Аннотация результатов, полученных в 2021 году
Настоящий проект предусматривает работу по двум направлениям. Во-первых, предполагается идентифицировать детерминанты наследственного рака молочной железы (РМЖ) и рака яичника (РЯ), которые ассоциированы с данными заболеваниями у неславянских народов Российской Федерации. Во-вторых, планируются изучить те особенности молекулярного патогенеза BRCA1/2-ассоциированных карцином, которые определяют спектр лекарственной чувствительности данной группы опухолей. В течение первого года проекта основные работы были направлены на формирование коллекций ДНК, полученных от представительниц различных национальностей, проживающих в Российской Федерации. Пополнение коллекций мы осуществляем следующим способом: 1) Набор архивных образцов карцином яичника высокой степени злокачественности и карцином молочной железы в патоморфологических архивах региональных онкологических центров (г. Грозный, г. Нальчик, г. Владикавказ, г. Черкесск, г. Уфа, г. Якутск). На сегодня доступные к анализу архивные ретроспективные коллекции ДНК представлены случаями серозных карцином яичника высокой степени злокачественности из Якутии (n = 32), Карачаево-Черкесской Республики (n = 20), Северной Осетии (n = 32), Чеченской Республики (n = 58); часть коллекции составили образцы трижды-негативных карцином молочной железы из Чеченской Республики (n = 37). 2) Набор образцов крови от проспективных пациенток с РМЖ и РЯ, которые проходят обследование в региональных онкологических центрах (г. Грозный, г. Нальчик, г. Якутск). Основные группы проспективных больных, которые на сегодня уже подвергнуты первому этапу молекулярно-генетического анализа, представлены пациентками из Чеченской Республики (n = 52), пациентками из учреждений онкологического профиля г. Уфы (татары, башкиры, чуваши, мордва, мари; n = 100), Ингушетии (n = 47), Дагестана (n = 80), Кабардино-Балкарии (n = 106), а также крымскими татарами (n = 55) и якутами (n = 48). 3) Анкетирование пациенток с РМЖ или РЯ, которые впервые обращаются в НМИЦ онкологии ми Н.Н. Петрова. 4) Интервьюирование ретроспективных пациенток, которые ранее проходили молекулярно-генетическое тестирование мутаций BRCA1/BRCA2 в лаборатории молекулярной онкологии и чьи образцы ДНК еще пригодны для NGS-анализа. В 2021 году мы получили более 850 новых биологических образцов для NGS-анализа, из которых 662 случаев уже было подвергнуто таргетному высокопроизводительному секвенированию генов BRCA1, BRCA2, ATM, TP53, PALB2. В отчетный период мы завершили анализ пациенток из Чеченской Республики. В это исследование было включено 147 женщин, больных РМЖ или РЯ. Патогенные аллели BRCA1/2 были выявлены в 15/68 (22%) случаях серозных карцином высокой степени злокачественности (high-grade serous ovarian carcinoma, HGSOC). У девяти из десяти женщин с мутацией BRCA1 был обнаружен один и тот же патогенный вариант (c.3627_3628delAG), еще одна пациентки была гетерозиготной по аллелю BRCA1 c.5296delA. Большее генетическое разнообразие наблюдалось среди пациентов с гетерозиготными мутациями BRCA2 (p.Q3299X: n = 3; c.5345dupA: n = 1; c.7408_7409delTT: n = 1). Учитывая высокую частоту мутаций в гене BRCA1, мы исследовали 49 последовательных пациенток с трижды-негативным раком молочной железы. Эти усилия основывались на том факте, что BRCA1 специфически ассоциирован с трижды-негативным рецепторным фенотипом новообразований молочной железы. Было выявлено еще 3 (6%) носительницы мутаций