Аннотация результатов, полученных в 2021 году
Цель работы по проекту состоит в исследовании нейробиологических основ фармакологической коррекции синдрома дефицита внимания с гиперактивностью (СДВГ). Крысы линии DAT-KO – животные с нокаутом по гену, кодирующему белок-транспортер обратного захвата дофамина. Для данной линии крыс характерна гипердофаминергия и развитие ряда симптомов, сходных с таковыми у людей с СДВГ. Исследование норадренергической фармакологической коррекции наблюдаемых симптомов позволит понять механизмы взаимодействия дофаминергической и норадренергической систем мозга. Анализ поведения нокаутных животных подтвердил целесообразность использования DAT-KO крыс в качестве животной модели СДВГ. Эксперименты по выявлению особенностей непроизвольного внимания у крыс DAT-KO и животных дикого типа (WT) показали, что величина преимпульсного ингибирования (PPI) достоверно ниже у крыс DAT-KO. Эти наблюдения свидетельствуют о сниженном уровне внимания, характерном для DAT-KO крыс – модели СДВГ. Результаты оценки эффективности решения DAT-KO крысами пространственных задач в лабиринте Хебба – Вильямса на этапе предварительного обучения подтвердили гиперактивность DAT-KO крыс. Они пробегали достоверно большее расстояние и с большей скоростью, чем крысы дикого типа, время достижения целевого отсека было достоверно больше по сравнению с WT крысами. Сравнение траекторий движения животных при исследовании лабиринта в поисках пищевого подкрепления подтвердило наличие стереотипии в поведении DAT-KO крыс: крысы дикого типа выбирают оптимальный путь к целевому отсеку, тогда как DAT-KO крысы совершают множество возвратов на старт. Было отмечено, что у DAT-KO крыс время и количество посещений зон ошибок достоверно больше, чем у крыс WT: они проводили большую часть времени в зонах ошибок и чаще посещали эти зоны по сравнению с WT крысами. Был проведен анализ ряда норадренергических препаратов (гуанфацин, йохимбин и атомоксетин при внутрибрюшинном введении) в качестве корректоров нарушений поведения DAT-KO крыс. Впервые показана эффективность гуанфацина, постсинаптического агониста альфа-2А рецепторов, для коррекции нарушений поведения крыс DAT-KO в лабиринте при решении задачи на пространственную ориентацию: его введение достоверно снижает симптомы гиперактивности, характерные для DAT-KO крыс как модели синдрома СДВГ, улучшает дефицит пространственной памяти, способствует улучшению внимания, снижая количество ошибочных реакций при достижении цели. Введение DAT-KO крысам антагониста альфа-2А рецепторов йохимбина напротив, было неэффективно, усугубляя СДВГ-подобное поведение этих животных. Атомоксетин, блокатор обратного захвата норадреналина, приводил к увеличению количества ошибочных реакций при обследовании лабиринта, в то же время снижая количество стереотипичных реакций. Нами были получены новые данные о влиянии введения гуанфацина, йохимбина и атомоксетина на величину преимпульсного торможения у DAT-KO крыс. Введение йохимбина не приводило к значимым изменениям данного параметра, тогда как гуанфацин и атомоксетин достоверно увеличивали величину преимпульсного торможения у DAT-KO крыс, что говорит об улучшении непроизвольного внимания. Мы предполагаем, что использование гуанфацина для уменьшения симптомов СДВГ может оптимизировать поведение DAT-KO крыс, улучшая внимание и решение пространственных задач при ориентации в лабиринте. Наряду с поведенческими изменениями, вызываемыми введением норадренергических препаратов, были проанализированы возможные электрофизиологические маркеры нарушений внимания и обучения. Была проведена регистрация электрокортикограммы и локальных потенциалов в трех структурах мозга крыс обеих групп (дорсальный стриатум, первичная моторная и префронтальная зоны коры мозга). Было обнаружено, что при введении норадренергических препаратов снижение мощности