КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

 

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ


Номер 21-75-30003

НазваниеСоздание бивалентной вакцины против SARS-CoV-2 и гриппа с использованием новой технологической платформы

РуководительИсакова-Сивак Ирина Николаевна, Доктор биологических наук

Организация финансирования, регион федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Институт экспериментальной медицины", г Санкт-Петербург

Период выполнения при поддержке РНФ 2021 г. - 2024 г. 

Конкурс№53 - Конкурс 2021 года по мероприятию «Проведение исследований научными лабораториями мирового уровня в рамках реализации приоритетов научно-технологического развития Российской Федерации» Президентской программы исследовательских проектов, реализуемых ведущими учеными, в том числе молодыми учеными.

Область знания, основной код классификатора 05 - Фундаментальные исследования для медицины, 05-403 - Медицинская микробиология и вирусология

Ключевые словаВекторные вакцины, SARS-CoV-2, вирус гриппа, генная инженерия, живая гриппозная вакцина, иммунный ответ, клеточные технологии, технологическая платформа

Код ГРНТИ76.03.41


 

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ


Аннотация
В связи с глобальным распространением нового коронавируса SARS-CoV-2, вызвавшего пандемию COVID-19 в 2020 году, а также угрозы возникновения сочетанных вирусных инфекций (в первую очередь COVID-19 и гриппа), создание безопасных и эффективных средств специфической профилактики и терапии наиболее актуальных вирусных инфекций является приоритетной задачей практического здравоохранения. Настоящий проект направлен на создание векторной вакцины против нового коронавируса SARS-CoV-2, используя в качестве вирусного вектора аттенуированные вирусы гриппа, которые являются основой отечественной живой гриппозной вакцины (ЖГВ), широко применяющейся в клинической практике для профилактики гриппа у детей старше трех лет и у взрослых без ограничения возраста. Использование такого вектора позволит сочетать кампании по вакцинации от гриппа и от новой коронавирусной инфекции, что существенно снизит затраты на вакцинацию, а также снизит нагрузку на органы здравоохранения. Вакцинные штаммы для живой гриппозной вакцины типа А базируются на основе холодоадаптированного донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (Лен/17), для которого ранее были установлены механизмы аттенуации, а также детально изучен вклад каждой аттенуирующей мутации в проявление свойств безвредности и иммуногенности вакцинного вируса. В ходе реализации гранта РНФ Президентской программы исследовательских проектов №17-75-20054 «Конструирование поливалентной вакцины против ОРВИ различной этиологии» нами была создана панель рекомбинантных вирусов гриппа, несущих перспективные эпитопы других респираторных вирусов. Для таких вакцин была показана иммуногенность и защитная эффективность в отношении вируса-вставки и вируса гриппа. Заявляемый проект является логическим продолжением успешно завершенного в 2020 году указанного выше гранта РНФ. Важным этапом разработки векторной вакцины от SARS-CoV-2 является выбор его ключевых антигенов для встраивания в вирусный вектор. На основе Spike-белка создаётся большинство рекомбинантных и векторных вакцин против COVID-19. Такие вакцины направлены преимущественно на выработку гуморального (антительного) иммунного ответа к основному антигену коронавируса. Однако не менее перспективными являются Т-клеточные эпитопы вируса SARS-CoV-2, поскольку Т-клеточный иммунный ответ является более кросс-протективным. Современные знания о механизмах формирования Т-хэлперного (CD4) и цитотоксического (CD8) ответа на продуктивную вирусную инфекцию позволяют разработать алгоритмы для оптимального отбора Т-клеточных эпитопов целевого патогена с учетом иммуногенетических особенностей представителей разных этнических групп. Поэтому одной из задач проекта является всесторонний анализ антигенных детерминант нового коронавируса для рационального дизайна полиэпитопных кассет, которые будут встраиваться в геном вакцинного штамма живой гриппозной вакцины. Научная новизна поставленных в проекте задач определяется не только разработкой новой векторной (адресной) системы доставки чужеродных антигенов в клетки-мишени, но и тем, что принципы выбора иммунодоминантных эпитопов целевых патогенов основаны на самых современных представлениях в области изучения патогенеза и иммуногенеза вируса SARS-CoV-2. Так, впервые будет применен фундаментальный комплексный подход по выбору перспективных В- и Т-клеточных эпитопов с учетом целевых путей презентации антигенов, их экспрессии внутри клеток-мишеней, виляния взаимного расположения эпитопов внутри полиэпитопных кассет, а также с учетом распространенности HLA аллелей среди жителей Российской Федерации. Впервые будет проведен детальный анализ способности вакцинных штаммов ЖГВ включать в свой геном чужеродные антигены, будут рекомендованы специфические участки вирусных генов для инкорпорирования полиэпитопных кассет, а также определен максимальный размер вставок, которые могут быть встроены в вирус без критических нарушений его биологических свойств. Будет изучено влияние встраиваемых полиэпитопных кассет на фенотипические свойства вакцинных штаммов, их генетическую стабильность, безвредность, иммуногенность и протективную активность на моделях лабораторных животных. Также в настоящем проекте впервые будут отработаны все условия для промышленного производства создаваемых векторных вакцин на основе штаммов живой гриппозной вакцины. Для этого будут проведены фундаментальные исследования, направленные на выяснение особенностей взаимодействия «вирус-клетка» на молекулярно-генетическом уровне, при этом будет исследован целый ряд клеточных линий млекопитающих различного происхождения. Одним из ключевых этапов разработки вакцинного препарата, предназначенного для массового применения в практике здравоохранения, является отработка процесса его промышленного производства. В настоящее время подавляющее большинство противогриппозных вакцин производится на развивающихся куриных эмбрионах, тогда как успешная платформа для создания векторных вакцин должна базироваться на клеточных технологиях, с возможностью быстрого масштабирования производства в условиях пандемии. Практическая новизна Проекта заключается в том, что по результатам проекта будут подобраны условия для создания безопасных и эффективных вакцинных штаммов, пригодных для промышленного производства на суспензионных клеточных культурах. Эта технология в будущем может быть применима для конструирования векторных вакцин против любых социально-значимых инфекций, что позволит спасти миллионы человеческих жизней. Важно отметить, что отработанные в настоящем Проекте условия для промышленного производства живых векторных вакцин будут являться универсальными и смогут быть перенесены на производство сезонной (как живой, так и инактивированной) гриппозной вакцины. Привлекаемая в качестве индустриального партнера крупнейшая отечественная биотехнологическая компания ЗАО «БИОКАД» обладает обширным опытом разработок в области создания и промышленного производства различных фармацевтических препаратов, вакцин и биомолекул, при этом основные производственные мощности компании сосредоточены на клеточных технологиях. Опыт компании в области перевода производства препаратов на суспензионные линии клеток млекопитающих, аттестации банков клеточных культур, проведении доклинических и клинических исследований обеспечит успешность реализации новой технологической платформы на практике.

