Аннотация результатов, полученных в 2021 году
Эксперимент был проведен на 35 животных (взрослые крысы-самцы линии Sprague-Dawley, 250±20 г) (SPF- виварий ИЦиГ СО РАН, г. Новосибирск). В качестве модели ишемического инсульта использовалась модель(MCAO) окклюзии церебральной артерии (МСА) с реперфузией. После операции животные были случайным образом поделены на три экспериментальные группы согласно временным точкам 10 cуток (c), 30 c и 60 c. Ложнооперированные животные (n=15) подвергались тем же манипуляциям но без окклюзии МСА. Выживаемость к концу эксперимента составила 78% (n=15 в группе "Ишемия", n=15 в группе "Контроль"). Через 1 c после операции проводилась оценка неврологического дефицита (NSS), которая выявила нарушения у животных с МСАО. Маркер пролиферации клеток, бромдезоксиуридин (BrDU) вводился внутрибрюшинно в дозе 50 мг/кг с 1 по 10 c после операции, для мечения новых нейронов и олигодендроцитов в ранние сроки после инсульта и отслеживания их миграции через 30 и 60 c после ишемии. Животные выводились из эксперимента на трех временных точках после MCAO: 10, 30 и 60 c. Выведение осуществлялось методом транскардиальной перфузии 4% параформальдегидом. Затем ткани (мозг) проходили двухэтапную криопротекцию (10% и 20% сахароза в фосфатном-буфере) и заморожен в парах жидкого азота для хранения (при T=-80°С). МРТ-сканирование проводилось в ряде временных точек: до и после операции на 1, 3, 10, 30 и 60 c на магнитно-резонансном томографе Bruker Biospec 11.7 T для мелких лабораторных животных. Протокол МПФ картирования (параметр, который ранее показал сильную корреляцию с содержанием миелина в структурах мозга) включал 5 импульсных последовательностей: МТ - взвешенная последовательность, Т1- взвешенная последовательность, PD- взвешенная последовательность, GRE последовательность, AFI последовательность. Сканирование осуществлялось в коронарной проекции, разрешение 200×200×400 мкм, 4 усреднения сигнала, матрица 180×180×90, толщина среза 0.4 мм Полное время сканирования одного животного составляло 35 минут. 3D карты МПФ были реконструированы с использованием одноточечного алгоритма с синтетическим референтным изображением, реализованного в ранее разработанном в нашей лаборатории программном обеспечении на языке C. Дополнительно были получены Т2-ввешенные и диффузионно-взвешенные изображения для построения карт измеряемого коэффициента диффузии (ADC). T2-взвешенные изображения были получены с использованием последовательности множественного спинового эха с TR = 3000 мс, 16 эхо-сигналов с TE в диапазоне 10–160 мс, толщиной среза 1.2 мм, матрица 300×300×12, разрешением в плоскости 200×200 мм2 и временем сканирования 6 мин 50 с. Для картирования ADC использовалась однократная диффузионно-взвешенная эхо-планарная последовательность спинового эха с TR/TE = 1500/15,4 мс, тремя фактическими значениями b 4,5, 484,2 и 946,5 с/мм2, толщиной среза 0,8 мм, разрешением в плоскости 300×300 мм2, время сканирования 6 мин 40 с. Параметрические карты ADC были реконструированы с использованием стандартного программного обеспечения Paravision. Все параметрические карты были получены в коронарной плоскости. Применен новый алгоритм для расчёта МПФ карт, который использует не реальную, а синтетическую карту поля B1 Принцип алгоритма основан на математических зависимостях, связанных с B1 и МПФ, позволяющих извлекать синтетическую карту поля B1 из нескорректированных карт R1 и МПФ. Новый алгоритм обеспечивает одновременно коррекцию B1 на основе данных VFA R1 и одноточечное картирование МПФ. Применение этого алгоритма позволило существенно улучшить качество МПФ карт, полученных в ходе экспериментов, и уменьшить артефакты, вызванные нестабильной работой катушки томографа. Обработку Т2-взвешенных изображений и карт МПФ и ADC проводили в программе ITK-SNAP 3.8.0. Границы полушарий, всего мозга, ишемического поражения и его отдельных зон сегментировались вручную. Статистическая обработка результатов проводилась в программе Statistica 10.0. Для определения центральной области ишемического поражения из серии изображений