дельта-ритма в ПФК коррелирует с улучшением пространственного обучения и внимания у DAT-KO крыс (эффект наблюдаются при введении гуанфацина), тогда как изменения мощности в диапазоне тета-ритма ассоциированы с различными изменениями. Увеличение мощности тета-ритма коррелирует с ухудшением поведенческих показателей DAT-KO крыс при введении YOH и WT крыс при введении гуанфацина, тогда как снижение мощности в диапазоне тета-ритма коррелирует с улучшением некоторых поведенческих показателей DAT-KO. В то же время, увеличение мощности тета-осцилляций в ПФК DAT-KO при введении гуанфацина не связано с ухудшением в поведении. Таким образом, снижение мощности в диапазонах дельта- и тета-ритмов чаще всего ассоциированы с улучшениями показателей внимания и пространственного обучения, однако эффект может быть различным у WT и DAT-KO животных. Возможно, сочетанное применение GF и АТХ выявит новые возможности данных фармакологических агентов для снижения гиперактивности и персеверации у нокаутных животных и выявления более однозначных электрофизиологических маркеров СДВГ. Для понимания механизмов взаимодействия дофаминергической и норадренергической систем мозга впервые было проведено исследование состояния гиподофаминергии, вызываемого у DAT-KO крыс инъекцией блокатора синтеза дофамина альфа-метил-пара-тирозина (alphaMT). В этом случае блок выработки тирозингидроксилазы и, следовательно, синтеза нового дофамина, в сочетании с отсутствием транспортера обратного захвата дофамина у DAT-KO крыс, приводит развитию острой гиподофаминергии с практически «нулевым» уровнем дофамина и развитием каталептического состояния. В то же время, животные дикого типа не показывают значительных изменений в поведении. Обнаружено, что несмотря на критическое влияние на двигательную активность DAT-KO крыс, инъекции alphaMT не оказали значимого воздействия на механизмы непроизвольного внимания, задействованные при осуществлении стартл-рефлекса и преимпульсного торможения. Анализ электрической активности мозговых структур показал, что введение alphaMT оказывает различные эффекты на животных DAT-KO и крыс дикого типа: у WT крыс в стриатуме и префронтальной коре наблюдается достоверное увеличение мощности тета-ритма, у нокаутных животных обнаружен обратный эффект в виде снижения мощности тета-ритма. Таким образом, значительная потеря дофамина, сопровождаемая изменениями в поведении, коррелирует со снижением мощности в диапазоне тета-ритма, который ассоциирован с исследовательским поведением и рабочей памятью. Дополнительно к запланированным в первый год выполнения проекта работам, было проведено пилотное исследование влияния системного введения гуанфацина в дозе 0.25 мг/кг на уровень внеклеточного содержания дофамина у DAT-KO и WT крыс, с использованием метода микродиализа. Эксперименты подтвердили экстремально высокий уровень внеклеточного дофамина у DAT-KO крыс по сравнению с крысами WT, показанный в предыдущих работах. После введения гуанфацина в дозе 0.25 мг/кг было обнаружено статистически достоверное снижение уровня внеклеточного дофамина как у WT крыс, так и у нокаутных животных. Этот факт подтверждает эффективность использования гуанфацина для коррекции состояния гипердофаминергии. Таким образом, благодаря исследованиям на крысах, нокаутных по транспортеру дофамина, было положено начало пониманию роли норадренергической системы мозга в коррекции нарушений работы дофаминергической системы у крыс DAT-KO. Полученные результаты позволяют сделать предположение об эффективности норадренергической коррекции симптомов гиперактивности, нарушений внимания и обучения у крыс DAT-KO. Также полученные в отчетном году результаты подтверждают трансляционную значимость DAT-KO крыс в качестве оптимальной животной модели для исследования патологий при СДВГ и для поиска новых фармакологических подходов для его коррекции.