Ожидаемые результаты
По результатам проекта планируется создание уникальной векторной вакцины, способной обеспечить комбинированную защиту от гриппа и новой коронавирусной инфекции SARS-CoV-2. Безвредность и эффективность препарата будет гарантироваться за счет использования уникального донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57, разработанного в Отделе вирусологии ФГБНУ «ИЭМ» в качестве живой гриппозной вакцины. Интраназальное введение вакцины (распылением в нос) будет обеспечивать формирование всех звеньев иммунного ответа, в том числе мукозального (секреторные IgA антитела), который будет играть решающую роль в препятствии распространения вируса в коллективе. Таким образом, разрабатываемая вакцина не будет иметь аналогов ни в России, ни за рубежом. В ходе реализации Проекта будет отработана технология промышленного производства нового вакцинного препарата на суспензионных клеточных культурах, что позволит нарабатывать большие объемы вакцины в сжатые сроки для максимального охвата вакцинацией наиболее уязвимых групп населения. Значимость проекта заключается в универсальности разрабатываемой платформы и технологии. Разработанное на модели инфекций COVID-19 и гриппа платформенное решение может быть затем успешно реализовано и в отношении любых других социально-значимых заболеваний, как инфекционной, так и неинфекционной природы. Необходимо также отметить, что разработанная технология производства вакцин на тканевых культурах может применяться и для производства сезонной инактивированной гриппозной вакцины.


 

