Аннотация результатов, полученных в 2021 году
Проект направлен на выявление новых, ранее не описанных нейропротекторных свойств отдельных представителей нейронального кинома при моделировании ишемического повреждения головного мозга. Нарушение мозгового кровообращения по-прежнему остается одной из основных причин смерти и инвалидизации населения во всем мире. Несмотря на огромное разнообразие факторов, опосредующих нарушение поступления питательных веществ и кислорода к клеткам головного мозга, механизмы развития ишемического повреждения схожи. Являясь самым энергозатратным органом человеческого тела, головной мозг поглощает до 20% всей энергии и до 25% кислорода, получаемых организмом. Даже краткосрочное нарушение мозгового кровотока может иметь необратимые последствия и вызывать серьезные когнитивные нарушения. Однако известны сложные комплексы внутриклеточных сигнальных механизмов, направленных на защиту клеток головного мозга от воздействия повреждающих факторов различного генеза, в том числе ишемии. Генетическая гетерогенность человеческой популяции обуславливает разную устойчивость людей к ишемическому повреждению. Именно с этим связан неугасающий интерес исследователей и клиницистов во всем мире к проблеме защиты клеток головного мозга от ишемических повреждений. В ходе реализации проекта 2018-2020 г.г. нами был проведен скрининг более 100 киназ головного мозга, как факторов, обладающих выраженными нейпропротективными свойствами. Выбрана группа наиболее перспективных киназ, имеющих определенный терапевтический потенциал. На первом этапе выполнения проекта 2021-2023 г.г. мы сосредоточили свои исследования на трех особо выдающихся представителях (Ikkb, Jak2, Flt4), обладающих значимым влиянием не только на жизнеспособность клеток головного мозга, но и на нейросетсевую активность. Для выявления селективных молекулярных механизмов адаптации нейрон-глиальных сетей головного мозга при изменении киназо-зависимых каскадов, нам пришлось перейти от селективной фармакологической блокады ферментов к молекулярно-генетическим методам регуляции экспрессии соответствующих генов. Проведен подбор молекулярно-генетических систем активации и нокаута генов киназ-мишеней и проведен функциональный скрининг воздействия модуляции экспрессии киназ-мишеней в нормальных условиях и условиях моделирования гипоксического повреждения. Показано влияние изменения экспрессии генов целевых киназ не только на жизнеспособность клеток головного мозга, но и на функциональную реорганизацию нейрон-глиальных сетей, как в норме, так и при патологии. Особый интерес вызывают данные, связанные с увеличением кальциевой активности, на фоне уменьшения скоррелированности клеточной сигнализации. Такая активация может рассматриваться как сложный компенсаторный механизм разбалансировки нейрон-астроцитарных взаимодействий и однозначно требует дополнительного исследования, так как связано с раскрытием новых молекулярных механизмов, опосредованных работой отдельных ферментов (Ikkb, Flt4). Важно отметить, что применение оригинальных математических алгоритмов, разработанных участниками проекта, позволяет оценивать вклад клеток со сниженной или увеличенной активностью в общем системном ответе. Представленные результаты ярко демонстрируют выраженный нейропротективный эффект выбранных молекулярных мишеней (Ikkb, Flt4) и должны быть подтверждены в экспериментах in vivo на следующем этапе выполнения проекта. При этом предполагаемый ключевой механизм реализации антигипоксического действия киназ-мишеней не связан с изменением экспрессии гипоксией индуцированного фактора (HIF). Однако, блокада непосредственно HIF-пролилгидроксидазы значимо отражается на экспрессии Ikkb и Jak2. Так же вызывает интерес, что Flt4, которая обладает ярко выраженными нейропротективными свойствами при гипоксическом повреждении, не связана с системой гипоксией индуцированного фактора. По результатам выполнения первого этапа проекта 2021-2023 г.г. было опубликовано 3 экспериментальные статьи в изданиях, индексируемых базами данных WoS и/или Scopus, одна из которых в журнале первого квартиля (Q1). Результаты исследований также были представлены на международных и всероссийских конференциях. По результатам выполнения проекта подготовлена к защите кандидатская диссертация по теме «Роль нейронального кинома в адаптации ЦНС к воздействию факторов ишемии in vitro и in vivo», которая принята к рассмотрению в диссертационный совет 24.2.340.06 при ННГУ им. Н.И. Лобачевского.