мозга животного, полученной через 3 с после МCAO, выбиралось то, на котором область с гиперинтенсивным сигналом была самой обширной. Из серий изображений мозга до операции, через 1, 10, 30 и 60 с выбирались изображения, находящиеся на этом же уровне, что и 3 дневное изображение. Из выбранных изображений составили последовательности, иллюстрирующие эволюцию ишемических очагов. Измерение площади области с гиперинтенсивным сигналом проводили в программе ImageJ. Границы области ишемического очага оценивали визуально по Т2-взвешенным изображениям. По выбранным изображениям определялась саггитальная координата для получения криосрезов мозга, которые будут проанализированы гистологически и иммуногистохимически относительно процессов восстановления. Анализ динамики очага по данным T2 изображениям показал, что в интервале от 1 до 3 с происходит изменение объема ишемического поражения. У отдельных животных выраженное уменьшение зоны поражения наблюдается уже к 3 с, у других происходит дальнейшее расширение объема поражения. К 10 с у всех животных выявлено уменьшение зоны поражения, у отдельных животных зона очаг вообще не фиксируется на Т2-изображениях. У большинства крыс (9 из 11) через 30 и 60 с после МСАО наблюдается уменьшение или полное исчезновение области гиперинтенсивного сигнала, кроме животных, у которых наблюдалось сильное поражение мозга с первых с после MCAO, затрагивающее обширные области мозга, включая кору. Уменьшение размеров отека или его отсутствие может означать, что к этому времени происходит частичное восстановление пораженной области. Для ряда животных область и начиная с 10 c после МСАО разделяется на две зоны, в одной из которых наблюдается дальнейшая демиелинизация согласно картам МПФ, а в другой – восстановление миелина. В области демиелинизации значимое снижение содержания миелина наблюдается, начиная с 1 c наблюдения, на 10 c начинает снижение начинает прогрессировать и достигает максимума к 60 с. Следовательно, выраженное разрушение миелина происходит позже, начиная с 10-х c и нарастая к 60 суткам (85-90 %, р ≤ 0.05). В зоне ремиелинизации, напротив, наблюдается медленное восстановление миелина (85 % относительно контроля к 60 с, р ≤ 0.05). Зона ремиелинизации визуально наблюдается внутри очага на картах МПФ и представляет собой значительный интерес в плане восстановительного потенциала головного мозга после инсульта в долгосрочной перспективе. Однако, отличия статистически значимых отличий выявлено не было. В зоне гиперинтенсивности (ремиелинизации) не наблюдается значимых отличий между ишемическим и контралатеральным полушарием, но на 30 и 60 c % МПФ в ипсилатерльном полушарии значимо (р ≤ 0.01) выше, чем на 1-10 с. Для имунногистохимических исследований (ИГХ) были получены коронарные криосрезы мозга толщиной 10 и 50 мкм на криотоме HM525 с саггитальной координатой, соответствующей наиболее обширной области ишемического поражения. В ходе выполнения работ по проекту были отработаны методики и поставлены протоколы окрашивания, которые будут использованы для анализа срезов на второй год выполнения проекта: 1) На молодые (DCX) и зрелые (NeuN) нейроны в сочетании с антителами к BrdU, а также в сочетании с другими маркерами (GFAP – маркер астроцитов, VEGF – маркер роста сосудов, NF – маркер аксонов, NG2 и CNP – маркеры олигодендроцитов). 2) На миелин (MBP), зрелые олигодендроциты (CNP) и их предшественники (NG2) в сочетании с антителами к BrdU, а также в сочетании с другими маркерами (DCX и NeuN – маркеры нейронов, NF – маркер аксонов). Были получены флуоресцентные микрофотогрaфии целых срезов мозга толщиной 10 мкм на микроскопе Axio Imager Z2 (Carl Zeiss) и программного обеспечения AxioVision 4.8. 3D флуоресцентные изображения фрагментов срезов толщиной 50 мкм получены с помощью конфокального лазерного сканирующего микроскопа LSM 780 NLO (Carl Zeiss) и программного обеспечения ZEN 2.1 (Carl Zeiss). С использованием данных протоколов ИГХ на второй год выполнения проекта будут исследованы процессы олигодендрогенеза, нейрогенеза, рост аксонов и миелинизация пораженных аксонов.

