Аннотация результатов, полученных в 2021 году
В рамках проекта РНФ Лаборатория № 21-74-30016 в Институте биоорганической химии им. М. М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова РАН создана лаборатория “Органотипические модели опухолей с использованием микрофлюидных технологий”, основными целями и задачами исследования которой в 2021 г. являются: - Разработка и создание устройства органотипической микрофлюидной опухолевой 3D-модели (ОМОМ), адаптированной к человеческим клеточным линиям, включая линии рака молочной железы, экспрессирующих различные вариации клеточных маркеров HER-2, EpCAM и PD-1/PD-L1. - Разработка нанотехнологической платформы с целью создания наноразмерных тераностических агентов и их последующего тестирования в созданных устройствах ОМОМ. Разработанная нанотехнологическая платформа будет включать в себя: как новые оптические контрастные агенты, такие как наночастицы с контролируемым временем жизни фотолюминесценции для мультиплексного имиджинга биологических компонентов огранотипической опухолевой модели, так и многофункциональные наноразмерные тераностические агенты с противоопухолевыми свойствами, позволяющие объединить в одном комплексе сочетанные механизмы терапевтического воздействия. - Разработка и апробация таргетных противоопухолевых агентов селективного действия к раку молочной железы определённого профиля. В частности, будет создан химерный конструкт фотоиммунной терапии на основе фотосенсибилизатора и белкового таргетного агента. Для апробации таргетных противоопухолевых агентов будут созданы HER-2-экспрессирующие флуоресцентные клетки. - Оптимизация приготовления биоптата для воссоздания клеточного органоида в микрофлюидной системе. Отработка методов фракционирования биоптата, включая идентификацию и анализ распределения опухолевых клеток и различных субпопуляций лимфоцитов в биоптате. Будут исследованы подходы к пролонгированному культивированию биоптатов и определены конкретные методы культивирования с сохранением ключевых морфологических и функциональных свойств. - Разработка и характеризация наночастиц с контролируемым временем жизни фотолюминесценции для мультиплексного имиджинга биологических компонентов органотипической опухолевой модели. Разработка поверхностной модификации наночастиц, способствующей их использованию в биологических жидкостях. Разработка методики биоконъюгации для присоединения функциональных биомолекул. - Создание технологии получения многофункциональных наноразмерных тераностических агентов с противоопухолевыми свойствами, позволяющие объединить в одном комплексе сочетанные механизмы терапевтического воздействия. - Разработка таргетных противоопухолевых агентов селективного действия к раку молочной железы определённого фенотипического профиля. - Разработка и тестирование терапевтической эффективности агентов фотоиммунной терапии на основе фотосенсибилизатора и белкового таргетного агента. Изучение совместного терапевтического действия адресных иммунотоксинов и иммунотерапевтических препаратов в опухолевой 2D-модели in vitro. - Получение генетически-маркированных линий опухолевых клеток, флуоресцирующих в области прозрачности биоткани. Все указанные задачи были выполнены в годовой период. Дополнительно проведены эксперименты, связанные с получением NK-клеток, обладающих эффективной противоопухолевой активностью, в котрых была модифицирована и отработана методика оценки цитотоксичности NK-клеток (общего пула) против клеток-мишеней, в том числе в отношении ErbB2/HER-2-позитивных клеточных линий в 2D- модели. Также проведена молодежная научная школа: 74-я всероссийская с междунордным участием школа-конференция молодых ученых “Биосистемы: организация, поведение, управление”, посвященная памяти профессора А. П. Веселова, 20-23 апреля 2021 г. в Нижнем Новгороде, где доложены ключевые результаты проведенных исследований. По результатам исследований опубликовано 6 статей (Q1) в научных реферерируемых журналах