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ


Аннотация результатов, полученных в 2021 году
Настоящий Проект направлен на разработку бивалентной векторной вакцины для комбинированной защиты от новой коронавирусной инфекции, вызванной вирусом SARS-CoV-2, и гриппа, циркуляция которого продолжается в условиях пандемии COVID-19. В настоящей разработке в качестве вирусного вектора используются аттенуированные вирусы гриппа, которые являются основой отечественной живой гриппозной вакцины (ЖГВ), широко применяющейся в клинической практике для профилактики гриппа у детей старше трех лет и у взрослых без ограничения возраста. Вакцинные штаммы для живой гриппозной вакцины типа А базируются на основе холодоадаптированного донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (Лен/17), для которого ранее были установлены механизмы аттенуации, а также детально изучен вклад каждой аттенуирующей мутации в проявление свойств безвредности и иммуногенности вакцинного вируса. На начальном этапе разработки векторной вакцины от SARS-CoV-2 был проведен отбор его ключевых антигенов для встраивания в вирусный вектор. На основе данных о гомологии вирусов SARS и SARS-CoV-2 были выбраны консервативные участки вирусных белков (главным образом M, N и S), которые были объединены в антигенные фрагменты SARS-CoV-2 и встроены в различные участки генома вакцинных штаммов ЖГВ подтипов H7N9 и/или H1N1. Кроме того, для индукции антител к рецептор-связывающему домену S белка (RBD) были встроены различные модификации данного белка в HA или NS ген вакцинного вируса гриппа. Сборка вакцинных кандидатов с использованием электропорации клеток Vero соответствующим набором плазмид показала, что вирусы гриппа, содержащие только один модифицированный ген, были успешно получены в результате трансфекции в 100% случаев, независимо от того, какой из генов был модифицирован. Вирусы с двумя модифицированными генами NA и NS успешно получены в 65% случаев. Двойные реассортанты с использованием модифицированного HA и либо NA, либо NS удалось получить только в 1 случае из 5, а попытки получить вирус с тремя модифицированными генами пока не увенчались успехом. При этом встроенные в гены вируса вставки сохранялись на протяжении 10 пассажей в развивающихся куриных эмбрионах (РКЭ), что указывает на высокую степень генетической стабильности вирусов. Сконструированные химерные вирусы гриппа активно реплицировались в РКЭ, при этом наибольшее влияние на титр вируса в РКЭ оказывает количество вставок и их расположение в разных генах. Наименьшее влияние оказывали вставки в ген NA, а также вставки в NS ген размером до 600 нуклеотидов. Титры вирусов с двумя модифицированными генами были в среднем ниже, чем титры вирусов с теми же вставками, у которых был модифицирован только один из генов. Кроме того, не было обнаружено прямой зависимости эффективности репликации вируса от размера вставки. Наиболее заметное влияние оказывала последовательность вставки – отдельные модификации приводили к низкому титру вирусов в РКЭ и были исключены из дальнейшей работы. Все изученные вакцинные кандидаты проявляли аттенуированный фенотип при интраназальном заражении мышей, при этом, несмотря на отсутствие активной репликации в респираторном тракте мышей у некоторых вакцинных кандидатов, двукратная иммунизация животных приводила к образованию высоких уровней антител, специфичных вирусу гриппа. В целом, уровни анти-RBD IgG антител в сыворотках крови мышей, иммунизированных химерными вирусами, содержащими вставку RBD фрагмента в генах НА или NS, были на невысоком уровне, однако в некоторых группах титры были достоверно выше отрицательного контроля (мыши, привитые вирусом-вектором без вставок). В отчетном периоде были отработаны методики постановки реакции микронейтрализации коронавируса и выявления вирус-специфических Т-клеток памяти при стимуляции мононуклеаров периферической крови людей живым вирусом SARS-CoV-2. Было показано, что оптимальной дозой вируса SARS-CoV-2 для стимуляции РВМС является доза MOI=0.001, которая позволяла выявлять наибольшую пропорцию цитокин-продуцирующих Т-клеток, как хелперного, так и цитотоксического фенотипа. С использованием разработанных методик была оценена длительность показателей гуморального и Т-клеточного иммунного ответа к SARS-CoV-2 у лиц, перенесших COVID-19 в легкой или средне-тяжелой форме. Было показано, что нейтрализующая активность антител у людей, переболевших в средне-тяжелой форме, сохраняется до 12 мес. после заболевания (период наблюдения), тогда как уровни этих антител у лиц, перенесших COVID-19 в легкой форме, значительно снижаются уже через полгода после выздоровления. Также было показано, что вирус-специфические CD4 Т клетки персистируют в циркуляции у переболевших людей вплоть до 12 месяцев после заболевания, тогда как цитотоксические Т клетки являются короткоживущими, и их уровни существенно падают уже через 2 месяца после инфицирования. В целом, разработанная методика позволит выявлять SARS-CoV-2-специфические Т клетки как у людей, так и у животных, иммунизированных сконструированными вакцинными кандидатами. Одним из ключевых этапов разработки вакцинного препарата, предназначенного для массового применения в практике здравоохранения, является отработка процесса его промышленного производства. В настоящее время подавляющее большинство противогриппозных вакцин производится на развивающихся куриных эмбрионах, тогда как успешная платформа для создания векторных вакцин должна базироваться на клеточных технологиях, с возможностью быстрого масштабирования производства в условиях пандемии. Проведенные в отчетном периоде исследования позволили рекомендовать клеточную линию MDCK в качестве субстрата для наработки вакцины в производственных масштабах: данная культура клеток поддерживала уровень репликации рекомбинантных вирусов гриппа, достаточный для наработки необходимого количества инфекционных единиц на биореакторах.

 

Публикации

1. Матюшенко В.А., Исакова-Сивак И.Н., Кудрявцев И.В., Гошина А.Д., Чистякова А.К., Степанова Е.А., Прокопенко П.И., Detection of IFNγ-Secreting CD4+ and CD8+ Memory T Cells in COVID-19 Convalescents after Stimulation of Peripheral Blood Mononuclear Cells with Live SARS-CoV-2 Viruses, Volume 13, issue 8, article number1490 (год публикации - 2021) https://doi.org/10.3390/v13081490

2. Исакова-Сивак И.Н., Степанова Е.А., Меженская Д.А., Influenza vaccine: progress in a vaccine that elicits a broad immune response Expert Review of Vaccines, Volume 20, issue 9, pages 1097-1112 (год публикации - 2021) https://doi.org/10.1080/14760584.2021.1964961

3. Киселева И.В., Ксенафонтов А.Д. COVID-19 Shuts Doors to Flu but Keeps Them Open to Rhinoviruses Biology, Volume 10, issue 8, article number 733 (год публикации - 2021) https://doi.org/10.3390/biology10080733

4. Киселева И.В., Ларионова Н.В. Influenza: A century of research Bentham Science Publisher, Sharjah, UAE, Bentham Science Publisher. DOI: 10.2174/97816810884401210101. ISBN: 978-1-68108-845-7 (Print). https://benthambooks.com/book/9781681088440/. ISBN: 978-1-68108-844-0 (Online). 2021, 202p. (год публикации - 2021) https://doi.org/10.2174/97816810884401210101

