Аннотация результатов, полученных в 2021 году
1. В клеточной линии HEK293 наработаны аденовирусные конструкции, содержащие гены BMP-2 и GFP. Подобрана оптимальная вирусная нагрузка клеток HEK293, которая составила 100 TCID50/мл вирусной суспензии. 2. Подобраны условия для эффективной трансдукции клеточных культур ММСК ЖТ аденовирусными конструкциями с геном зеленого флуоресцентного белка (GFP). Показано, что инкубация ММСК ЖТ крыс с аденовирусными суспензиями в выбранных концентрациях (80, 160 и 320 TCID50/мл) не приводит к гибели клеток в течение всех используемых сроков инкубации (6, 16 и 24 ч). Условия аденовирусной трансдукции влияют на процент трансдуцированных клеток. Наиболее эффективная вирусная трансдукция наблюдается при инкубации клеток ММСК ЖТ крыс 320 TCID50/мл в течение 16 ч. - 90,8% клеток через 3 суток. 3. Выбран наиболее перспективный НПВС, не препятствующий проникновению аденовирусов в клетки и не оказывающий цитотоксического действия. Исследовано влияние Ibu в различных концентрациях (1 мг/мл, 0,5 мг/мл, 0,25 мг/мл и 0,125 мг/мл) на жизнеспособность клеток ММСК ЖТ крыс и на эффективность аденовирусной трансдукции с геном GFP. Показано, что Ibu вызывает дозозависимое цитотоксическое действие на клетки ММСК ЖТ крыс. Ibu в концентрации 0,125 мг/мл практически не оказывает цитотоксическое воздействие на клетки. При использовании 0,125 мг/мл Ibu наблюдалась наиболее эффективная трансдукция клеток. При этом данный показатель через 3 суток был выше, чем при инкубации только с 320 TCID50/мл Ad-GFP. Таким образом, 0,125 мг/мл Ibu является наиболее эффективной концентрацией, не вызывающей цитотоксического действия на клетки ММСК ЖТ крыс и не препятствующей аденовирусной трансдукции. Для выбора наиболее перспективных НПВС для применения с аденовирусными конструкциями проведено сравнительное исследование влияния ибупрофена (Ibu), диклофенака (Dic) и кетопрофена (Ket) на жизнеспособность ММСК ЖТ и эффективность аденовирусной трансдукции Ad-GFP. Определены концентрации НПВС, не оказывающие существенного цитотоксического действия на клетки ММСК ЖТ крыс. Для Dic выбрана концентрация 0,05мМ, а для Ket 1мМ. Такие концентрации по цитотоксичности сопоставимы с 0,125мг/мл Ibu. Инкубация клеток с Ad GFP в присутствие НПВС приводила к аденовирусной трансдукции, однако эффективность была значительно ниже, чем в присутствие Ibu. Таким образом, Ibu является наиболее перспективным НПВС для использования при аденовирусной трансдукции клеток ММСК ЖТ крыс. В результате этих исследований подобраны условия для трансдукции клеток ММСК ЖТ крыс: инкубация клеток с аденовирусными конструкциями с нагрузкой 320 TCID50/мл в течение 16 ч и 0,125 мг/мл Ibu в течение всего исследуемого периода. Подобранные условия были применены для трансдукции ММСК ЖТ аденовирусными векторами с геном BMP-2 (Ad-BMP2). Также была показана зависимость жизнеспособности клеток от концентрации Ibu. Ad-BMP2 + 0,125 мг/мл Ibu практически не оказывает цитотоксического действия на клетки ММСК ЖТ. Трансдукция клеток ММСК ЖТ крыс Ad-BMP2 приводит к существенному увеличению экспрессии гена BMP-2. Добавление 0,125 мг/мл Ibu не препятствует аденовирусной трансдукции, относительная экспрессия гена BMP-2. Трансдукция клеток ММСК ЖТ Ad-BMP2 приводит к увеличению продукции белка BMP-2. Добавление 0,125 мг/мл Ibu способствует еще большему увеличению продукции белка. 4. Изучена остеогенная дифференцировка ММСК ЖТ, трансдуцированных аденовирусными конструкциями с геном BMP-2. Оценку остеогенной дифференцировки ММСК ЖТ проводили через 14 суток после трансдукции клеток Ad-BMP2. Показано существенное увеличение экспрессии гена BMP-2 RunX2 и Opn и увеличение концентрации белка BMP-2 в среде. Кроме того, наблюдалось увеличение активности щелочной фосфатазы по сравнению с контролем. Окрашиванием ализариновым красным было обнаружено, что аденовирусная трансдукция с или без 0,125 мг/мл Ibu приводит к увеличению минерализованного ВКМ. Трансдукция ММСК ЖТ Ad-BMP2 приводит к остеогенной дифференцировке клеток. При этом в присутствии 0,125мг/мл Ibu экспрессия остеогенных маркеров, активность щелочной фосфатазы и продукция белка BMP-2 были даже выше, чем без него. 5. Исследованы адгезионные свойства компонентов матриксов, а именно коллагена 1 типа и полилактидных гранул (PLA-гранул). Показано, что компоненты матриксов обладают