BRCA1 (c.1338_1339delAG: n = 1; c.5153-2A> G: n = 1; c.5296delA: n = 1). У всех пациенток с патогенным вариантом BRCA1 c.3627_3628delAG была обнаружена полиморфная замена c.1067G> A (p.Q356R); это подтверждает, что BRCA1 c.3627_3628delAG действительно является founder-аллелем, а не горячей точкой мутагенеза. Данное исследование является также убедительной демонстрацией того, что тестирование последовательных или случайно отобранных больных с HGSOC позволяет эффективно анализировать этноспецифический спектр мутаций BRCA1/2. Анализ представительниц других народностей еще не завершен. На сегодня основные наблюдения относительно спектра патогенных вариаций BRCA1/2 можно свести к следующим: 1) обнаружена founder-мутация в гене BRCA2, ассоциированная с РЯ, у пациенток из Северной Осетии; 2) описана новая повторяющая мутация BRCA2 в области 5’-UTR у татарских пациенток из Уфы; 3) у чувашей распространена славянская мутация BRCA1 5382insC; 4) для ингушей и пациенток из Дагестана в большей степени характерна персистенция мутаций BRCA2, чем BRCA1; 5) у пациенток c РМЖ – крымских татарок, негативных в отношении известных повторяющихся аллелей BRCA1 5382insC, 4153delA, 185delAG, не удалось обнаружить других повторяющихся патогенных вариантов. Мы также обратили внимание на персистенцию патогенных вариантов в гене ATM у пациенток из Кабардино-Балкарии, суммарная частота которых в исследованной когорте составила более 5%. Пациентки с выраженными клиническими признаками наследственного рака (n = 165) отобраны для следующего этапа молекулярно-генетического анализа – мультигенного таргетного секвенирования (ATR, BARD1, BLM, BRIP1, CDH1, CHEK2, FANCM, GREM1, MRE11, NBN, NF1, NF2, PTCH1, PTEN, RAD50, RAD51, RAD51C, RAD51D, RB1, SLX4, WRN и др.) Вторая часть экспериментов данного проекта направлена на уточнение ряда аспектов молекулярного патогенеза BRCA1/BRCA2-ассоциированных карцином. В частности, известно, что практически все карциномы яичника, развивающиеся у носительниц мутаций в генах BRCA1 или BRCA2, характеризуются утратой оставшегося аллеля вовлечённого гена. Тем не менее, остаётся неясным, насколько этот же механизм универсален по отношению к BRCA1/2-ассоциированному раку молочной железы. Мы проанализировали 59 опухолевых образцов тканей молочных желез от носительниц мутаций BRCA1 (n = 51) и BRCA2 (n = 7), еще одна пациентка была носительницей мутаций и в BRCA1, и в BRCA2. Частота потерь гетерозиготности в локусе BRCA1 у носительниц соответствующей мутации была 44/52 (85%); у носительниц мутаций BRCA2 частота локус-специфической потери гетерозиготности составила 6/8 (75%). Случаев инактивации второго аллеля за счет микромутаций обнаружено не было. В первый год проекта мы также начали сбор и анализ опухолевых образцов, которые будут использованы для сравнения CNA-профилей BRCA1/2-ассоциированных РМЖ и РЯ, развившихся у одной и той же пациентки. На сегодня в нашем распоряжении есть 12 таких случаев. Для части опухолевых образцов уже получены данные профиля изменений копийности (CNA). В течение отчетного периода была опубликована одна статья в журнале Hereditary Cancer and Clinical Practice. Еще одна оригинальная статья, обобщающая данные исследования пациенток из Чеченской Республики, находится на рецензировании в зарубежном издании. Результаты проекта также были обнародованы на ежегодном конгрессе Европейского общества гинекологической онкологии (European Society of Gynecologic Oncology, ESGO).