5. И.Н. Исакова-Сивак, В.А. Матюшенко, И.В. Кудрявцев, Е.А. Степанова, А.Д. Гошина, А.К. Чистякова, П.И. Прокопенко, И.А. Сычев, Л.Г. Руденко Новые методологические подходы для оценки Т-клеточного иммунного ответа к вирусу SARS-CoV-2 после естественной инфекции и вакцинации III ОБЪЕДИНЕННЫЙ НАУЧНЫЙ ФОРУМ ФИЗИОЛОГОВ, БИОХИМИКОВ И МОЛЕКУЛЯРНЫХ БИОЛОГОВ (Сочи, Дагомыс, 3–8 октября 2021).НАУЧНЫЕ ТРУДЫ. Том 2. – М.: Издательство «Перо», 2021. – 313 с., стр.206 (год публикации - 2021)

6. Исакова-Сивак И.Н., Матюшенко В.А., Кудрявцев И.В., Степанова Е.А., Гошина А.Д., Чистякова А.К., Прокопенко П.И., Сычев И.А., Руденко Л.Г. T-cell immune responses to live SARS-CoV-2 after natural infection and vaccination The Eight ESWI Influenza Conference, 4-7 December 2021, Abstract #279 (год публикации - 2021)

7. Исакова-Сивак И.Н., Матюшенко В.А., Степанова Е.А., Гошина А.Д., Чистякова А.К., Прокопенко П.И., Сычев И.А., Донина С.А., Меженская Д.А., Руденко Л.Г. Durability of antibody immune responses to SARS-CoV-2 after natural infection and vaccination The Eight ESWI Influenza Conference, 4-7 December 2021, Abstract #281 (год публикации - 2021)


Аннотация результатов, полученных в 2022 году
На предыдущем этапе исследования нами была сконструирована панель рекомбинантных вакцинных вирусов гриппа, кодирующих в своем геноме различные иммуногенные фрагменты SARS-CoV-2. В настоящем отчетном периоде были завершены исследования безопасности, иммуногенности и протективной активности наиболее перспективных вакцинных кандидатов в экспериментах на сирийских хомячках и хорьках. Эти исследования показали, что прототипы бивалентной вакцины от SARS-CoV-2 и гриппа, сконструированные на основе модельного вакцинного штамма пандемической живой гриппозной вакцины (ЖГВ) подтипа H7N9, являются безвредными, иммуногенными и могут обеспечить комбинированную защиту животных от двух актуальных респираторных вирусов. Однако ввиду того, что новый коронавирус подвержен достаточно высокому уровню эволюционной изменчивости, были проведены дополнительные исследования по оптимизации вакцинных кандидатов с целью разработки прототипа с широким спектром действия в отношении различных антигенных вариантов SARS-CoV-2. Кроме того, были сконструированы новые вакцинные кандидаты на основе современных сезонных вирусов гриппа подтипов H1N1 и/или H3N2, в которых закодированы полиэпитопные кассеты, содержащие наиболее консервативные и иммуногенные Т-клеточные эпитопы коронавируса, с целью последующей разработки трехвалентной комбинированной живой гриппозной вакцины для сезонной профилактики гриппа и COVID-19. Было показано, что химерные вирусы гриппа H1N1 и H3N2 с легкостью собираются методами обратной генетики, что позволит в дальнейшем регулярно актуализировать трехвалентную комбинированную живую гриппозную вакцину для сезонной профилактики гриппа и COVID-19 при антигенном дрейфе вирусов гриппа. Поскольку проведение клинических испытаний наиболее предпочтительно с использованием вакцинных кандидатов, сконструированных на основе сезонных штаммов ЖГВ, было принято решение о проведении полного цикла доклинических исследований вновь сконструированных вакцинных кандидатов на основе вирусов подтипа H1N1 и H3N2. В настоящем отчетном периоде была проведена отработка методик постановки вирусологических и иммунологических реакций для использования в дальнейших доклинических и клинических исследованиях. В частности, разработаны и апробированы протоколы для генотипирования вариантов коронавируса с помощью метода пиросеквенирования, которые позволяют одномоментно идентифицировать варианты альфа, бета, гамма, дельта, омикрон в биологических жидкостях. Кроме того, отработаны условия для оценки уровней вирусспецифических клеток методом ELISpot на модели сирийских хомячков, а именно – определены оптимальные дозы вируса SARS-CoV-2 для стимуляции иммунных клеток, позволяющие выявлять максимальные уровни цитокин-продуцирующих клеток. Также детальное изучение патологических изменений в тканях легких хомяков, зараженных SARS-CoV-2, позволило выявить наиболее чувствительный морфометрический параметр, прямо коррелирующий с выраженностью вирус-индуцированной патологии, а именно – толщина межальвеолярных перегородок. Использование данного показателя позволяет определить даже незначительные различия в степени выраженности вирус-индуцированной патологии, что может быть критическим при доклинической оценке профилактических и терапевтических препаратов от COVID-19. Важным результатом является разработанная методология детекции вируса SARS-CoV-2 с помощью оригинальных биотинилированных моноклональных антител к N белку, универсально распознающих все линии коронавируса, с последующим усилением сигнала при помощи конъюгата стрептавидин-FAM. Разработанная методика позволяет определять титр вируса с помощью подсчета флюоресцирующих фокусов на ранних стадиях после заражения, что, в свою очередь, позволит быстро и достоверно определять нейтрализующую активность сывороток крови людей и иммунизированных животных в отношении любого варианта коронавируса.

