Аннотация результатов, полученных в 2021 году
Исследования последних лет показали, что эпигенетический механизм противоопухолевого действия химиотерапевтических препаратов не менее эффективен, чем общеизвестный генотоксический. Его широкое изучение и использование может сделать существующую химиотерапию более адресной и эффективной. Семь эпигенетически активных препаратов уже активно используются в клинической практике и более 30 соединений находятся в фазе клинических испытаний. Процесс создания, а также доклинические и клинические исследования нового препарата требуют больших финансовых затрат и занимают до 15 лет. В связи с этим, актуальным направлением в фармакологии в целом и в онкологии в частности является перепрофилирование препаратов, которые уже используются в медицинской практике или проходят клинические испытания, и их перепрофилирование. В рамках выполнения данного этапа проекта перед нами была поставлена задача детализировать механизмы эпигенетического действия противоопухолевых препаратов, выявленных с помощью тест-системы HeLa TI в 2018 году (в рамках проекта РНФ№18-75-00115). Были исследованы эффекты противоопухолевых препаратов (гемцитабин, цитарабин, оксалиплатин, доцетаксел, дексаметазон, бортезомиб, цетуксимаб, топотекан, энзастаурин и кураксин) на ключевые ферменты эпигенетической регуляции транскрипции: гистоновые ацетилтрансферазы (HATs), гистоновые деацетилазы (HDACs), гистоновые метилтрансферазы (HMTs), ДНК-метилтрансферазы (DNMTs), бромодомены (BETs). В ходе исследования было показано, что препарат оксалиплатин ингибирует гистоновые метилтрансферазы SUV420H1 и SUV420H2, при этом энзастаурин также вызывает небольшое снижение количества белка SUV420H2. Для цитарабина и дексаметазона была показана тенденция к снижению экспрессии SUV39H1. Препараты энзастаурин, дексаметазон, бортезомиб и цетуксимаб вызывали снижение количества гистоновой метилтрансферазы DOT1L. Изучение действия препаратов на гистоновые деацетилазы выявили ингибирующие способности энзастаурина в отношении фермента HDAC1. Также энзастаурин, наряду с бортезомибом, вызывал снижение мРНК генов ДНК-метилтрансфераз (DNMT3a и DNMT3b). В ходе исследования было показано, что кураксин и энзастаурин способны снижать уровень бромодоменов BRD3 и BRD2 соответственно, а дексаметазон – увеличивать уровень экспрессии BRD4 как на уровне белка, так и на уровне мРНК. Также был проведен анализ влияния препаратов на гистоновые модификации H3K79me3, H3K36me3, H3K9me2, H3K27me3. Было установлено, что вориностат и энзастаурин статистически значимо снижают уровень модификации H3K79me3, а доцетаксел и оксалиплатин, в свою очередь, снижают уровень диметилирования гистона 3 по лизину 9 (H3K9me2). На модификации Н3K36me3 и H3K27me3 исследуемые препараты влияния не оказывали. Анализ влияния противоопухолевых препаратов на экспрессию эпигенетически репрессированного гена GFP в линии клеток HeLa TI с нокдауном генов эпигенетических регуляторных ферментов продемонстрировал, что препараты кураксин, бортезомиб, оксалиплатин, доцетаксел, цитарабин и гемцитабин способны вызывать увеличение GFP-положительных клеток на фоне нокдауна генов HDAC1 и DNMT3a, что говорит об их влиянии на другие компоненты эпигенетической системы. В то же время для энзастаурина, дексаметазона, топотекана и цетуксимаба не было зарегистрировано различий по сравнению с клетками с нокдауном, что косвенно говорит о влиянии этих препаратов на HDAC1 и DNMT3a. В ходе дополнительного скрининга соединений на эпигенетическую активность была выявлена способность противоопухолевого препарата 5-фторурацила реактивировать эпигенетически репрессированный ген GFP в тест-системе HeLa TI. В рамках проекта также были получены приоритетные данные о влиянии вориностата на гистоновые метилтрансферазы. Было показано, что при действии вориностата происходит статистически значимое снижение экспрессии белков SUV39H1, SUV39H2, SUV420H1, SUV420H2, EZH2, DOT1L, а также генов бромодоменов BRD2, BRD3, BRD4. Подобные эффекты вориностата в литературе ранее не были описаны. Таким образом, все запланированные задачи на первый год проекта были выполнены.