Аннотация результатов, полученных в 2022 году
Раздел 1. Были получены 3D модели опухолей (сфероиды) на основе Her2-положительных клеточных линий со стабильной экспрессией красных флуоресцентных белков: SKOVip-kat, MCF7-iRFP, SKBR3-kat, BT474-kat, и ряда других клеточных линий с различным фенотипом, а также их комбинаций, например SKOVip-kat с линией эндотелиальных клетокEa.hy 926 и фибробластами BJ-5TA. Для получения сфероидов использовали разработанную на предыдущем этапе реализации проекта методику заливки агарозы в напечатанные на 3D-принтере мастер-формы. Изучен рост опухолевых сфероидов в фрагментах децеллюляризованных внеклеточных матриксов. Показано, что рост сфероидов внутри и на поверхности ДЦЛ матрикса кардинально отличается. Клетки меняли свой псевдоэпителиальный морфотип на мезенхимальный при переходе от роста на поверхности к росту в теле матрикса, что позволяет сделать вывод о рациональности применения модели на основе ДЦЛ матрикса и его компонентов к исследованиям особенностей роста и развития опухолевых клеток. Раздел 2. Было проведено определение токсичности коммерческих противораковых препаратов на 2D и разработанных 3D моделях опухолей с различным профилем экспрессии опухолевых маркеров: SKOVip-kat со сверхэкспрессией HER2, MCF7-iRFP со сверхэкспрессией EpCAM, MDA-MB-231с нормальной экспрессией данных рецепторов. Определены значения IC50 для препаратов с различными механизмами действия, а именно иринотекана (цитотоксический препарата из группы камптотецинов, ингибитор топоизомеразы I), цисплатина (цитотоксический препарат, повреждающий ДНК, комплексный хлорид-аммиакат двухвалентной платины) и доксорубицина (противоопухолевый антибиотик антрациклинового ряда). Значения IC50 составили 22,0+-0,9 мкМ (IRI), 55,7+-0,3 (CIS) и 0,9+-0,2 (DOX) для линии SKOVip-kat; 13,9+-1,3мкМ (IRI), 4,8+-0,5 (CIS), 0,3+-0,1 мкМ (DOX) для линии MCF7-iRFP; 28,5+-2,4мкМ (IRI), 2,1+-0,1мкМ (CIS), 0,9+-0,1 мкМ (DOX) для линии MDA-MB-231. Подтверждена эффективность разработанной модели оценки токсичности в 3D сфероидах по флуоресценции белков в клетках (Katushka 2S) для тестирования химиотерапевтических агентов. Раздел 3. Методом количественной ПЦР было показано, что в процессе формирования 3D сфероидов на основе клеточных линий с гиперэкспрессией онкомаркёра HER2/neu: ВТ474, SK-BR-3 и SCOV3 наблюдается значительное усиление синтеза мРНК опухолеассоциированного рецептора Her2, цитокинов (TGFb для клеток линии ВТ474 и IL-6 и IL-8 для SK-BR-3 и SCOV3), маркёров гипоксии (GLUT1 и CA9 для ВТ474, HIF-1 и GLUT1 для SK-BR-3, HIF-1 для SCOV3) и белков контрольных точек иммунной системы PD-1 и PD-L1. Раздел 4. Был выполнен сравнительный анализ пролиферативной активности и активационного фенотипа выделенных из периферической крови NK-клеток при разных типах стимуляции, на основе которого был выбран предпочтительный способ их активации для дальнейшего использования в качестве клеток-эффекторов в модели опухолевых сфероидов, который включал инкубацию в присутствии рекомбинантного IL-2 и фидерных клеток K562-mbIL21. При работе со сфероидами и NK-клетками использовался комбинированный подход для контроля и документирования размеров сфероидов, количественного анализа клеток-мишеней (цитотоксичности, жизнеспособности) и клеток-эффекторов с помощью стереоскопической и флуоресцентной микроскопии, цитометрическим и спектрофлуориметрическим методами. С помощью конфокальной микроскопии 3D-модели опухолевых клеточных линий со стабильной цитоплазматической экспрессией