Аннотация результатов, полученных в 2022 году
В отчетном году нами был продолжен набор образцов от пациенток – представительниц неславянских народов из различных регионов России для анализа кодирующих последовательностей генов BRCA1, BRCA2, ATM, PALB2, TP53. К концу отчетного периода общая коллекция ДНК составила 1893 образца, 1720 из которых было подвергнуто таргетному секвенированию на предмет носительства патогенных и потенциально патогенных вариантов в указанных генах. На сегодня наши наиболее многочисленные национальные коллекции включают образцы ДНК пациенток с раком молочной железы (РМЖ) и яичника (РЯ) из Дагестана (n = 210), Чечни (n = 159), Ингушетии (n = 129), Северной Осетии (n = 162), Кабардино-Балкарии (n = 203), Якутии (n = 110). Коллекция образцов от пациенток с татарскими, башкирскими и татаро-башкирскими корнями насчитывает 293 образца. Другие серии представлены образцами ДНК от пациенток армянского, азербайджанского, грузинского происхождения, пациенток из Карачаево-Черкессии, Чувашии, Республики Марий Эл. В отчетному году были опубликованы результаты исследования чеченских пациенток [Sokolenko et al. Strong founder effect for BRCA1 c.3629_3630delAG pathogenic variant in Chechen patients with breast or ovarian cancer. Cancer Med. 2022. doi: 10.1002/cam4.5159]. Выполнено исследование других народностей Северного Кавказа и идентифицированы повторяющиеся (founder) аллели у ингушей (BRCA2 c.5057T>G [L1686X], 5351dupA), осетин (BRCA2 c.6339delC), карачаевцев (BRCA1 c.2907_2910delTAAA), у некоторых народностей Дагестана (BRCA1 c.66dupA, BRCA2 c.5621_5624delTTAA). В целом, для пациенток из Ингушетии и осетинок оказалось характерным преобладание аллелей BRCA2 по сравнению с BRCA1. У пациенток из Кабардино-Балкарии значимую часть в спектре выявленных аллелей занимают патогенные варианты ATM. Потенциальным founder-аллелем у кабардинок и балкарок может являться редкий миссенс-вариант в гене BRCA2 H2623R [rs80359012] – наиболее частый потенциально патогенный вариант в этой этнической группе. При анализе пациенток – татарок обнаружен ранее не описанный у представителей этой народности частый патогенный аллель BRCA2 rs758732038 (5'UTR-2delAG). Вклад мутаций ATM и PALB2 в заболеваемость РМЖ и РЯ у татарок и башкирок, по-видимому, незначителен: патогенные варианты ATM в нашей серии обнаружены не были, и только одна пациентка являлась носительницей мутации PALB2. Молекулярно-генетическому тестированию подвергнуты также пациентки с армянскими, азербайджанскими и грузинскими корнями. В нашей коллекции образцов ДНК армянок выявлено 8 различных аллелей BRCA1/BRCA2; повторяющимися были мутации BRCA1 c.2649_2650insGGCA и BRCA2 c.8437G>T [G2813X]. Аллель c.2649_2650insGGCA был описан ранее у пациентки армянского происхождения из Еревана. Вариант BRCA2 G2813X также является распространенным аллелем у кабардинок. В армянской серии пациенток также было обнаружено несколько носителей мутаций ATM. У пациенток – азербайджанок, несмотря на малочисленность нашей коллекции, обнаружен повторяющийся вариант BRCA1 c.3604delT, ранее не описанный. Это делает целесообразным дальнейшее расширение коллекции для подтверждения его возможного значения как founder-аллеля. Среди пациенток грузинского происхождения с РМЖ обнаружен патогенный вариант BRCA2 c.753_754dupAG. Наследственные патогенные варианты TP53 не были выявлены ни в одной из групп. Часть образцов, в которых не было обнаружено мутаций BRCA1, BRCA2, ATM или PALB2, отбирались на следующий раунд анализа – таргетное секвенирование других известных генов, ассоциированных с наследственными опухолевыми синдромами: ATR, BAP1, BARD1, BLM, BRIP1, CDH1, CDKN2A, CHEK2, EPCAM, FANCM, MLH1, MRE11, MSH2, MSH3, MSH6, MUTYH, NBN, NF1, NF2, NTHL1, PMS1, PMS2, POLD1, POLE, PTCH1, PTEN, RAD50, RAD51, RAD51C, RAD51D, RB1, WRN и др. В серии 187 пациентов, для которых выполнено мультигенное секвенированию, было