Аннотация результатов, полученных в 2021 году
Состояние функциональной разгрузки скелетных мышц наблюдается при иммобилизации в травматологии, у больных, находящихся на длительном постельном режиме, при спинальных травмах и опорно-двигательных нарушениях, а также в условиях космического полёта. Данное состояние приводит, помимо прочих эффектов, к повышению утомляемости мышц (мышечной слабости). Молекулярные основы повышения утомляемости мышц при функциональной разгрузке мало изучены. Целью данного проекта является выявление причин повышения утомляемости постуральных (ответственных за поддержание позы и мышечного тонуса) мышц в условиях функциональной разгрузки и определение роли корегуляции миозиновых генов и митохондриального биогенеза в этом процессе. Для достижения этой цели в первый год реализации проекта мы проверили гипотезу о роли инактивации ключевого метаболического сенсора скелетной мышцы АМФ-зависимой протеинкиназы (АМПК) после 1 суток функциональной разгрузки (вывешивания) задних конечностей крыс в снижении экспрессии PGC1 альфа, а также выявили роль инактивации АМПК в развитии повышенной утомляемости камбаловидных мышц после 7 суток вывешивания, и описали ряд связанных с повышением утомляемости сигнальных процессов. Для достижения этой цели экспериментальным животным на фоне 1-суточного (с 6-дневным предварительным введением) или 7-суточного вывешивания вводили конкурентный ингибитор креатинкиназы бета-гуанидинпропионовую кислоту: это вещество является непрямым активатором АМПК за счёт своего влияния на увеличение соотношения содержания АМФ к АТФ в скелетной мышце. По результатам эксперимента с 1-суточным вывешиванием на фоне введения бета-гуанидинпропионовой кислоты мы можем заключить, что снижение уровней экспрессии мРНК регуляторов биогенеза митохондрий PGC1alpha и TFAM происходит уже в течение первых суток вывешивания, как и снижение уровня экспрессии регулятора слияния (fusion) митохондрий митофузина-1. Однако данные изменения на этом сроке ещё не отражаются на содержании митохондриальной ДНК в мышце и экспрессии мРНК ряда компонентов дыхательной цепи митохондрий. Предотвращение инактивации АМПК за счёт предотвращения снижения соотношения АМФ/АТФ приводит к предотвращению снижения уровня экспрессии мРНК PGC1alpha и TFAM. По результатам эксперимента с 7-суточным вывешиванием крыс на фоне введения бета-гуанидинпропионовой кислоты можно сделать вывод, что предотвращение снижения соотношения АМФ/АТФ на фоне функциональной разгрузки камбаловидных мышц ведет к активации АМПК и к реализации «медленного», окислительного и устойчивого к утомлению фенотипа волокон камбаловидных мышц, а также активирует сигнальные пути, корегулирующие биогенез митохондрий и экспрессию «медленной» изоформы ТЦМ (такие как экспрессия MOTS-C и микро-РНК-499, подавление экспрессии FNIP). При этом предотвращение снижения соотношения АМФ/АТФ на фоне функциональной разгрузки камбаловидных мышц ведет и к предотвращению инактивации некоторых анаболических сигнальных путей, связанных с экспрессией рибосомальных генов, однако не предотвращает атрофию волокон, вызываемую функциональной разгрузкой. Таким образом, по итогам первого года выполнения Проекта мы впервые показали, что снижение соотношения АМФ/АТФ является триггером снижения экспрессии PGC1alpha и TFAM уже на раннем сроке функциональной разгрузки. При увеличении продолжительности функциональной разгрузки до 7 суток сниженное соотношение АМФ/АТФ приводит к инактивации сигнальных путей, корегулирующих экспрессию медленной изоформы ТЦМ и биогенез митохондрий (включая АМПК), что ведет к снижению содержания митохондриальных белков и ДНК, снижению доли скелетных волокон «медленного» типа и к развитию повышенной утомляемости скелетных мышц. При введении бета-гуанидинпропионовой кислоты все эти эффекты предотвращаются. Более того, мы впервые показали, что функциональная разгрузка скелетных мышц приводит к снижению экспрессии митокина MOTS-C, который, по результатам недавних исследований, является регулятором чувствительности к инсулину и мышечной выносливости на системном уровне – и это снижение также предотвращается введением бета-гуанидинпропионовой кислоты. Соответственно, по итогам первого года выполнения Проекта мы выявили роль снижения соотношения АМФ/АТФ и инактивации АМПК на ранних сроках функциональной разгрузки в повышении утомляемости скелетных мышц при функциональной разгрузке и описали ряд сигнальных механизмов, за счёт которых эта роль реализуется.