флуоресцентных белков на примере клеток SCOV-3-Kat была оценена противоопухолевая активность NK-клеток; при этом доля светящихся клеток-мишеней в опыте уменьшалась до 45% от контроля. Было высказано предположение, что повышенная чувствительность определенных клеточных линий к действию NK-клеток может быть связана также с экспрессией специфических лигандов к активирующим рецепторам NK-клеток, в частности, к рецептору NKG2D. В 3D моделях была проанализирована чувствительность опухолевых клеток к субпопуляциям NK-клеток с разной интенсивностью экспрессии NKG2D, выделенных с помощью клеточной сортировки. Противоопухолевая NK-клеточная эффективность, оцененная по уменьшению доли жизнеспособных опухолевых клеток в сфероиде, была также более выражена в образцах с NK-клетками из фракции NKG2Dhi и в меньшей степени проявлялась в присутствии клеток с низким уровнем экспрессии NKG2Dlo. Раздел 5. В модели сфероидов рака яичника, полученной из флуоресцентной клеточной линии SKOVip-Kat, было изучено проникновение фототермических наночастиц PLGA диаметром 200 нм, нагруженных фталоцианиновым красителем (PLGA/Pht-Mg). Показано, что использование белка JO-4, индуцирующего временный обратимый эпителиально-мезенхимальный переход, значительно повышает противоопухолевый эффект фототермической терапии. Раздел 6. В МТТ-тесте на выбранных GD2-позитивных и GD2-негативных клеточных линиях был выявлен конъюгат scFv14.18-MMAF, обладающий наибольшей цитотоксической активностью. На GD2-позитивных клетках человеческой нейробластомы IMR-32 и человеческой глиомы T98G конъюгат scFv14.18-MMAF индуцировал клеточную гибель, но при концентрациях несколько более высоких, чем на клетках мышиной лимфомы EL4. IC50 препарата scFv14.18-MMAF на клетках IMR-32 составляла 1.8 мкг/мл, а для линии T98G - 4.6 мкг/мл. Цитотоксические эффекты, проявляемые конъюгатами scFv фрагментов с препаратами, были дополнительно подтверждены в PI тесте, где конъюгат scFv-MMAF увеличивал количество клеток с фрагментированной ДНК более чем в 5 раз относительно контрольных клеток в GD2-позитивных клетках B78-D14. Раздел 7. Кодирование биомаркеров с возможностью их одновременного считывание получило название технологии мультиплексирования/демультиплексирования. В настоящем проекте мультиплексирование было реализовано с помощью нового класса фотолюминесцентного наноматериала, называемого «тау-рубин», состоящего из нанокристаллов рубина – корунда, легированного ионами хрома (Al2O3:Cr3+) с настраиваемым временем излучения фотолюминесценции. Были разработаны тау-рубины в форме хлопьев с толщиной около 5 нм, что в перспективе открывает возможности для внеклеточного сенсинга. Возможности бесфонового мультиплексирования/демультиплексирования были протестированы на образцах с легированием от 0,2 % до 1 %. Раздел 8. Проведена валидация разработанной на предыдущем этапе проекта 3D-модели сфероидов с использованием липосом, модифицированных по внешней поверхности HER2-специфичным скаффолдом и нагруженных большим количеством цитотоксического агента (доксорубицин или пептидо-нуклеиновые кислоты, комплементарные теломерным повторам хромосом человека). Все полученные липосомы обладали HER2-специфичной цитотоксичностью в отношении монослойной культуры и 3D-сфероидов. В рамках работ по характеристике систем для фотодинамической терапии с применением внутренних неинвазивных источников света на основе биолюминесцентного резонансного переноса энергии (BRET), изучена возможность проведения BRET-опосредованной ФДТ в организме животного. Показано, что применение генетически кодируемого сенсора на основе люциферазы NanoLuc и фототоксичного белка miniSOG позволяет проводить BRET-опосредованное возбуждение фотосенсибилизатора miniSOG in vivo.

