Аннотация результатов, полученных в 2021 году
Исследование было выполнено на коммерческих культурах первичных эндотелиальных клеток коронарной (Human Coronary Artery Endothelial Cells, HCAEC) и внутренней грудной (Human Internal Thoracic Endothelial Cells, HITAEC) артерий человека различающиеся по частоте встречаемости атеросклеротического поражения, в течение 6 часов экспонированных 500 нг/мл алкилирующего мутагена митомицина С (ММС), вызывающего образование поперечных сшивок молекулы ДНК и выраженный генотоксический стресс в клеточных культурах. Ранее было показано, что ММС является триггером эндотелиальной дисфункции в эксперименте in vitro, однако молекулярные механизмы данного процесса на настоящий момент не изучены. Проведенные в рамках первого года выполнения проекта исследования показали отсутствие превышения уровня маркеров оксидативного стресса (ROS, NO2-, NO3-, NO2-/NO3- и 8-OHdG) в культурах HCAEC и HITAEC, экспонированных ММС, по сравнению с контрольной группой, с одновременным снижением относительной длины теломер и компенсаторным повышением экспрессии гена POT1 (кодирующего белок, выполняющий функцию защиты теломер от повреждения) в экспериментальных клетках HCAEC. Данные результаты позволили предположить, что формирование эндотелиальной дисфункции, ассоциированной с экспозицией клеток ММС, обусловлено, главным образом, генотоксическим, а не оксидативным стрессом, вызванным ММС. Результаты полнотранскриптомного секвенирования (RNA-seq) показывают, что ММС-индуцированный генотоксический стресс на генном уровне вызывает патологическую активацию первичных артериальных эндотелиальных клеток человека, при этом данный молекулярный ответ в культурах HCAEC и HITAEC носит дифференциальный характер – так, экспозиция ММС клеток HITAEC приводит к изменению экспрессии только четырех генов (против 108 генов в клетках HCAEC), что, наряду с гемодинамическими и физиологическими особенностями коронарной артерии, обуславливает ее меньшую подверженность атерогенезу за счет меньшей вероятности развития дисфункции эндотелия в ответ на генотоксический стресс. При этом ММС-индуцированная эндотелиальная дисфункция в клетках HCAEC связана главным образом с нарушением таких молекулярных механизмов, как сигнальные пути, контролирующие ангиогенез, формирование клеточного ответа на внешние стимулы и апоптоз, обусловлена, главным образом, гиперэкспрессией генов, контролирующих данные процессы. Кроме этого, одним из потенциальных молекулярных механизмов, лежащих в основе формирования эндотелиальной дисфункции в ответ на мутагенную нагрузку в эксперименте in vitro может являться усиление экспрессии гена DNMT3B. Также, в результате оценки протеомного профиля экспериментальных и контрольных клеточных культур HCAEC и HITAEC, показано, что генотоксический стресс, вызванный мутагеном алкилирующего механизма действия ММС, приводит к развитию неспецифического воспалительного ответа, что выражается в повышении секреции эндотелиальными клетками провоспалительных молекул IL-8, MCP-1, IP-10, MIF, PDGFB и TIMP-2. Таким образом, по результатам экспериментов первого отчетного года (2021-2022) можно сделать вывод о том, что генотоксический стресс, вызванный мутагеном алкилирующего механизма действия ММС, в эндотелиальных клетках коронарной артерии вызывает нарушение таких молекулярных механизмов, как сигнальные пути, контролирующие ангиогенез, формирование клеточного ответа на внешние стимулы и апоптоз, а также приводит к выраженному неспецифическом воспалительному ответу как в клетках коронарной, так и внутренней грудной артерий. Результаты исследования представлены в ведущем российском научном журнале Молекулярная биология (Scopus, Q4, импакт-фактор 1,315), опубликованном в мае 2022 года, а также находятся в очереди на публикацию (ориентировочных выход в печать в июне 2022 года) в Сибирском журнале клинической и экспериментальной медицины (в начале 2022 года данный журнал был включен в базу данных Scopus). Результаты также были представлены в форме заочного участия на VIII Международной научной конференции молодых ученых: биофизиков, биотехнологов, молекулярных биологов и вирусологов «OpenBIO», Кольцово, Россия, 5-8 октября 2021 года, а также в виде устного доклада на Всероссийской конференции с международным участием «Фундаментальные аспекты атеросклероза: научные исследования для совершенствования технологий персонализированной медицины», Новосибирск, Россия, 15 октября 2021 года. С 11 по 14 июня 2022 года также планируется выступление с постерным докладом на зарубежном конгрессе 55th European Human Genetics Conference 2022 (Вена, Австрия) – получено приглашение для участия от организаторов.