Аннотация результатов, полученных в 2022 году
На данном этапе работы по проекту было проведено исследование влияния хронической фармакологической и хемогенетической активации норадренергической системы на поведение и нейрональную активность крыс DAT-KO и WT (дикого типа). Крысы линии DAT-KO – животные с нокаутом по гену, кодирующему белок-транспортер обратного захвата дофамина. Для этой линии крыс характерна гипердофаминергия и развитие ряда симптомов, сходных с таковыми у людей с СДВГ. Было исследовано влияние хронического воздействия гуанфацина, агониста альфа2-адренорецепторов, на крыс DAT-KO с острой гиподофаминергией, вызванной инъекцией альфа-метил-пара-тирозина – блокатора синтеза дофамина. Наконец, был проведен одновременный мониторинг поведения, нейрональной активности коры и стриатума и содержания дофамина в стриатуме DAT-KO и WT крыс на протяжении 24 часов. В ходе исследования взаимодействия дофаминергической и норадренергической систем мозга на модели гипердофаминергии у крыс DAT-KO с нокаутом гена транспортера обратного захвата дофамина результаты, полученные в 2022 году, подтвердили ранее сделанные выводы об эффективности действия гуанфацина, агониста альфа2-адренорецепторов. При длительном системном его введении у DAT-KO крыс с гипердофаминергией наблюдалось увеличение коэффициента предимпульсного торможения. Это свидетельствует об улучшении показателей сенсомоторной фильтрации и непроизвольного внимания у нокаутных животных под воздействием гуанфацина, что обеспечивает повышение их адаптационных способностей. Процессы пространственной ориентации в лабиринте Хебба-Вильямса также улучшались у DAT-KO крыс после длительного введения гуанфацина: снизилось количество персеверационных реакций, что свидетельствует о снижении гиперактивности и улучшении процессов внимания. Уменьшение времени нахождения в зонах ошибок также отражает положительный эффект гуанфацина на пространственную ориентацию крыс линии DAT-KO. В рамках реализации проекта было изучено влияние хронического введения гуанфацина на крыс с острой гиподофаминергией - крыс DAT-KO под воздействием альфа-МТ (блокатора синтеза дофамина). Сочетанное воздействие альфа-МТ и гуанфацина не оказало видимого влияния на уровень непроизвольного внимания крыс DAT-KO, однако привело к изменениям взаимодействий между моторной, префронтальной корой и стриатумом. На крыс дикого типа введение блокатора синтеза дофамина альфа-МТ на фоне хронического введения гуанфацина оказало значимое влияние, приведя к ухудшению показателей непроизвольного внимания и достоверным изменениям электрофизиологических характеристик мозговой активности. Впервые был был проведен синхронный суточный мониторинг (в течение 24 ч) таких показателей, как концентрация внеклеточного дофамина в стриатуме, ЭКоГ и LFP, регистрируемые в моторной коре, префронтальной коре и стриатуме крыс, нокаутных по дофаминовому транспортеру, а также мониторинг поведения этих животных. По результатам анализа синхронной регистрации поведения и электрофизиологических характеристик была обнаружена однозначная связь: повышение поведенческой активности в ночное время с 00:30 и до 8:30 соотносится с показанным в тот же временной промежуток падением спектральной мощности низкочастотных осцилляций (дельта, тета, альфа) и увеличением показателей мощности высокочастотных гамма-колебаний. Данные эффекты более выражены у нокаутных животных, чем у животных дикого типа, что может быть связано с более яркими изменениями в поведении - характерной для DAT-KO гиперактивностью, наблюдаемой в период бодрствования. Мониторинг содержания дофамина показал значимые различия между двумя группами животных, демонстрируя повышенный уровень дофамина в стриатуме нокаутных животных по сравнению с диким типом на всём протяжении суток. Данные о результатах микроинъекции аденовирусного вектора CAV-2 свидетельствует об успешности использованной процедуры и выборе адекватных сроков, использованных для выявления эффектов введения. После введения в префронтальную кору крыс CAV-2 не было выявлено значимых различий в выживаемости норадренергических нейронов в голубом пятне