Аннотация результатов, полученных в 2023 году
1. Разработка 3D-моделей для тестирования противораковых агентов. Были получены опухолевые клетки линий L929, Eahy926, EA.hy926 и BJ-5TA, стабильно экспрессирующие флуоресцентный белок GFP, и клетки линий UMUC-3 EMT, стабильно экспрессирующие флуоресцентный белок RFP. Были синтезированы и исследованы гидрогели для культивирования 3D сфероидов на основе коллагена и децелляризированного матрикса, выделяемого из биоптатов ортотопических опухолей мышей посредством перевивания иммунокомпетентным мышам линии клеток рака молочной железы мыши ЕМТ6, обладающих сверхэкспрессией онкомаркера человека HER2. Изучено влияние на устойчивость клеток рака мочевого пузыря UMUC и человеческих фибробластов BJ-5ta к противоопухолевым препаратам гидроксикарбамиду и цисплатину. 2. Разработка и применение методов анализа клеточной жизнеспособности, фенотипа и распределения клеточных фракций, профиля цитокинов и хемокинов. Оценка цитотоксичности периферических NK-клеток, активированных in vitro комбинацией IL-2 и фидерных клеток K562-mbIL21, и NK-подобной клеточной линии NK-92 против сфероидов, сформированных из клеток опухолей молочной железы и яичников BT-474, MCF7 и SKOV-3, с помощью проточной цитометрии, конфокальной микроскопии и биолюминесценции. Показано распределение противоопухолевых эффектов первичных NK-клеток и линии NK-92 против сфероидов разных клеточных типов; определена цитолитическая активность NK-клеток. Разработан метод анализа профиля цитокинов и хемокинов при контактном взаимодействии NK-клеток с опухолевыми сфероидами; охарактеризованы отличия в продукции растворимых факторов NK-клетками, клетками линии NK-92 и клетками-мишенями. 3. Исследование ответа базовой модельной системы смешанных сфероидов (3D сфероиды из Her2-экспрессирующих линий опухолевых клеток с добавлением клеток эндотелия и/или фибробластов) на противоопухолевые препараты, в том числе изучение сочетанного применения. Получена и охарактеризована модель смешанных сфероидов, сформированных из клеток аденокарциномы яичника (SKOV3-ip) и клеток стромы, представленной модифицированными клетками пупочной вены человека EA.hy926 и клетками модифицированных фибробластов BJ-5TA. Получена BRET-активируемая система на основе мультимодального белка DARP-NanoLuc-SOPP3; охарактеризована эффективность биолюминесцентного резонансного переноса энергии (величина BRET) в системе DARP-NanoLuc-SOPP3 и способность белка DARP-NanoLuc-SOPP3 взаимодействовать и интернализоваться Her2-экспрессирующими клетками. Изучены цитотоксические свойства BRET-активируемой системы на модели смешанных сфероидов. Показано, что сочетанное применение разных по механизму действия противоопухолевых агентов (DARP-NanoLuc-SOPP3 вызывает гибель клеток по механизму некроза. 4. Оценка действия на модели опухоли субпопуляций аллогенных NK-клеток, в том числе субпопуляций «адаптивных» NK-клеток, на различной стадии дифференцировки. Оценка действия субпопуляций аллогенных NK-клеток, в том числе субпопуляций адаптивных NK-клеток, на различной стадии дифференцировки на модельной системе их взаимодействия с опухолевыми сфероидами, сформированными из клеток линий BT-474, MCF7 и SKOV-3. Охарактеризована поверхностная экспрессия влияющих на цитотоксический ответ основных маркеров NK-клеток и их рецепторов, таких как CD16, KIR2DL2/3, CD57, NKG2C среди CD107a+ NK-клеток; определены наиболее цитолитически активные NK-клетки в отношении опухолевых сфероидов различных клеточных линий. 