Аннотация результатов, полученных в 2022 году
Настоящий проект посвящен анализу молекулярных механизмов действия отдельных представителей нейронального кинома, которые обеспечивают защиту и активируют адаптационные процессы в клетках нервной системы при повреждающем воздействии факторов ишемии. Ключевой научной задачей заключительного этапа проекта явилось исследование потенциальной взаимосвязи выявленных на предыдущих этапах работы киназ-мишеней с ключевой системой, регулирующей устойчивость клетки к действию гипоксии – системой транскрипционного фактора HIF-1. Фактор HIF-1 состоит из двух субъединиц, α и β. Β-субъединица присутствует в клетке конститутивно, а α-субъединица в условиях нормоксии подвергается расщеплению кислород-чувствительным ферментом HIF-пролилгидроксидазой (PHD). Мы исследовали влиянии блокады PHD, ведущей к стабилизации фактора HIF-1, на устойчивость лабораторных животных к гипоксическому повреждению и взаимосвязь данных эффектов с экспрессией целевых киназ. Нами показан выраженный нейропротекторный эффект применения ингибитора PHD Roxadustat при моделировании острой гипобарической гипоксии у мышей линии C57BL/6, проявляющийся в увеличении выживаемости животных и сохранении уровня их ориентировочно-двигательной активности. Исследование молекулярных механизмов защитного действия ингибирования HIF-пролилгидроксидазы с помощью ПЦР в реальном времени продемонстрировало, что стабилизация HIF-1 приводит к индукции экспрессии мРНК киназы IKKb, нейротрофического фактора BDNF и его рецептора TrkB, рецептора глиального нейротрофического фактора GFRa, коннексина 43 и антиапоптотического фактора Bcl2 в тканях коры больших полушарий и гиппокампа. Также важно отметить, что применение Roxadustat вызывало снижение экспрессии киназы Flt4. Далее была выполнена морфологическая оценка влияния ингибирования киназы Flt4 на развитие головного мозга мышей линии C57BL/6. Была проведена серия экспериментов по инактивации киназы Flt4 с использованием CRISPR/Cas9 технологии и внутриутробной (in utero) электропорации. Метод внутриутробной электропорации является передовым высокоэффективным способом доставки плазмидных векторов в мозг мыши, что позволяет оценить влияние модуляции экспрессии целевого гена на формирование тканей головного мозга. Нами показано, что ингибирование экспрессии Flt4 на Е15.5 не вызывает нарушений онтогенеза коры головного мозга (формирования слоев, морфологии нейронов и хода нейрональной миграции) и потенциально может использоваться для повышения устойчивости организма животных к гипоксически-ишемическому повреждению. Также дополнительно выполнен анализ эффектов, оказываемых ингибированием PHD на биоэлектрическую активность и функциональную реорганизацию нейронных сетей первичных культур клеток гиппокампа мыши, культивируемые на мультиэлектродных матрицах MEA60 (Multichannel systems, Германия), при моделировании гипоксии. Применение оригинального оксихинолинового ингибитора HIF-пролилгидроксилазы Inh30 в условиях гипоксического повреждения несмотря на значимое угнетение комплексных сетевых пачечных событий и появление разрозненных единичных спайков, способствует поддержанию в профиле спонтанной биоэлектрической активности количества сетевых пачек, число спайков в которых в среднем составляет 100-300 с сохранением активных центров сети, отвечающих за генерацию сетевой пачки импульсов. Через 24 часа анализируемые параметры возвращались к исходному уровню активности и не отличались от значений интактной группы. В заключении для выявления молекулярных механизмов реализации нейропротективного действия ингибитора HIF-пролилдегидрогеназы проведен анализ транскриптомов отдельных клеток первичной диссоциированной культуры гиппокампа (Single-cell анализ). Для ручного типирования клеток рассматривалась экспрессия известных маркеров популяций нервных клеток в сравнении с другими кластерами с последующей проверкой по базам данных, находящихся в открытом доступе. Для проверки ручного типирования клеток дополнительно применен метод Label transfer с помощью пакета Symphony на основе референсного набора данных клеток гиппокампа мыши Allen Brain Atlas. Идентификация клеточных субпопуляций позволила выявить наличие и соотношение различных типов нейронов в первичных культурах клеток гиппокампа. Показано, что субпопуляция глутаматергических нейронов практически полностью элиминируется в постгипоксическом периоде. В сохранившихся глутаматергических нейронах через сутки после моделирования гипоксии наблюдается изменение экспрессии генов, кодирующих различные подтипы метаботропных глутаматных рецепторов (повышается экспрессия GluR2 и СluR6, снижается GluR5). Кроме того, выявлено увеличение экспрессии транскрипционных факторов NfkB и Bcl2, что вероятнее всего связано, с процессами гомеостатической регуляции и торможения апоптоза. Применение ингибитора HIF-пролилгидроксилазы во время моделирования гипоксии вызывает увеличение экспрессии NfkB и Bcl2 и позволяет сохранить спектр экспрессии подтипов метаботропных рецепторов глутамата неизменным. Показано, что моделирование гипоксии вызывает приводит к увеличению экспрессии белка системы комплемента C4b и интерлейкина 33 (IL33) в олигодендроцитах, что говорит об активации воспалительных реакций. Изменения в астроцитах касаются белков цитоскелета метаболических гены, которые указывают на переход астроцитов в реактивное состояние. Использование ингибитора HIF-пролилгидроксилазы полностью нивелирует изменения в тормозных нейронах и эпендимальных клетках. Также показано, что ингибитор HIF пролилгидроксилазы изменяет паттерны скоррелированности экспрессии генов воспалительного ответа и меняет профиль воспалительной реакции астроцитов и олигодедроцитов. Таким образом, все поставленные в плане-графике задачи проекта выполнены в полном объеме. Проведено комплексное исследование молекулярных механизмов, связывающих исследуемые киназы с системой фактора HIF-1 и выявлены новые молекулярные механизмы нейропротекторного эффекта стабилизации HIF-1 в различных популяциях нервных клеток. Результаты проведенных исследований на заключительном этапе опубликованы в 10 публикациях, в том числе в 5 статьях в рецензируемых журналах, входящих в базы цитирования WoS, одна за которых входят в категорию Q1. За весь период выполнения проекта (2021-2023 гг.) опубликовано 15 работ, из них 8 статей, индексируемых в базах WoS/Scopus, из них 2 в журналах категории Q1.