контрольных (WT) и нокаутных (DAT-KO) крыс, а также в плотности распределения зараженных вирусным вектором CAV-2 нейронов. Таким образом, хемогенетическая активация экспрессированных искусственных рецепторов (DREADDs) у контрольных крыс WT и крыс с гипердофаминергией (DAT-KO) может быть проведена на одном уровне. Проведенная хемогенетическая активация норадренергической передачи со стороны голубого пятна привела к повышению коэффициента предимпульсного торможения (PPI) у крыс DAT-KO и WT, что может свидетельствовать об улучшении непроизвольного внимания у исследуемых животных. Также в обеих группах животных после хемогенетической активации норадренергической системы были обнаружены изменения нейрональной активности в коре головного мозга и в стриатуме. Наблюдаемые изменения были схожи с вызванной гуанфацином активацией норадренергической системы у крыс WT, однако радикально отличались для крыс DAT-KO, что может свидетельствовать о влиянии хронической гипердофаминергии на определенные механизмы активации норадренергических нейронов. Полученные на этом этапе реализации проекта данные свидетельствуют об эффективности применения модуляции норадренергической передачи (как фармакологической, так и хемогенетической) для коррекции синдрома дефицита внимания и гиперактивности на модели крыс с гипердофаминергией. Изучение циркадных изменений электрофизиологических показателей и впервые проведенный мониторинг суточного уровня дофамина вносит вклад в понимание наблюдаемых значительных изменений в поведении нокаутных животных в течение суток.

Аннотация результатов, полученных в 2023 году
В 2023 году в ходе исследований по проекту было проведено изучение эффектов хемогенетической стимуляции норадренергической системы на параметры поведения (обучение и пространственная память) у крыс, нокаутных по гену, кодирующему белок-транспортер обратного захвата дофамина (DAT-KO крысы). Для линии крыс DAT-KO характерна гипердофаминергия и высокий уровень дофамина в области дорсального стриатума. Поведение этих животных имеет ряд черт, сходных с таковыми у людей с синдромом дефицита внимания с гиперактивностью. Анализ взаимодействия дофаминергической и норадренергической систем мозга проводили при помощи хемогенетической стимуляции норадренергической системы у крыс DAT-KO с гипердофаминергией. Хемогенетическая стимуляция норадренергической передачи (активация искусственных рецепторов, DREADDs, на норадренергиченских нейронах голубого пятна) специфическим лигандом клозапином приводила к изменениям параметров поведения DAT-KO крыс в лабиринте Хебба-Вильямса. Результаты экспериментов показали, что активация DREADDs вызывала не только снижение гиперактивности DAT-KO крыс (достоверно снижалось время выполнения задачи и пройденное расстояние), но и к повышению эффективности выполнения DAT-KO крысами пространственной задачи в лабиринте. Эти результаты были сходными с изученными нами ранее эффектами действия гуанфацина, агониста альфа2-адренорецепторов. Анализ изменений синхронизации нейрональной активности в префронтальной коре, стриатуме и гиппокампе после хемогенетической стимуляции норадренергической системы также выявил изменения, сходные с выявленными нами ранее при введении гуанфацина. Таким образом, полученные данные подтверждают возможность компенсации нарушений в поведении крыс с гипердофаминергией за счет модулирующего влияния норадренергической системы. Данные, полученные в ходе экспериментов с обучением и переобучением крыс DAT-KO и WT (контрольная группа, дикий тип) в Т-образном лабиринте показали, что DAT-KO крысы с выраженной гипердофаминергией достоверно хуже обучались выполнению задачи выбора рукава лабиринта с пищевым подкреплением. При смене подкрепляемого рукава все животные в группе WT смогли переобучиться предпочтению другого рукава лабиринта. Среди крыс DAT-KO лишь часть животных смогла переобучиться и изменить предпочитаемый рукав. Хемогенетическая стимуляция норадренергической передачи у крыс путем активации DREADDs клозапином не привела к значимым изменениям параметров обучения и переобучения животных в Т-образном лабиринте. Таким образом, активация