 

Публикации

1. А.Д. Гошина, В.А. Матюшенко, С.А. Донина, И.А. Сычев, И.Н. Исакова-Сивак, А.Е. Кательникова, Л.Г. Руденко ВЛИЯНИЕ ТЕПЛОВОЙ ИНАКТИВАЦИИ СЫВОРОТОК КРОВИ ХОРЬКОВ НА ВЫЯВЛЕНИЕ ПРОТИВОКОРОНАВИРУСНЫХ IgG-АНТИТЕЛ В ИММУНОФЕРМЕНТНОМ АНАЛИЗЕ Медицинский Академический Журнал, Т. 22. № 2. С. 157–162 (год публикации - 2022) https://doi.org/10.17816/MAJ108844

2. А.К. Чистякова, Е.А. Степанова, И.Н. Исакова-Сивак, Л.Г. Руденко РАЗРАБОТКА ПРОТОКОЛОВ ГЕНОТИПИРОВАНИЯ РАЗНЫХ ВАРИАНТОВ КОРОНАВИРУСА SARS-CoV-2 МЕТОДОМ ПИРОСЕКВЕНИРОВАНИЯ Медицинский Академический Журнал, Т. 22. № 2. С. 97–114. (год публикации - 2022) https://doi.org/10.17816/MAJ108988

3. А.Я. Рак, С.А. Донина, И.Н. Исакова-Сивак, Л.Г. Руденко ОПТИМИЗАЦИЯ УСЛОВИЙ ПОЛУЧЕНИЯ И ИССЛЕДОВАНИЕ АНТИГЕННЫХ СВОЙСТВ РЕКОМБИНАНТНОГО БЕЛКА НУКЛЕОКАПСИДА SARS-CoV-2 РАЗЛИЧНЫХ ГЕНЕТИЧЕСКИХ ЛИНИЙ Медицинский Академический Журнал, Т. 22. № 2. С. 235–241 (год публикации - 2022) https://doi.org/10.17816/MAJ108599

4. Д.А. Меженская, И.Н. Исакова-Сивак, Л.Г. Руденко ПОДХОДЫ К ИЗУЧЕНИЮ КЛЕТОЧНОГО ИММУННОГО ОТВЕТА К АНТИГЕНАМ SARS-CoV-2 НА МОДЕЛИ СИРИЙСКИХ ХОМЯЧКОВ Медицинский Академический Журнал, Т. 22. № 2. С. 215–220 (год публикации - 2022) https://doi.org/10.17816/MAJ108629

5. Исакова-Сивак И.Н., Степанова Е.А., Матюшенко В.А., Нисканен С.В., Меженская Д.А., Баженова Е.А., Крутикова Е.В., Котомина Т.С., Прокопенко П.И., Нетеребский Б.Д., Виноградова Е.А., Яковлев К.С., Сивак К.В., Руденко Л.Г. Development of a T Cell-Based COVID-19 Vaccine Using a Live Attenuated Influenza Vaccine Viral Vector Vaccines, Том 10, номер 7, С. 1142 (год публикации - 2022) https://doi.org/10.3390/vaccines10071142

6. К.С. Яковлев, Д.А. Меженская, К.В. Сивак, Л.Г. Руденко, И.Н. Исакова-Сивак СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ ПАТОГЕННОСТИ ВИРУСОВ SARS-COV-2 ГЕНЕТИЧЕСКИХ ЛИНИЙ B.1 И B.1.617.2 НА МОДЕЛИ СИРИЙСКИХ ХОМЯКОВ Медицинский Академический Журнал, Т. 22. № 2. С. 125–136. (год публикации - 2022) https://doi.org/10.17816/MAJ109066

7. Кудрявцев И.В., Матюшенко В.А., Степанова Е.А., Васильев К.А., Руденко Л.Г., Исакова-Сивак И.Н. In Vitro Stimulation with Live SARS-CoV-2 Suggests Th17 Dominance In Virus-Specific CD4+ T Cell Response after COVID-19 Vaccines, Том 10, номер 9, С.1544 (год публикации - 2022) https://doi.org/10.3390/vaccines10091544

8. Рак А.Я., Донина С.А., Забродская Я.А., Руденко Л.Г., Исакова-Сивак И.Н. Cross-Reactivity of SARS-CoV-2 Nucleocapsid-Binding Antibodies and Its Implication for COVID-19 Serology Tests Viruses, Том 14, номер 9, С.2041 (год публикации - 2022) https://doi.org/10.3390/v14092041

9. Соколов А.В., Исакова-Сивак И.Н., Грудинина Н.А., Меженская Д.А., Литасова Е.В., Костевич В.А., Степанова Е.А., Рак А.Я., Сычев И.А., Кирик О.В., Руденко Л.Г. Ferristatin II Efficiently Inhibits SARS-CoV-2 Replication in Vero Cells. Viruses, Номер 14, том 2, С.317 (год публикации - 2022) https://doi.org/10.3390/v14020317