высокими адгезионными свойствами, клетки хорошо распластываются на поверхности материалов в высокой плотности, большая часть клеток живые – окрашенные Кальцеином АМ и практически не наблюдается мертвых клеток, окрашенных DAPI. При этом детальный анализ клеток на PLA-гранулах методом сканирующей электронной микроскопии (СЭМ) показал, что через 24 ч клетки хорошо адгезируются и распластываются на пористой поверхности PLA-гранул. Морфология клеток на PLA-гранулах такая же, как на культуральном пластике: наблюдаются широко распластанные клетки полигональной формы, а также клетки фибробластоподобной формы. Получены матриксы с разным соотношением PLA-гранул и коллагена 1:1 и 2:1. Было показано, что все компоненты матриксов не оказывают выраженного цитотоксического эффекта на клетки ММСК ЖТ. Также было показано, что полученные матриксы обладают хорошими адгезионными свойствами. При этом не было выявлено существенной разницы между адгезионными свойствами матриксов с разным соотношением коллагена и PLA-гранул. Однако, полученные матриксы не способны сохранять форму в течение через 7 суток. Поэтому были получены матриксы на основе PLA-гранул и коллагена с добавлением плазмы крови, обогащенной тромбоцитами (PRP). Данные матриксы оказались достаточно прочными и устойчивыми. Кроме того, добавление PRP способствует увеличению жизнеспособности клеток как отдельно, так и в составе матрикса. А также для улучшения свойств матрикса к коллагену был добавлен фибронектин. Полученный коллаген-фибронектиновый гидрогель показал высокую цитосовместимость in vitro и способность к поддержанию клеточной адгезии. 6. Исследованы физико-механические свойства полученных матриксов на основе коллагенового геля и полилактидных гранул. Показано, что добавление PLA-гранул приводит к увеличению модуля упругости композиций с коллагеновым гидрогелем с 80 кПа до 400-2700 кПа при заполнении частицами PLA с 12-20 мас.% и 1,8 мПа с 25 мас.%. Несмотря на увеличение значений модуля упругости, предельная деформация была снижена. Матриксы с добавлением в гелевую фазу PRP и фибронектина мало отличались по упругим свойствам от чистых гелей, что говорит, о доминирующем вкладе PLA частиц в упругие свойства композиции. Однако матриксы с добавлением PRP имели немного более высокие показатели упругости на всём протяжении изменения концентрации PLA частиц. Основываясь на механических данных и манипуляционных свойствах для дальнейших исследований была выбрана система с 12 мас.% частиц. При нагревании материалов происходило выраженное возрастание модулей упругости. Наибольший рост модуля упругости был замечен у образца с PRP, что, вероятно, было связано с изменением растворимости и увеличением ретенции и связи молекул коллагена с компонентами PRP. После обработки материалов парами аммиака за счёт изменения среды гелей с кислой на слабощелочную, происходило дальнейшее увеличение модулей упругости и в итоге не было выявлено выраженных различий между образцами.

Аннотация результатов, полученных в 2022 году
1. Показано, что лиофилизация аденовирусных частиц с геном GFP (Ad-GFP) с добавлением или без 0,5М сахарозы не влияет на эффективность аденовирусной трансдукции культур ММСК ЖТ. В состав матриксов могут быть включены как предвартельно лиофилизированные вирусные частицы, так и находящиеся в растворе, а добавление сахарозы не требуется. 2. Аденовирусные конструкции импрегнировали в пористые полилактидные гранулы (PLA-гранулы) или в коллагеновую основу (Col) и получали ген-активированные матриксы на основе PLA-гранул, коллагена 1 типа и фибрина, полученного из плазмы крови, обогащенной тромбоцитами (Platelet-Rich Plasma, PRP). Импрегнация аденовирусных частиц в пористые PLA-гранулы обеспечивает более длительное высвобождение векторов из матрикса по сравнению с импрегнацией в коллагеновую основу и способствует высвобождению целевых генов после периода послеоперационного воспаления, поэтому является предпочтительной. 3. Показано, что матриксы PLA/Col/PRP, импрегнированные различными концентрациями Ad-BMP2, не оказывают цитотоксического действия на ММСК ЖТ в течение 7 суток и обладают высокими адгезионными свойствами: ММСК ЖТ распластываются на поверхности матриксов уже через 1 сутки и имеют характерную морфологию, а через 7 суток наблюдается увеличение числа клеток. При этом не наблюдается отличий в цитосовместимости между матриксами, импрегнированными различными концентрациями аденовирусных векторов. 