обнаружено 13 различных патогенных или потенциально патогенных вариантов: CHEK2 c.893_897delATATT; NBN 657del5, NBN c.93_94delTG (n = 2), NBN c.1549_1554del, RAD51C R193X (n = 2), MUTYH G396D, MUTYH Q413X, MHS2 c.1613delA, MLH1 E519X, POLE c.3510dupA, ATR c.2085dupA, PMS1 c.1258delC, NTHL1 W261X. Следует отметить, что вариант RAD51C R193X встретился дважды даже в такой ограниченной серии у осетинки и кабардинки, что делает его подходящим кандидатом на расширенное исследование в группах больных из Кабардино-Балкарии и Северной Осетии. Мутации в гене RAD51C – это известная генетическая детерминанта развития рака яичника, и R193X может быть кандидатным founder-вариантом в упомянутых регионах. Носительство варианта NBN c.93_94delTG в обоих случаях было выявлено у пациенток из Кабардино-Балкарии. Наконец, определенный интерес представляет мутация ATR c.2085dupA у пациентки с РЯ из Якутии. Ранее было показано, что мутации ATR могут быть ассоциированы с наследственным орофарингеальным раком. В РЯ данное повреждение выявлено впервые. На втором этапе проекта было продолжено изучение особенностей BRCA1/BRCA2-ассоциированных опухолей молочной железы и яичника. В частности, мы сравнили характеристики профилей хромосомной нестабильности в BRCA1-ассоциированных карциномах яичника и молочной железы. Средний HRD score в карциномах яичника, ассоциированных с носительством наследственных патогенных вариантов BRCA1, составил 55.1 баллов, тогда как в BRCA1-ассоциированных карциномах молочной железы – 62.7; это различие не было статистически достоверным (p = 0.229). Другие количественные характеристики профилей хромосомной нестабильности также не отличались в карциномах данных локализаций. Делеции с микрогомологией обнаруживались как в карциномах яичника, так и в карциномах молочной железы, однако в BRCA1-ассоциированных РЯ их частота была выше (92% vs. 40%, p = 0.052). Мы также использовали кластерный анализ для сравнения полногеномных профилей копийности и паттерна LOH в карциномах яичника и молочной железы. Различие между двумя группами достигло формальной значимости по паттерну копийности, но не распределению регионов LOH (p = 0.00048 для уровней копийности всех сегментов в BRCA1-ассоциированных карциномах молочной железы vs. BRCA1-ассоциированных карциномах яичника). В частности, одно из различий касалось копийности короткого плеча 8 хромосомы: утрата теломерного участка, содержащего опухолевые супрессоры CSMD1, CLDN23, MCPH1, чаще наблюдалась в карциномах яичника. В отчетном году опубликовано 12 работ в отечественных и зарубежных изданиях (включая 7 публикаций в журналах первого квартиля); результаты представлены на двух международных конгрессах ESMO Gynaecological Cancers Congress и 23rd European Congress on Gynaecological Oncology.

Аннотация результатов, полученных в 2023 году
В 2023 году было продолжено проспективное молекулярно-генетическое тестирование пациенток – представительниц различных неславянских народов, проживающих в Российской Федерации. К концу отчетного этапа мы привлекли в исследование более 2500 образцов ДНК от больных с карциномами молочной железы (РМЖ) и яичника (РЯ). Анализ кодирующих последовательностей BRCA1, BRCA2, ATM, PALB2, TP53 методом высокопроизводительного секвенирования выполнен 2282 пациенткам. В 2023 году мы расширили панель генов, тестирование которых теперь проводится всем больным, поступающим в исследование. Были синтезированы биотинилированные зонды для гибридизации, покрывающие кодирующие последовательности генов RAD51B, RAD51С, RAD51D, RAD54L, BARD1, PTEN. Зонды были апробированы в протоколах обогащения ДНК-библиотек на основе KAPA HyperCap Workflow v.3.0 и используются для таргетного анализа. В течение 2023 года было проанализировано 610 образцов с использованием расширенной панели. В отчетный период мы обобщили и опубликовали результаты исследования народов, проживающих на Северном Кавказе. Всего протестировано 