DREADDs не влияла на особенности поведения в Т-образном лабиринте у контрольных и нокаутных крыс. В серии экспериментов по выявлению влияния гуанфацина на параметры инструментального поведения, животных обучали оперантной реакции нажатия на педаль для получения пищевого подкрепления в режиме «фиксированное соотношение 1» (ФС1), при котором животное получает подкрепление после каждого нажатия. На следующей стадии соотношение было увеличено до 3 (ФС3), а затем до 5 (ФС5). После успешного обучения в режиме подкрепления ФС5 животных тестировали в режиме возрастающего подкрепления (ВС3): в течение сессии количество нажатий, необходимых для получения каждого последующего подкрепления (соотношение), увеличивалось на 3, начиная с 3: 3, 6, 9 и т. д. Полученные данные сравнивали с математической моделью наблюдаемого поведения. Было выявлено, что внутрибрюшинное введение гуанфацина (0,25 мг/кг в объёме 1 мл/кг) не оказывало значимого влияния на параметры оперантного поведения животных. По-видимому, фармакологическая активация центральных альфа2-адренорецепторов гуанфацином в данной концентрации не влияет на паттерны поведения животных, оцениваемые при помощи обучения оперантной реакции. В сотрудничестве с Инфраструктурным Объектом (Институт Цитологии РАН) подтверждено эффективное заражение норадренергических нейронов голубого пятна аденовирусным вектором CAV-2. При билатеральном введении вирусной конструкции достоверных различий в эффективности заражения справа и слева выявлено не было. Это позволяет говорить о наличии подтвержденного субстрата для хемогенетичекой активации выброса норадреналина в системе голубое пятно – префронтальная кора. Также было проведено иммуногистохимическое исследование, посвященное изучению распределения дофаминергических нейронов (TH+, тирозингидроксилаза-положительных) в различных структурах головного мозга DAT-KO крыс в сравнении с контрольными животными дикого типа. Иммунофлюоресцентный анализ срезов мозга крыс со специфическими антителами впервые показал, что у крыс, лишенных транспортера обратного захвата дофамина DAT, снижено количество TH+ нейронов в вентральной области покрышки (ventral tegmental area, VTA) по сравнению с крысами дикого типа. Анализ числа TH+ нейронов у DAT-KO крыс в компактной части черной субстанции (SN pc), в ретикулярной части черной субстанции (SN pr) и в латеральной части черной субстанции (SN pL) не выявил достоверных различий по сравнению с животными дикого типа. Полученные данные важны для понимания механизмов развития патологических состояний у DAT-KO крыс с врожденной гипердофаминергией. В серии экспериментов была разработана модифицированная модель острой гиподофаминергии на DAT-KO крысах. В связи с отсутствием у этих животных белка транспортера обратного захвата дофамина, введение блокатора синтеза дофамина альфа-метил-пара-тирозина (альфа-МТ) приводило к резкому снижению уровня внеклеточного дофамина в стриатуме. Ранее данное состояние вызывалось внутрибрюшинным введением альфа-МТ, однако высокая смертность экспериментальных животных при этом способе введения не позволила изучить его долговременные последствия. Нами была разработана модификация модели острой гиподофаминергии с введением блокатора синтеза дофамина в боковые желудочки мозга крыс DAT-KO. Новый способ введения достоверно увеличил долю крыс, выживших после блокады синтеза дофамина (до 90%). Это позволяет сократить число животных, необходимых для проведения экспериментов, а локальное введение альфа-МТ значительно экономит используемое вещество (доза альфа-МТ сокращается в несколько раз). После внутрижелудочкового введения альфа-МТ крысы DAT-KO демонстрируют характерное двигательное поведение (замирание с элементами каталепсии), резкое снижение уровня дофамина в стриатуме (показано методом микродиализа) и изменения в электрической активности мозговых структур, сходные с таковыми при введении альфа-МТ внутрибрюшинно. Усовершенствованная в этом году методика позволит исследовать роль норадренергической модуляции в динамике развития не только гипердофаминергического, но и гиподофаминергического состояния у DAT-KO крыс.