Аннотация результатов, полученных в 2022 году
Исследования последних лет показали, что эпигенетический механизм противоопухолевого действия химиотерапевтических препаратов не менее эффективен, чем общеизвестный генотоксический. Его широкое изучение и использование может сделать существующую химиотерапию более адресной и эффективной. Семь эпигенетически активных препаратов уже активно используются в клинической практике и более 30 соединений находятся в фазе клинических испытаний. Процесс создания, а также доклинические и клинические исследования нового препарата требуют больших финансовых затрат и занимают до 15 лет. В связи с этим, актуальным направлением в фармакологии в целом и в онкологии в частности является перепрофилирование препаратов, которые уже используются в медицинской практике или проходят клинические испытания, и их перепрофилирование. В рамках выполнения 2-го этапа проекта мы продолжили детализировать механизмы эпигенетического действия противоопухолевых препаратов, а также исследовали противоопухолевую активность in vitro нескольких препаратов на моделях ЗНО с аберрантным эпигенетическим профилем. С помощью Вестерн-блота для препарата 5-фторурацила было зарегистрировано отсутствие влияния на экспрессию ферментов DOT1L, а также KDM1 и KDM3A. В текущий период проекта большая часть работы была посвящена анализу комбинационной эпигенетической активности противоопухолевых препаратов. С помощью нокдауна генов эпигенетических ферментов siRNA для препаратов 5FU и вориностата было исследован характер их эпигенетического действия. Нами был проведен анализ реактивации эпигенетически репрессированного гена GFP при действии 5FU и нокдауне генов HDAC1 и DNMT3A, а также при действии вориностата и нокдауне генов HDAC1, EZH2, SUV39H1, SUV39H2, SUV420H1, SUV420H2. При совместном действии 5FU и siRNA к генам HDAC1 и DNMT3A было показано суммирование эффектов реактивации экспрессии GFP. Таким образом, был сделан вывод об отсутствии эффектов 5FU на данные ферменты. Для комбинации вориностата и siHDAC1 было продемонстрировано увеличение количества GFP+ клеток, превышающее индивидуальные эффекты, что подтвердило наличие дополнительного эпигенетического механизма у вориностата. Анализ реактивации экспрессии GFP при нокдауне гена HDAC1 и генов HMTs продемонстрировал смешанный механизм действия вориностата, то есть мы наблюдали частичное совмещение эффекта реактивации GFP. Таким образом, было подтверждено влияние вориностата на гистоновые метилтрансферазы. Далее были проанализированы эпигенетические эффекты бортезомиба, энзастаурина, кураксина, дексаметазона, оксалиплатина и топотекана в комбинации с эпигенетическими модуляторами, среди которых ингибиторы HDACs – трихостатина А (TSA), вориностат (VOR), вальпроевая кислота (VPA); ингибитор DNMTs – 5-азацитидин (5-aza); ингибиторы бромодоменов – JQ35 и Molibresib (MB); ингибиторы HMTs – Tazemetostat (TAZ), UNC0638, Pinometostat (PMS); ремоделер хроматина – CBL0137. В результате было показано, что дексаметазон вероятнее всего обладает схожими эпигенетическими свойствами с агентами TSA, 5-aza, CBL, а также UNC0638 и PMS. Для бортезомиба также было продемонстрировано вероятное пересечение эффектов с модуляторами 5-aza, TSA, CBL, JQ35 и UNC0638. Анализ комбинационных эффектов гемцитабина с эпимодуляторами показал наличие аддитивного эффекта при действии препарата с UNC0638, CBL и TAZ. Для кураксина CBL0137 было показано значительное пересечение по эффекту с вориностатом, а также наблюдался аддитивный эффект при совместном действии с PMS. Для энзастаурина было показано пересечение