5. Исследование проникновения и внутри-органоидного транспорта белковых таргетных агентов, иммунотоксинов и наночастичных средств доставки. В модели сфероидов рака яичника, полученной из флуоресцентной клеточной линии SKOVip-Kat, изучено проникновение фототермических наночастиц PLGA диаметром 200 нм, нагруженных фталоцианиновым красителем (PLGA/Pht-Mg). Показано, что для повышения проникновения частиц в сфероид может быть использован белок JO-4, что позволяет наночастицам проходить через плотные контакты клеток. JO-4 увеличивал накопление наночастиц в клетках внутри сфероида и повысил противоопухолевый эффект фототермической терапии. На комбинированных сфероидах из клеток SKOV3-kat, Eahy926-GFP, BJ-5TA протестирована активность противораковых препаратов с различным механизмом действия. Наиболее эффективной оказалась комбинация паклитакселя, разрыхляющего плотный сфероид, и иммунотоксина DARPin-loPE. 6. Применение методики мультиплексного картирования времени жизни. Для реализации технологии мультиплексирования разработаны нанорубины в форме хлопьев с толщиной около 5 нм. Разработана пара FRET с нанорубинами; продемонстрирована возможность контроля фотолюминесценции рубиена Проведена микроскопия смешанных сфероидов, сформированных из клеток рака мочевого пузыря Um-Uc-3, экспрессирующих красный флуоресцентный белок (Katushka), и клеток эндотелия человека EA.hy926, экспрессирующих зеленый флуоресцентный белок (TagGFP2), с добавлением в систему окрашенных макрофагальных клеток Raw264.7, содержащих полистирольные наночастицы, окрашенные красным флуоресцентным красителем NileRed. 7. Изучение тераностики с использованием наночастичных комплексов, доставленных в органотипическую опухолевую модель. Для изучения эффекта повышенной проницаемости и удержания сосудистой сетью солидных опухолей макромолекулярных соединений, был синтезирован ряд наноструктур: Наночастицы из биоразлагаемого полимера полилактид-согликолида (PLGA) с модификацией адресной молекулой аффибоди. PLGA-частицы, содержащие фотосенсибилизатор Бенгальская роза. PLGA-частицы, содержащие два красителя ближнего инфракрасного диапазона, а именно нильский синий (NB) — для визуализации, и IR-780, лазерное облучение которого приводит к повышению температуры и образованию активных форм кислорода. Продемонстрировано опухолеспецифическое накопление наночастиц PLGA-IR-780-NB in vivo после внутривенного введения. Наноэмульсии, загруженные флуоресцентным красителем DiR, к поверхности которых конъюгирован циклический RGD-пептид, обладающий высокой аффинностью к интегриновым рецепторам, во множестве экспрессирующихся на поверхности клеток эндотелия опухоли. 8. Отработка методик и получение конъюгатов HER2-специфичных антител и скаффолдовых молекул (DARPin) с препаратом MMAE. Получены конъюгаты HER2-специфичных антител trastuzumab и белка DARPin G3 с производным препарата монометил ауристатина E - mc-vc-PAB-MMAE; охарактеризованы их антиген-связывающие свойства в отношении онкомаркёра HER2. Получены флуоресцентные конъюгаты HER2-специфичного антитела trastuzumab и белка DARPin G3 с флуоресцеин-6-малеимидом. Определены цитотоксические свойства конъюгатов в 2D культурах клеток и 3D сфероидах. Показано, что конъюгаты trastuzumab-MMAE и DARPin G3-MMAE обладают высокой цитотоксичностью и избирательностью действия в отношении HER2-позитивных клеточных линий. 9. Проведение школы молодых учёных XXVII МЕЖДУНАРОДНАЯ ШКОЛА МОЛОДЫХ УЧЁНЫХ И СТУДЕНТОВ ПО ОПТИКЕ, ЛАЗЕРНОЙ ФИЗИКЕ И БИОФОТОНИКЕ в рамках Saratov Fall Meeting ’23, г. Саратов, 25-26 сентября 2023 г.