10. Киселева И.В., Ксенафонтов А.Д. Рино– и РС–вирусы в пандемию COVID–19 Инфекция и Иммунитет, Т. 12, № 4, С.624–638. (год публикации - 2022) https://doi.org/10.15789/2220-7619-AR-826

11. Киселева И.В., Мустаева Т.А., Ксенафонтов А.Д. SARS–CoV–2 Invasion: What happens to other respiratory viruses? The Open Microbiology Journal, Том 16, e187428582206100. (год публикации - 2022) https://doi.org/10.2174/18742858-v16-e2206100

12. Кудрявцев И.В., Рубинштейн А.В., Головкин А.Л., Калинина О.В., Васильев К.А., Руденко Л.Г., Исакова-Сивак И.Н. Dysregulated Immune Responses in SARS-CoV-2-Infected Patients: A Comprehensive Overview Viruses, Том 14, номер 5, С.1082 (год публикации - 2022) https://doi.org/10.3390/v14051082.

13. Степанова Е.А., Исакова-Сивак И.Н., Руденко Л.Г. Options for the development of a bivalent vaccine against SARS-CoV-2 and influenza EXPERT REVIEW OF VACCINES, Том 21, номер 11, С. 1533-1535 (год публикации - 2022) https://doi.org/10.1080/14760584.2022.2117692

14. А. Я. Рак, С. А. Донина, Я. А. Забродская, И. Н. Исакова-Сивак, Л. Г. Руденко ПОЛУЧЕНИЕ РЕКОМБИНАНТНЫХ БЕЛКОВ НУКЛЕОКАПСИДА SARS-CoV-2 РАЗЛИЧНЫХ ГЕНЕТИЧЕСКИХ ЛИНИЙ И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ ДЛЯ ДЕТЕКЦИИ ПРОТИВОВИРУСНЫХ АНТИТЕЛ ПРИ COVID-19 IX Международная конференция молодых ученых: вирусологов, биотехнологов, биофизиков, молекулярных биологов и биоинформатиков. Сборник тезисов., С.235-236. (год публикации - 2022)

15. Исакова-Сивак И.Н., Степанова Е.А., Меженская Д.А., Матюшенко В.А., Нисканен С.В., Виноградова Е.А., Дмитриев А.В., Руденко Л.Г. Development of a bivalent vaccine against SARS-CoV-2 and influenza using a live attenuated influenza vaccine platform Abstract Book "Options XI for the Control of Influenza", 26-29 September, Belfast, UK, Abstract Book "Options XI for the Control of Influenza", Oral Abstract AOXI0238 (год публикации - 2022)

16. Степанова Е.А., Кудрявцев И.В., Исакова-Сивак И.Н., Матюшенко В.А., Гошина А.Д., Чистякова А.К., Прокопенко П.И., Руденко Л.Г. In vitro stimulation with live SARS-CoV-2 reveals Th17 dominance in virus-specific CD4+ T cell response after COVID-19 Abstract Book "Options XI for the Control of Influenza", 26-29 September, Belfast, UK, Poster #AOXI0171 (год публикации - 2022)

17. Исакова-Сивак И.Н., Степанова Е.А., Меженская Д.А., Матюшенко В.А., Руденко Л.Г. Рекомбинантный вакцинный штамм для живой интраназальной вакцины, обеспечивающей сочетанную профилактику гриппозной и коронавирусной инфекций -, RU 2782531 C1 Опубликовано: 28.10.2022 Бюл. № 31. (год публикации - )

18. - КОМБИНИРОВАННАЯ ВАКЦИНА ОТ КОРОНАВИРУСА И ГРИППА БУДЕТ РАБОТАТЬ И ПРОТИВ НОВЫХ ШТАММОВ Научная Россия, - (год публикации - )

19. - Российские ученые создали гибридную вакцину от гриппа и коронавируса MK.RU, - (год публикации - )

20. - В России разработали вакцину, которая обеспечит длительную защиту против COVID-19 и гриппа Газета.RU, - (год публикации - )

21. - В РФ разработали вакцину, обеспечивающую длительную защиту против гриппа и COVID-19 m.24.RU, - (год публикации - )

22. - Комбинированная вакцина от коронавируса и гриппа будет работать и против новых штаммов Indicator.RU, - (год публикации - )

23. - Новая российская назальная вакцина защитит от ковида и гриппа одновременно ФАРММЕДПРОМ, - (год публикации - )


