ЖК - производные от 19:2D10,13 - в клетках трансформанта обнаружены не были. Минорные фракции ЖК двойного мутанта Synechocystis sp. PCC 6803, дефектного по D6- и D12-ДЖК, наряду с диеновой 16:2D9,12, содержал необычный диен - 16:2D9,13, который мог быть результатом активности омега-3 ДЖК, "отсчитывающей" от метильного конца ЖК. Модернизирована лабораторная система интенсивного культивирования микроводорослей и цианобактерий. Разработан и изготовлен модульный фотобиореактор (ФБР) закрытого типа для массового (промышленного и полупромышленного) культивирования микроводорослей и цианобактерий объемом 100 л (ФБР-100). Этот реактор состоит из 4 модулей по 25 литров каждый и использует светодиодное освещение. Разработана и испытана модель солнечного фотобиореактора (СФБР) для высокоинсоличных регионов Российской Федерации. Исследованы режимы культивирования микроводорослей и цианобактерий в ФБР-100 с целью получения биомассы высокой чистоты, пригодной для дальнейшей переработки и получения дорогостоящей продукции. Режим подачи газовоздушной смеси был выбран таким, чтобы обеспечить эффективный массоперенос (поглощение СО2 и удаление О2) за счет интенсивного перемешивания суспензии и длины барботажных путей. Режимы сбора биомассы отработаны с использованием препаративной проточной центрифуги. Биомасса получена в виде суспензии, жидкого концентрата, пасты и сухого порошка.