по эффектам с ингибиторами HDAC и DNMT, что согласуется с полученными ранее результатами о способности энзастаурина ингибировать HDACs и DNMTs. Для 5-фторурацила в комбинации с TSA были получены данные, схожие с результатами анализа эпигенетической активности этого агента при нокдауне гена HDAC1. При действии 5FU совместно с 5-aza было продемонстрировано, что основной вклад в эффект комбинации вносит 5FU, что может говорить о пересечении механизма действия препарата и ингибитора. Однако при нокдауне DNMT3A и обработке клеток 5FU мы наблюдали синергический эффект. Таким образом, 5-фторурацил может влиять на метилирование ДНК за счет действия на ферменты DNMT1 и DNMT3B. Для анализа возможности применения выявленных эпигенетически активных препаратов для терапии ЗНО с аберрантным эпигенетическим профилем были выбраны препараты кураксин CBL0137 и энзастаурин. Так как и CBL0137 и энзастаурин показали влияние на HDACs и DNMTs, в качестве моделей для исследования были выбраны клетки опухолей кроветворной системы (ОКС) – острого миелоидного лейкоза (ОМЛ) THP-1 и KG-1; хронического миелоидного лейкоза (ХМЛ) К562; острого лимфобластного лейкоза (ОЛЛ) Jurkat, CCRF-CEM и CCRF-S; множественной миеломы (ММ) RPMI-8226, NCI-H929. Для кураксина нами также было продемонстрирована способность ингибировать бромодомены, в связи с чем в исследование его противоопухолевых эффектов in vitro были добавлены модели рака молочной железы (MDA-MB-231, MCF7 и SKBR3) и рака предстательной железы (DU-145 и PC3) различных подтипов. Результаты МТТ-теста для CBL продемонстрировали, что данный агент обладает сильной противоопухолевой активностью in vitro как в отношении клеток ОКС, так и клеток РМЖ. IC50 энзастаурина для клеток ОКС находится в диапазоне 50 – 150 мкМ, причем наибольший эффект ингибирования жизнеспособности был продемонстрирован для клеток ОМЛ. Далее мы показали, что при действии энзастаурина происходит значительное снижение клеток в фазе G1 и увеличение числа клеток в популяции SubG1, что было подтверждено с помощью анализа активации апоптоза FITC-Annexin. Анализ распределения клеток по фазам клеточного цикла при действии кураксина показал увеличение количества клеток в популяции SubG1, а также G2/M-арест во всех клеточных линиях ОКС. При анализе активации апоптоза при действии кураксина в клетках ОКС также было зарегистрировано увеличение доли клеток с поздними апоптотическими изменениями. После обработки клеток MCF-7 и MDA-MB-231 кураксином происходила остановка клеточного цикла в фазе G2/M. Несмотря на это, кураксин не вызывал запуск апоптоза в клетках РМЖ. Далее нами было показано, что кураксин и энзастаурин способны изменять профиль экспрессии генов, ассоциированных с различными сигнальными путями, а также генов онкосупрессоров и генов множественной лекарственной устойчивости. Финальной частью выполнения 2-го этапа проекта стал анализ противоопухолевого эффекта in vitro кураксина CBL0137 совместно с препаратами, применяемыми в терапии, на модели РМЖ. На основе клинических рекомендаций в качестве агентов для комбинации были выбраны следующие химиопрепараты: для клеток люминального А подтипа MCF-7 – доксорубицин (DOX) и 5-фторурацил (5FU); для клеток трижды негативного РМЖ MDA-MB-231 – карбоплатин, доксорубицин и паклитаксел; для клеток HER2+ РМЖ SKBR3 – доцетаксел и карбоплатин. Синергизм был показан для следующих комбинаций на клетках MDA-MB-231: CBL и CPT; CBL и DOX; CBL и PTX. Остальные сочетания препаратов демонстрировали аддитивный характер взаимодействия. На клетках MCF-7 синергизм был показан для комбинации CBL и 5FU.