4. Ибупрофен (Ibu) был импрегнирован в пористые PLA-гранулы, которые затем смешивали с коллагеном, PRP и для полимеризации добавляли раствор тромбина в растворе хлорида кальция. Показано, что включение Ibu в PLA-гранулы обеспечивает высвобождение Ibu уже через 7 суток, а смешивание гранул с гидрогелем способствует более медленному выходу Ibu из матриксов PLA/Col/PRP на протяжении 4-х недель. Импрегнации Ibu в состав ген-активированных матриксов PLA/Col/PRP-Ad-GFP не влияет на кинетику высвобождения Ad-GFP в период до 7 суток, а затем наблюдается незначительное увеличение скорости высвобождения аденовирусных частиц из матриксов с Ibu. 5. Показана трансдуцирующая способность аденовирусных конструкций Ad-GFP, импрегнированных в матриксы PLA/PRP и PLA/Col/PRP с и без Ibu. В течение 7 суток наблюдаются единичные клетки, продуцирующие GFP при инкубации ММСК ЖТ в присутствии исследуемых ген-активированных матриксов. При этом число трансдуцированных клеток было выше при инкубации клеток с матриксами PLA/PRP-Ad-GFP, чем с матриксами PLA/Col/PRP-Ad-GFP. Наибольшее число трансдуцированных клеток наблюдается через 14 суток инкубации ММСК ЖТ в присутствие ген-активированных матриксов. Не было выявлено разницы в трансдуцирующей способности аденовирусных конструкций для матриксов PLA/Col/PRP-Ad-GFP в присутствие или без Ibu. Также показана трансдуцирующая способность Ad-BMP2, импрегнированных в матриксы PLA/PRP и PLA/Col/PRP с и без Ibu. Через 14 и 21 сутки инкубации ММСК ЖТ с исследуемыми матриксами наблюдается увеличение экспрессии гена и продукции белка BMP-2. При этом в клетках, культивируемых в присутствие матриксов PLA/Col/PRP-Ad-BMP2 c Ibu экспрессия целевого гена и продукция BMP-2 были выше, чем в присутствии матриксов PLA/Col/PRP-Ad-BMP2 без Ibu и матриксов PLA/PRP-Ad-BMP2. 6. Показано, что культивирование ММСК ЖТ в течение 21 суток с матриксами PLA/Col/PRP-Ad-BMP2 с и без Ibu способствует остеогенной дифференцировке клеток. Наблюдается существенное увеличение экспрессии генов и продукции белков щелочной фосфатазы и остеопонтина по сравнению с коммерческим материалом Spongostan Dental и неактивированными матриксами PLA/Col/PRP. А также инкубация ММСК ЖТ с матриксами PLA/Col/PRP-Ad-BMP2 с и без Ibu способствует увеличению активности щелочной фосфатазы и минерализации внеклеточного матрикса ММСК ЖТ. 7. Показано, что при включении ММСК ЖТ в матриксы Col/PLA/PRP, клетки сохраняют высокую жизнеспособность внутри матриксов на протяжении 3-х недель. При этом иммобилизация 1 млн клеток/мл обеспечивает лучшее сохранение жизнеспособных клеток по сравнению с иммобилизацией 10 млн клеток/мл. Методом СЭМ показано, что ММСК ЖТ равномерно распределяются в толще матриксов Col/PLA/PRP, при этом часть клекток была адгезирована на поверхности PLA-гранул, а часть клеток плотно прилегала к поверхности гидрогеля. ММСК ЖТ, предварительно трансдуцированные 320 TCID50/мл Ad-GFP, после включения в состав матриксов Col/PLA/PRP сохраняют высокую жизнеспособность и продуцируют GFP течение 14 суток. А ММСК ЖТ трансдуцированные 320 TCID50/мл Ad-BMP2 и включенные в состав матриксов Col/PLA/PRP с Ibu и без него через 14 суток способствуют остеогенной дифференцировке клеток, находящихся на подложке, что подтверждается существенным увеличением относительной экспрессии гена щелочной фосфатазы и продукции белка остеопонтина. 8. Через 14 суток после внутримышечной имплантации крысам матриксов Col/PLA/PRP, импрегнированных аденовирусными конструкциями с геном GFP или клетками, трансдуцированными данным вектором, в присутствие и без ибупрофена, во всех исследуемых образцах выявлены признаки хронического продуктивного воспаления. PLA-гранулы резорбируются гигантскими клетками инородных тел, в пространстве между гранулами наблюдается грануляционная ткань, содержащая полнокровные сосуды, фибробластоподобные и иммунные клетки. Ибупрофен не оказывает влияния на воспалительную реакцию. Также было показано, что имплантация исследуемых ген-активированных матриксов приводит к трансдукции резидентных клеток: при имплантации матриксов Col/PLA/PRP-Ad-GFP накопление GFP наиболее выраженно происходит внутри фибробластоподобных клеток, а при имплантации Col/PLA/PRP-MSC(Ad-GFP) накопление GFP наблюдается внутри макрофагов.