Аннотация результатов, полученных в 2022 году
Состояние функциональной разгрузки скелетных мышц наблюдается при иммобилизации в травматологии, у больных, находящихся в условиях длительного постельного режима, при спинальных травмах и опорно-двигательных нарушениях, а также в условиях космического полёта. Данное состояние приводит, помимо прочих эффектов, к повышению утомляемости мышц (мышечной слабости). Молекулярные основы повышения утомляемости мышц при функциональной разгрузке мало изучены. Целью данного проекта является выявление причин повышения утомляемости постуральных (ответственных за поддержание позы и мышечного тонуса) мышц в условиях функциональной разгрузки и определение роли корегуляции миозиновых генов и митохондриального биогенеза в этом процессе. Для достижения этой цели на второй год реализации Проекта были поставлены следующие задачи: выявление роли снижения содержания митокина MOTS-C в развитии повышенной утомляемости камбаловидной мышцы на фоне функциональной разгрузки; проверка гипотезы о накоплении миоплазматического кальция как причины роста утомляемости камбаловидной мышцы на фоне функциональной разгрузки. В рамках первого эксперимента 24 самца крыс линии Вистар, возрастом 1,5 месяца и весом 180-200 г были разделены на 3 экспериментальные группы – виварный контроль (С, n=8), 7-суточное вывешивание с ежедневным внутрибрюшинным введением плацебо (физраствор) (7HS, n=8), и 7-суточное вывешивание с ежедневными внутрибрюшинными инъекциями MOTS-C в дозировке 40 мг/кг веса животного (7HSM, n=8) (в физрастворе). Ранее было показано, что митокин MOTS-C экспрессируется в митохондриях в ответ на физические упражнения и приводит к активации ряда молекулярных регуляторов, таких как АМФ-активируемая протеинкиназа (AMPK) и ключевой регулятор биогенеза митохондрий PGC1, что способствует повышению мышечной выносливости (Lee, Zeng et al. 2015, Reynolds, Lai et al. 2021, Yang, Yu et al. 2021). В первый год выполнения Проекта мы обнаружили снижение содержания мРНК-предшественника митокина MOTS-C в миоплазме камбаловидных мышц животных при функциональной разгрузке. При проведении эксперимента с введением MOTS-C мы предположили, что введение данного препарата предотвратит вызываемое функциональной разгрузкой скелетных мышц снижение содержания MOTS-C в миоплазме камбаловидных мышц, а также предотвратит инактивацию ряда параметров биогенеза митохондрий, изменение паттерна экспрессии миозиновых генов и рост утомляемости мышц. В рамках второго эксперимента 24 самца крыс линии Вистар того же веса и возраста были разделены на следующие экспериментальные группы: группа виварного контроля (С), группа, подвергнутая разгрузке задних конечностей на протяжении 7 суток с ежедневным внутрибрюшинным введением плацебо (2% DMSO в физрастворе) (7HS) и группа, подвергнутая 7-суточной разгрузке задних конечностей с ежедневным внутрибрюшинным введением нифедипина (7 мг/кг веса, в 2% DMSO в физрастворе 7HSN). Нифедипин – блокатор кальциевых каналов L-типа. Известно, что уже на ранних сроках функциональной разгрузки в камбаловидной мышце происходит избыточное накопление кальция (Ingalls et al., 2001). Данный процесс в волокнах камбаловидных мышц может приводить к накоплению активных форм кислорода и нарушению функций митохондрий (Powers et al., 2012), что, в свою очередь может негативно отразиться на устойчивости мышц к утомлению. В исследовании использовалась общепринятая модель антиортостатического вывешивания, позволяющая имитировать эффекты гипогравитации (Morey-Holton and Globus 2002). После проведения эксперимента у каждого животного под бромэтанольным наркозом из обеих ног были выделены камбаловидные мышцы, после чего одна из мышц подвергалась анализу утомляемости ex vivo, а вторая замораживалась в жидком азоте, а крыс эвтаназировали методом цервикальной дислокации под бромэтанольным наркозом. С помощью ex vivo теста на утомляемость определяли индекс утомления камбаловидных мышц; из замороженной ткани выделяли тотальную белковую фракцию, ДНК, мРНК а также микро-РНК, после чего проводили обратную транскрипцию РНК и микро-РНК и анализировали уровень экспрессии генов и содержание митохондриальной ДНК методом ПЦР-анализа в реальном времени. Содержание белков и фосфорилирование ряда ключевых молекулярных регуляторов, таких как кальций-кальмодулин киназа II и АМФ-активируемая протеинкиназа, определяли методом электрофореза в полиакриламидном геле с последующим Вестерн блотом. По итогам первого эксперимента мы обнаружили, что введение MOTS-С экспериментальным животным успешно предотвращает снижение содержания MOTS-C в миоплазме камбаловидных мышц, хотя и не влияет на экспрессию мРНК предшественника MOTS-C. Также введение MOTS-C предотвращает рост утомляемости камбаловидных мышц на фоне функциональной разгрузки, трансформацию мышечных волокон в «быструю» сторону, атрофию мышечных волокон «медленного» типа и снижение содержания митохондриальной ДНК. На основании данных полученных в результате проведения эксперимента с введением MOTS-C на фоне функциональной разгрузки можно сделать вывод, что снижение содержания MOTS-C при функциональной разгрузке вносит вклад в снижение устойчивости мышц к утомлению за счет инактивации АМПК и снижения экспрессии молекулярных регуляторов, осуществляющих корегуляцию миозиновых и митохондриальных генов, необходимых для поддержания окислительного, «медленного» устойчивого к утомлению фенотипа мышечных волокон. По итогам проведения второго эксперимента мы обнаружили что введение нифедипина предотвращает кальций-зависимый рост уровня фосфорилирования кальций-кальмодулин киназы II, из чего следует что нифедипин по-видимому редотвращает рост содержания ионов кальция в миоплазме камбаловидных мышц на фоне функциональной разгрузки. Введение нифедипина экспериментальным животным на фоне функциональной разгрузки мышц задних конечностей также предотвратило рост утомляемости камбаловидных мышц на фоне вывешивания и способствовало предотвращению снижения содержания митохондриальной ДНК, содержания митокина MOTS-C и ряда митохондриальных белков, но, тем не менее, не повлияло на паттерн экспрессии миозиновых генов, что, вероятно, связано с тем что накопление ионов кальция играет компенсаторную роль в экспрессии «медленной» изоформы тяжелых цепей миозина в условиях функциональной разгрузки мышц.