1059 пациенток из Кабардино-Балкарии, Северной Осетии, Чечни, Ингушетии, Карачаево-Черкессии, Дагестана, а также пациенток армянского происхождения из Ставропольского края и Краснодарского края. Соотношение между повторяющимися и уникальными патогенными вариантами BRCA1/2 было исключительно высоким во всех изученных этнических группах, составляя от 59% у пациенток из Северной Осетии до 82% у кабардинцев. Некоторые повторяющиеся мутации были специфичными для отдельных народностей (BRCA1 c.3629_3630delAG, BRCA2 c.6341delC, BRCA1 c.2907_2910delTAAA, BRCA2 c.5351dupA, BRCA2 p.Leu1686Ter, BRCA2 c.993_994delAA, BRCA2 p.His2623Arg, BRCA1 c.2649_2650insGGCA, BRCA2 c.2808_2811delACAA, BRCA1 c.66dupA). Отдельный фрагмент этой части проекта был направлен на сравнение спектров патогенных аллелей BRCA1/2 у пациенток-армянок, проживающих на юге России, и пациенток из Еревана. В частности, у пациенток из Еревана самым частым аллелем являлся BRCA1 p.Trp1815Ter. Этот патогенный нонсенс-вариант ни разу не встретился в серии пациенток-армянок, проживающих в России. Был завершен анализ образцов ДНК пациенток татарского и башкирского происхождения. Самыми частыми патогенными аллелями у представителей этих этносов являлись BRCA1 5382insC, BRCA1 Q1721X, BRCA2 c.-39-1_-39delGA, BRCA2 c.468dupT. Вариант BRCA2 c.-39-1_-39delGA затрагивает регуляторную последовательность – сплайc-сайт 5’UTR – и описан нами у татар и башкир впервые. Мы также провели небольшое исследование т.н. «северных» русских – жителей Архангельской области. По мнению некоторых авторов, они представляют собой особую популяцию, которая генетически близка не только к славянам, но и к балтам и к финно-угорским народам. Мы проанализировали кодирующие последовательности BRCA1/2 у 206 больных РЯ и РМЖ из Архангельской области и обратили внимание на относительно высокую частоту повторяющихся патогенных вариантов BRCA2. При этом нонсенс-мутация BRCA2 c.5286T>G [Y1762X; rs80358754] достоверно чаще встречалась у больных РМЖ/РЯ из Архангельской области по сравнению с другими регионами (8/18 (44%) носителей BRCA2, проживающих в Архангельской области, vs. у 13/574 (2.3%) пациенток из других регионов России (p < 0.0001)). Анализ других известных РМЖ-ассоциированных генов позволяет предполагать наличие founder-эффекта в отношении мутаций в гене RAD51D у пациенток бурятского происхождения. Еще одной из задач проекта является поиск новых генов наследственного РМЖ и/или РЯ с помощью полноэкзомного секвенирования наиболее демонстративных случаев РМЖ и РЯ, в которых не было обнаружено известных мутаций. На сегодня проанализировано 43 экзома неславянских пациенток (первично-множественный рак в сочетании с РМЖ: n = 6, отягощенный и/или ранний РМЖ: n = 30; РЯ: n = 7) и выбрано 9 наиболее перспективных потенциально патогенных вариантов EME2, CHEK2, ATMIN, FANCD2, GREB1, ADPRHL2, APEX2, BRAT1, PARP4. Для отобранных вариантов на следующем этапе проекта будет определена частота в соответствующем этноспецифическом популяционном контроле. Кроме того, мы сопоставили эти находки с имеющимися у нас экзомами больных РМЖ и РЯ славянского происхождения и на следующем этапе проекта протестируем в расширенных группах славянских пациенток с РМЖ и РЯ кодирующие последовательности генов, транкирующие варианты в которых были обнаружены в обоих массивах данных. Кроме того, были продолжены работы, направленные на изучение молекулярного патогенеза BRCA1/2-ассоциированных карцином. В отчетном году мы верифицировали наблюдения прошлого этапа, пополнив коллекции опухолевых образцов с информативными профилями хромосомной нестабильности. Так, было показано, что паттерны соматических нарушений копийности характеризуются органоспецифичностью в BRCA1/2-ассоциированных карциномах. При этом, достоверных отличий между РМЖ и РЯ с нестабильностью по типу дефицита гомологичной рекомбинации без герминальных мутаций BRCA1/2 обнаружено не было.