Аннотация результатов, полученных в 2022 году
За отчетный год был проведен детальный анализ данных эксперимента, проведенного в первый год выполнения проекта. Для ИГХ исследований были получены коронарные криосрезы мозга толщиной 10 и 50 мкм. Саггитальная координата срезов относительно bregma была подобрана в соответствии с локализацией ишемического очага, определяемого по Т2-взвешенным изображениям. Срезы окрашивали иммуногистохимически с помощью следующих антител: Goat-anti-doublecortin - для мечения молодых нейронов, Rabbit-anti-NeuN - для визуализации зрелых нейронов,Rabbit anti-NG2 - для мечения предшественников олигодендроцитов, Goat-anti-MBP - для визуализации миелина, Mouse-anti-BrdU - для визуализации пролиферации клеток, у которых репликация ДНК перед делением клеток произошла в период введения животным BrdU, Rabbit anti–GFAP – для визуализации астроцитов, Rabbit anti-NF-H– для визуализации нейрофиламентов аксонов, Для гистологического окрашивания миелиновых волокон использовали 0,1 %-ный раствор быстрого голубого люксоля (ЛФБ). Контуры очага, сегментированные по МРТ Т2 изображениям, переносились на карты МПФ по которым считался процент содержания миелина в области поражения. Размер ишемического очага достигает максимального размера на 3-и сутки после операции, а затем его размер снижается от 10-х до 60-х суток наблюдения. На картах ADC на 1-3 сутки после операции наблюдается гипоиненсивность в очаге инсульта, на 10-е сутки – едва заметная гиперинтенсивность, а на 30-е и 60-е сутки – более заметная интенсивность, сходная с локализацией очага на Т2-взвешенных изображениях. На картах МПФ отмечается другая динамика. Наиболее обширная область демиелинизации наблюдается на 1-3 сутки после ишемии, далее эта область уменьшается в размере и в целом соответствует локализации очага на Т2-взвешенных изображениях и карах ADC. На 30-60 сутки на картах МПФ в области, прилегающей к очагу, согласно Т2-взвешенным изображениям, наблюдается зона гиперинтенсивности относительно исходного уровня и контралатерального полушария. Это соответствует полученным ранее результатам на меньшей выборке животных, другой линии, с другими временными точками и с помощью другого томографа. Обнаруженное нами увеличение значений МПФ относительно контроля в зоне ремиелинизации, прилегающей к ядру ишемического очага, мы связываем с восстановительными процессами роста аксонов и их ремиелинизацией, что подтверждают и описанные выше данные гитологии и ИГХ. Оценен вклад новых нейронов в восстановление структуры нервных связей после ишемического инсульта. Подсчёт предшественников нейронов (DCX+ клеток) проводился в зонах ишемического поражения мозга, на картах МПФ визуализировавшихся как зоны гипо- и гиперинтенсивностей, а также в симметричных зонах контралатерального полушария. Ишемический инсульт приводил к усилению продукции новых нейронов в субвентрикулярной зоне боковых желудочков и дальнейшей миграции нейробластов в направлении ишемического очага. Большинство DCX+ клеток было обнаружено в зоне ремиелинизации, то есть зоне гиперинтенсивности на МПФ картах, что свидетельствует о восстановительных процессах, происходящих на периферии ишемического очага. Количество DCX+ клеток в зоне ремиелинизации увеличивалось со временем и значимо превышало количество предшественников нейронов как в контроле, так и в зоне демиелинизации. Анализ микрофотографий срезов мозга, полученных на 10-й, 30-й, 60-й дни после операции, выявил существенное увеличение количества предшественников олигодендроцитов в очаге ишемии по сравнению с контралатеральным полушарием. Прослеживается закономерность, что в ипсилатеральном полушарии происходит большее количество делений ядер олигодендроцитов, чем в контралатеральном полушарии, что свидетельствует об их участии в восстановительных процессах. Структуру формирующихся нейроглиальных комплексов и пучков аксонов в ишемическом очаге исследовали на толстых срезах 50 мкм. Проводили ряд двойных иммуноокрашиваний в сочетании маркеров к молодым нейронам (DCX) и астроглии (GFAP), аксонам (NF_H) и миелина (MBP), микроглии (Iba-1) и миелина (MBP). К сожалению, из-за санкций приобрести антитела CD31, маркер эндотелия сосудов, не удалось, поэтому для исследования взаимодействия астроглии с сосудами использовали окрашивание фаллоидином, коньюгированным с FITC для окрашивания F-актина, в сочетании с GFAP. Восстановление отростков нейронов в ишемическом очаге существенно зависело от степени поражения головного мозга. У животных с обширным ишемическим очагом восстановление отростков нейронов было незначительным. Это может свидетельствовать о том, что восстановление только начинается, либо ишемия привела к потере миелиновых оболочек, а тела аксонов находятся за пределами очага. У животных с небольшим по площади ишемическим поражением аксоны нейронов через 30 дней после ишемии не имели миелиновых оболочек и присутствовали в ишемическом очаге в виде отдельных волокон или были собраны в пучки. По периферии очага у многих животных на этом сроке наблюдения еще сохраняется глиальный рубец, однако для некоторых астроцитов наблюдалось взаимодействие в тонкими прорастающими сосудами, несмотря на продолжающееся нейровоспаление. Оценку содержания миелина на картах МРТ и микроскопических гистологических изображениях срезов, окрашенных ЛФБ, проводили с использованием программы ImageJ (National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA). Для точного соответствия МРТ карт и гистологических постмортальных изображений, на которых срезы искажены из-за пробоподготовки (растяжения, сжатия, разрезы), использовали разработанное в лаборатории программное обеспечение – плагин ROIT для ImageJ, позволяющий корректировать морфологические несоответствия между МРТ и гистологией. Этот метод сопоставления МРТ и гистологических срезов опубликован в статье в журнале Biomedicines (Q1), указана грантовая поддержка на данный проект. Для статистической обработки данных использовали показатель оптической плотности ЛФБ (LFB OD). Согласно большинству предшествующих исследований, в том числе опубликованных по проекту, LFB OD является наиболее точным показателем для гистологической оценки содержания миелина, в то же время картирование МПФ признано одной из наиболее точных неинвазивных оценок содержания миелина. Поэтому для оценки взаимосвязей между демиелинизацией, оцененной гистологически и с помощью МРТ, процентные изменения в LFB OD сравнивали с процентными изменениями МПФ и ADC в серии дисперсионных анализов с повторными измерениями. Взаимосвязь между томографическими и гистологическими переменными была оценена с помощью коэффициента корреляции Пирсона (R). На картах ADC на 1-3 сутки после операции наблюдается гипоиненсивность в очаге инсульта, на 10-е сутки – едва заметная гиперинтенсивность, которая была четко различима не у всех животных, а на 30-е и 60-е сутки – более заметная интенсивность, сходная с локализацией очага на Т2-взвешенных изображениях. На картах МПФ отмечается другая динамика. Наиболее обширная область демиелинизации наблюдается на 1-3 сутки после ишемии, далее эта область уменьшается в размере и в целом соответствует локализации очага на Т2-взвешенных изображениях и карах ADC. На 30-60 сутки на картах МПФ в области, прилегающей к очагу, согласно Т2-взвешенным изображениям, наблюдается зона гиперинтенсивности относительно исходного уровня и контралатерального полушария. Это соответствует полученным ранее результатам на меньшей выборке животных, другой линии, с другими временными точками и с помощью другого томографа. Для МПФ в зоне демиелинизации показана высокозначимая корреляция с LFB OD (r=0.83, p<0.001), как и в ранее проведенном на этой же модели исследовании для более ранних временных точек. Еще более высокая корреляция с гистологическими данными получена для зоны ремелинизации (r=0.92, p<0.001). Эта корреляция получена нами впервые. Этот результат является основанием для дальнейшего использования МПФ в клинике для диагностики восстановления миелина после инсульта и еще раз гистологически валидирует метод МПФ в отношении количественной оценки миелина.