Аннотация результатов, полученных в 2023 году
На предыдущем этапе исследования были сконструированы вакцинные кандидаты на основе современных сезонных вирусов гриппа подтипов H1N1 и H3N2, в гене нейраминидазы которых закодированы полиэпитопные кассеты, содержащие наиболее консервативные и иммуногенные Т-клеточные эпитопы коронавируса. В настоящем отчетном периоде была проведена оценка безвредности, иммуногенности и протективной активности бивалентной вакцины, подготовленной на основе сезонного штамма вируса гриппа H3N2, в эксперименте на макаках резус, а в качестве препарата сравнения выступал соответствующий классический штамм живой гриппозной вакцины (ЖГВ) без модификаций. Было показано, что двукратное интраназальное введении вакцины не оказывало токсического действия на физиологические показатели обезьян, включая температуру и массу тела, а также клинические и биохимические показатели крови. Последующее заражение иммунизированных животных живым коронавирусом SARS-CoV-2 линии Delta показало, что у инфицированных вакцинированных животных в течение периода наблюдения не было выявлено снижения массы тела, повышения температуры, а летальность отсутствовала. По всем показателям было подтверждено отсутствие эффекта антителозависимого усиления инфекции (ADE-эффект) у живой рекомбинантной векторной вакцины на основе аттенуированного штамма вируса гриппа. Оценка иммуногенных свойств исследуемых вакцинных штаммов в эксперименте на макаках резус выявила достоверно более высокую иммуногенность в отношении антигенов вируса гриппа у рекомбинантного штамма бивалентной вакцины в сравнении с классическим вакцинным штаммом ЖГВ, что соответствует полученным нами ранее данным об усилении иммуногенных свойств вакцинных штаммов ЖГВ при встраивании в их геном иммуногенных Т-клеточных эпитопов других респираторных вирусов. Кроме того, была показана способность химерного вируса стимулировать Т-клеточный иммунитет к эпитопам N белка коронавируса, что указывает на способность бивалентной вакцины стимулировать иммунный ответ к двум целевым патогенам. Среди панели сконструированных рекомбинантных штаммов вирусов гриппа подтипов H1N1 и H3N2, кодирующих различные фрагменты консервативных участков белков SARS-CoV-2, были выбраны прототипы с наилучшими ростовыми характеристиками в культуре клеток млекопитающих, поскольку в дальнейшем планируется наработка трехвалентной комбинированной живой гриппозной вакцины для сезонной профилактики гриппа и COVID-19 с использованием суспензионных линий клеток. Для отобранных рекомбинантных штаммов было проведено доклиническое исследование безопасности, иммуногенности и протективной активности в отношении вирусов гриппа и коронавируса SARS-CoV-2 на модели сирийских хомячков, где в качестве контрольных препаратов выступали соответствующие штаммы классической ЖГВ подтипов H1N1 и H3N2. Проведенный анализ физиологических, клинико-лабораторных и морфологических показателей сирийских хомячков установил, что тестируемые объекты при интраназальной двукратной иммунизации не оказывали токсического действия на организм животных. Оба рекомбинантных штамма индуцировали выраженный системный гуморальный иммунный ответ к антигенам вируса гриппа, не уступая по этому показателю классическим штаммам ЖГВ. Этот уровень иммунитета обеспечил защиту иммунизированных животных от заражения гомологичными вирусами гриппа. Также была показана способность химерных вирусов гриппа защищать иммунизированных животных от размножения коронавируса в носовых ходах животных, что может в дальнейшем предотвратить передачу вируса в коллективе, даже при отсутствии полной защиты привитых от естественной инфекции. В отчетном периоде также была разработана поливалентная вакцина, направленная на защиту привитых от сезонных вирусов гриппа А/Н1N1, A/Н3N2 и В, а также от коронавируса SARS-CoV-2. Вакцинные штаммы были наработаны в развивающихся куриных эмбрионах в лабораторных условиях, объединены в трехвалентный препарат в соответствующих дозировках, и готовая смесь была использована для проведения доклинических исследований на модели сирийских хомяков, где оценивалась безопасность вакцины, её иммуногенность и способность защищать животных от гриппозной и коронавирусной инфекций. Была показана безвредность вакцины и способность стимулировать защитный иммунитет ко всем трем вариантам вируса гриппа, а также в отношении новой коронавирусной инфекции. На следующем этапе работы будет проводиться отработка технологии промышленного производства разработанной трехвалентной сезонной комбинированной вакцины на суспензионных клеточных культурах в сотрудничестве с индустриальным партнером проекта – биотехнологической компанией АО «БИОКАД». В рамках этих разработок будут получены экспериментальные серии вакцины, которые позволят завершить требуемые доклинические исследования и подготовить досье для получения разрешения на проведение клинических испытаний вакцины на добровольцах.

 

Публикации

1. Гошина А.Д., Матюшенко В.А., Меженская Д.А., Рак А.Я., Кательникова А.Е., Гусев Д.А., Руденко Л.Г., Исакова-Сивак И.Н. RDE Treatment Prevents Non-Specific Detection of SARS-CoV-2- and Influenza-Specific IgG Antibodies in Heat-Inactivated Serum Samples Antibodies, Том 12, №2, С.39 (год публикации - 2023) https://doi.org/10.3390/antib12020039

2. Рак А.Я., Горбунов Н.П., Костевич В.А., Соколов А.В., Прокопенко П.И., Руденко Л.Г., Исакова-Сивак И.Н. Assessment of Immunogenic and Antigenic Properties of Recombinant Nucleocapsid Proteins of Five SARS-CoV-2 Variants in a Mouse Model Viruses, Номер 15, том 1, С.230 (год публикации - 2023) https://doi.org/10.3390/v15010230

3. Рак А.Я., Исакова-Сивак И.Н., Руденко Л.Г. Nucleoprotein as a promising antigen for broadly protective influenza vaccines Vaccines, Vaccines 2023, 11(12), 1747 (год публикации - 2023) https://doi.org/10.3390/vaccines11121747