Аннотация результатов, полученных в 2022 году
Исследование было выполнено на коммерческих культурах первичных эндотелиальных клеток коронарной (HCAEC) и внутренней грудной (HITAEC) артерий человека. Данные клеточные линии были выбраны в связи с их различной поражаемостью атеросклерозом: так, коронарная артерия является атерочувствительной и наиболее часто поражается атеросклерозом, в том время как внутренняя грудная артерия практически не подвержена атеросклерозу и рассматривается как атерорезистентная. Было сформировано две экспериментальные группы. В первую группы были включены клетки, в течение 6 часов культивируемые в присутствии 500 нг/мл алкилирующего мутагена митомицина С (ММС) и 5 мкМ аторвастатина - одного из наиболее часто используемых в терапии атеросклероза ингибитора ГМГ‐КоА‐редуктазы, для которого показан широкий спектр различных плейотропных эффектов (группа ММС+Atv) с последующими сутками инкубирования в чистой культуральной среде. Данная группа была использована для оценки способности аторвастатина предотвращать повреждение ДНК в эндотелиальных клетках, вызванное генотоксическим стрессом, индуцированным ММС. Во вторую группу (MMC/Atv) были включены клетки, в течении 6 часов культивируемые в присутствии 500 нг/мл ММС с последующими сутками инкубирования с 5 мкМ аторвастатина. Данная группа была использована для оценки способности аторвастатина запускать репарацию повреждений ДНК в эндотелиальных клетках, вызванных генотоксическим стрессом, индуцированным ММС. В качестве отрицательного контроля использовали клетки HCAEC и HITAEC, культивируемые в отсутствии генотоксической нагрузки, а в качестве положительного контроля - клетки HCAEC и HITAEC, в течение 6 часов культивируемые в присутствии ММС с последующими сутками инкубации в чистой культуральной среде. Установлено, что аторвастатин не оказывает влияние на уровень оксидативного и нитрозивного стресса в клеточных культурах эндотелиальных клеток, культивируемых в условиях ММС-индуцированного генотоксического стресса, но при этом способен модулировать репарацию повреждений ДНК в эндотелиальных клетках, вызванных мутагенном алкилирующего механизма действия, причем его эффекты зависят как от схемы культивирования, так и от типа эндотелиальных клеток. Антимутагенные эффекты аторвастатина в условиях выраженного генотоксического стресса проявляются, главным образом, не за счет его протективных свойств, а посредством усиления репарации ММС-индуцированных повреждений ДНК и активации сигнальных путей, вовлеченных в формирование молекулярного ответа на генотоксический стресс. Эндотелиальные клетки различных артерий характеризуются дифференциальной чувствительностью к действию аторвастатина. Так, клетки внутренней грудной артерии, являясь менее чувствительными к ММС-индуцированному генотоксическому стрессу, одновременно более восприимчивы к антимутагенному действию аторвастатина.

Аннотация результатов, полученных в 2023 году
Исследование было выполнено на коммерческих культурах первичных эндотелиальных клеток коронарной (HCAEC) и внутренней грудной (HITAEC) артерий человека. Данные клеточные линии были выбраны в связи с их различной поражаемостью атеросклерозом: так, коронарная артерия является атерочувствительной и наиболее часто поражается атеросклерозом, в том время как внутренняя грудная артерия практически не подвержена атеросклерозу и рассматривается как атерорезистентная. Для валидации результатов экспериментов in vitro в исследовании были использованы два вида лабораторных животных - нормолипидемические крысы линии Wistar и гиперлипидемические Apoe-нокаутные мыши. Было выполнено протеомное профилирование клеток HCAEC и HITAEC из четырех групп: (а) клетки, культивируемые в отсутствии генотоксической нагрузки; (b) клетки, в течение 6 часов культивируемые в присутствии 500 нг/мл алкилирующего мутагена митомицина С (ММС) с последующими сутками инкубации в чистой культуральной среде; (с) клетки, в течение 6 часов культивируемые в присутствии 500 нг/мл ММС и 5 мкМ аторвастатина с последующими сутками инкубации в чистой культуральной среде и (d) клетки, в течение 6 часов культивируемые в присутствии 500 нг/мл ММС с последующими сутками инкубации в присутствии 5 мкМ аторвастатина. В результате проведенного протеомного профилирования были выявлены ключевые белки и сигнальные пути, вовлеченные в формирование ММС-индуцированной эндотелиальной дисфункции, и протективного эффекта аторвастатина. Установлено, что у крыс линии Wistar, получавших инъекции ММС в хвостовую вену три раза в неделю на протяжении месяца (экспериментальная группа) развивается выраженный генотоксический стресс, о чем свидетельствует более чем трехкратное повышение частоты полихроматофильных эритроцитов (ПХЭ) с микроядрами и снижение доли ПХЭ в общем пуле проанализированных эритроцитов. Анализ профиля генной экспрессии показал, что у крыс, включенных в экспериментальную группу, наблюдается провоспалительная активация эндотелия, сопровождающаяся повышенной экспрессией генов Vcam1, Icam1, Selp, Il6, Ccl2 и Cxcl1, а также нарушение эндотелиальной механотрансдукции, характеризуемое снижением экспрессии генов Klf2 и Klf4. Таким образом, ММС-индуцированный генотоксический стресс у нормолипидемических крыс линии Wistar ассоциирован с нарушением двух ключевых звеньев патогенеза эндотелиальной дисфункции и может рассматриваться в качестве одного из ее триггеров. Также показано, что генотоксический стресс способствует развитию атеросклеротического поражения сосудов у гиперлипидемических Apoe-нокаутных мышей, что позволяет рассматривать его не только в качестве триггеров эндотелиальной дисфункции, но и в качестве фактора риска развития атеросклероза.