4. Рак А.Я., Исакова-Сивак И.Н., Руденко Л.Г. Overview of nucleocapsid-targeting vaccines against COVID-19 Vaccines, Volume 11, Issue 12, P.1810; (год публикации - 2023) https://doi.org/10.3390/vaccines11121810

5. Гошина А.Д., Матюшенко В.А., Донина С.А., Меженская Д.А., Рак А.Я., Руденко Л.Г., Исакова-Сивак И.Н. Влияние тепловой инактивации сывороток крови человека и животных на выявление уровней IgG-антител к SARS-CoV-2 И вирусу гриппа в иммуноферментном анализе Сборник тезисов Всероссийской конференции молодых ученых "Вирусные инфекции – от диагностики к клинике" (Санкт-Петербург, 13–14 апреля 2023). С. 91., С. 34-35 (год публикации - 2023)

6. Исакова-Сивак И.Н., Степанова Е.А., Матюшенко В.А., Меженская Д.А., Котомина Т.С., Рак А.Я., Прокопенко П.И., Донина С.А., Чистякова А.К., Гошина А.Д., Новицкая В.В., Рекстин А.Р., Руденко Л.Г. Preclinical evaluation of a combined vaccine against seasonal influenza and COVID-19. Proceedings of the 9th ESWI Conference (17-20 September 2023, Valencia, Spain), Abstract #397 (год публикации - 2023)

7. Котомина Т.С., Степанова Е.А., Матюшенко В.А., Меженская Д.А., Баженова Е.А., Матушкина А.С., Руденко Л.Г., Кудрявцев И.В., Исакова-Сивак И.Н. Live attenuated influenza vaccine viruses as a platform for the development of vaccines against multiple respiratory pathogens. Proceedings of the 9th ESWI Conference (17-20 September 2023, Valencia, Spain), Abstract #339 (год публикации - 2023)

8. Рак А.Я., Забродская Я.А., Горбунов Н.П., Поляков Д.С., Донина С.А., Исакова-Сивак И.Н., Руденко Л.Г. Влияние эволюционной изменчивости на иммуногенность и диагностический потенциал белка нуклеокапсида SARS-CoV-2 Сборник материалов IV Международной научно-практической конференции "Противодействие новой коронавирусной инфекции и другим инфекционным заболеваниям", 7-9 декабря 2023., Санкт-Петербург, C. 254-257 (год публикации - 2023)

9. Рак А.Я., Забродская Я.А., Горбунов Н.П., Поляков Д.С., Исакова-Сивак И.Н., Руденко Л.Г. Получение рекомбинантных белков нуклеокапсида SARS-CoV-2 и их использование для разработки диагностических тест-систем Сборник тезисов Всероссийской конференции молодых ученых "Вирусные инфекции – от диагностики к клинике" (Санкт-Петербург, 13–14 апреля 2023). С. 91., С. 91-92 (год публикации - 2023)

10. Рак А.Я., Забродская Я.А., Донина С.А., Исакова-Сивак И.Н., Руденко Л.Г. Effect of slow evolutionary changes in SARS-CoV- 2 nucleocapsid protein on its antigenic and immunogenic properties Proceedings of the 9th ESWI Conference (17-20 September 2023, Valencia, Spain), Abstract #265 (год публикации - 2023)

11. Рак А.Я., Забродская Я.А.,Горбунов Н.П., Поляков Д.С., Меженская Д.А., Руденко Л.Г., Исакова-Сивак И.Н. Development of a universal diagnostic test system for determining the titer of antibodies against SARS-CoV-2 by microneutralization X Международная конференция молодых ученых: биоинформатиков, биотехнологов, биофизиков, вирусологов и молекулярных биологов — 2023: Cб. тез. / АНО «Инновационный центр Кольцово». — Новосибирск : ИПЦ НГУ, 2023. — 814 с., С. 431-432 (год публикации - 2023) https://doi.org/10.25205/978-5-4437-1526-1-226

12. Степанова Е.А., Исакова-Сивак И.Н., Меженская Д.А., Матюшенко В.А., Баженова Е.А., Рак А.Я., Вон П.-Ф., Прокопенко П.И., Котомина Т.С., Руденко Л.Г Холодоадаптированный вирус гриппа, экспрессирующий рецептор-связывающий домен SARS-CoV-2 в составе молекулы НА, обладает защитной эффективностью в отношении вируса гриппа и SARS-CoV-2 в эксперименте Сборник материалов IV Международной научно-практической конференции "Противодействие новой коронавирусной инфекции и другим инфекционным заболеваниям", 7-9 декабря 2023., Санкт-Петербург, С. 300-303 (год публикации - 2023)

13. Чистякова А.К., Степанова Е.А., Исакова-Сивак И.Н., Руденко Л.Г. Адаптация протоколов генотипирования вариантов коронавируса SARS-CoV-2 для определения новых штаммов. В книге: XXXV Зимняя молодёжная научная школа «Перспективные направления физико- химической биологии и биотехнологии». Сборник тезисов., С.182 (год публикации - 2023)

14. - Ученый совет: Комбинированная вакцина от гриппа и коронавируса Радио "Культура", 10 ОКТЯБРЯ 2023, 09:50 (год публикации - )