Аннотация результатов, полученных в 2021 году
Предложено решение задачи молекулярной диагностики на основе эффективного подбора кандидатных аптамеров-полипептидных маркеров, выступающих патогномоничными маркерами и представляющих диагностический интерес патофизиологических состояний. Предложена методика и алгоритм отбора полипептидных аптамеров длиной порядка 8 – 40 аминокислотных остатков, включающие: 1) Автоматизированный поиск белков, связывающихся с представляющим диагностический интерес маркерным белком, в открытых базах данных протеомной информации; 2) Автоматизированный поиск структурной информации в открытых базах структурной информации, с классификацией на: (а) содержащие полную структурную информацию, включая результаты рентгеноструктурного анализа связанных белковых комплексов, подтвержденную в экспериментальных исследованиях; (б) содержащие частичную структурную информацию, включая результаты рентгеноструктурного анализа отдельных связывающихся белков, подтвержденную в экспериментальных исследованиях; (в) содержащие частичную структурную информацию, включая результаты предсказания структур связывающихся белков, не подтвержденную в экспериментальных исследованиях; (г) содержащие только информацию о первичных структурах связывающихся белков. 3) На основании анализа вышеперечисленной информации формируется набор кандидатных аптамеров: – Для группы (а) на основе анализа олигопептидов длиной 8 – 40 аминокислотных остатков, являющимися фрагментами белка, связывающегося с представляющим диагностический интерес маркерным белком, производится поиск кандидатных аптамеров, для которых рассчитываются силы взамодействия с маркерным белком; – Для группы (б) определяется их пространственная комплементарность методом геометрического совмещения экспериментально показанных трехмерных структур полипептидов на основе аффинных и проективных преобразований плоскости, а также комбинированных методов совмещения c применением корреляционно-экстремальных алгоритмов, по результатам которого выполняется поиск, аналогично сценарию (а); – Для группы (в) определяется их пространственная комплементарность методом геометрического совмещения предсказанных показанных трехмерных структур полипептидов, с дальнейшими действиями аналогично сценарию (б); – Для группы (г) выполняется моделирование структур связывающихся полипептидов методами молекулярного докинга, с дальнейшими действиями согласно сценарию (в). По результатам формируется набор кандидатных аптамеров, состоящих из фрагментов полипептидов, взаимодействующих с представляющим(и) диагностический интерес маркерным(ы) белком(ами), ранжированный по оценке силы белок-белкового взаимодействия, с учетом весовых коэффициентов, определяемых степенью доказательности взаимодействия, с последовательным уменьшением весовых коэффициентов от (а) до (г); при этом конкретные значения весовых коэффициентов предполагается уточнить в ходе дальнейших поисковых исследований. За исключением случая (а), соответствующего наличию экспериментально подтвержденных пространственных структур полипептидных комплексов, которых в общем случае может оказаться недостаточно для реализации линейки диагностических инструментов, решение поставленной задачи требует разработки методов и алгоритмов геометрического совмещения экспериментально показанных трехмерных структур полипептидов. Для решения указанной задачи предлагается следующий подход: – Представление структур взаимодействующих полипептидов в виде объемных структур, узлы которых располагаются в координатах расположенных на поверхности атомов, ребра соответствуют прямым линиям между атомами, а поверхность структуры представлена полигонами, ограниченными указанными ребрами. Таким образом, задача сводится к поиску всевозможных геометрических совмещений полигонов на основе аффинных и проективных преобразований плоскости и расчету сил взаимодействия при каждом взаимном положении. Для оптимизации вычислительной сложности алгоритмов предполагаются следующие меры: – Использование загрубленных моделей с уменьшенным количеством вершин и полигонов для первичного поиска потенциальных точек связывания с расширенным набором исходных точек поиска, с дальнейшим допоиском в зонах интереса на основе уточненных моделей; – Использование фильтров по геометрическим свойствам фигур, априорно исключающим комбинации, при которых невозможно достижение одновременной геометрической близости, достаточной для обеспечения устойчивого связывания более чем в 2-х точках; – Использование комбинированных методов совмещения c применением корреляционно-экстремальных алгоритмов, включая метод градиентного спуска. В результате работы по проекту были исследованы существующие подходы к построению классификаторов объектов на основе визуальных данных. Исследование наиболее перспективных из них выявило тенденции и преимущества глубоких свёрточных сетей для решения этих проблем. Тем не менее и несмотря на достигнутый существенный прогресс в этой области, существуют фундаментальные причины возникновения ошибок в любых системах подобного рода при условии, что их состояние имеет достаточно большую размерность. Более того, такие ошибки могут превалировать с ростом размерности пространства признаков. С другой стороны, использование систем классификации объектов на практике сталкивается с необходимостью миниатюризации и использованием устройств малой мощности и производительности, а также и переход к целочисленной арифметике или арифметике пониженной точности как, например, в изделиях Nvidia Jetson Nano и Edge TPU от Google. Это приводит к неизбежности ошибок в реальных системах обнаружения объектов и как следствие к необходимости выработки систематического подхода к их устранению как на этапе обучения, так и на этапе функционирования уже функционирующих систем. С учетом выявленных особенностей, были предложены методы и алгоритмы, позволяющие реализовать непрерывное онлайн-обучение с априорными гарантиями и оценками на качество финальной системы. Предложенные методы, и алгоритмы применимы в рассматриваемой предметной области для широкого класса классификаторов, включая глубокие нейронные сети. Основное отличие предложенных инструментов от известных подходов в данной области заключаются в том, что вычислительная сложность результирующих алгоритмов оказывается сублинейной по размеру данных, а реальные затраты на реализацию существенно уменьшаются.

Аннотация результатов, полученных в 2022 году
1. Предложена комплексная методика извлечения структурной информации и анализа взаимодействия полипептидов на ее основе разнородных данных, извлекаемых из информационных баз биотехнологической информации. Разработан алгоритм и реализован программный модуль для совмещения и последующего анализа комплексов полипептидов, включающих как белковые молекулы – лиганды, так и полипептиды – аптамеры, либо их прототипы. 2. На основании анализа разнородной структурной информации формируется набор кандидатных аптамеров путем выделения олигопептидов длиной 8 – 40 аминокислотных остатков, являющимися фрагментами белка, взаимодействующего с представляющим диагностический интерес маркерным белком, производится поиск кандидатных аптамеров, для которых рассчитываются силы взаимодействия с маркерным белком. При этом в отсутствии полной структурной информации определяется их пространственная комплементарность методом геометрического совмещения экспериментально показанных трехмерных структур полипептидов на основе аффинных и проективных преобразований плоскости, а также комбинированных методов совмещения c применением корреляционно-экстремальных алгоритмов. По результатам формируется набор кандидатных аптамеров, состоящих из фрагментов полипептидов, взаимодействующих с представляющим диагностический интерес маркерным белком, ранжированный по оценке силы белок-белкового взаимодействия, с учетом весовых коэффициентов, определяемых степенью доказательности взаимодействия. 3. Предложены варианты оптической схемы регистрации, оптимизированной для малых потоков вторичного излучения связанных белков – биомаркеров. Определена оптимальная методика нанесения однородного переизлучающего слоя твердотельного люминофора по поверхность стеклянной подложки – механическое распыление на клейкую поверхность. Предложен конструкторско-технологический метод увеличения апертуры приема, основанный на применении микролинз, сформированных методом термокомпрессионного литья. 4. Создан набор пептидных аптамеров, оптимизированных для повышения чувствительности детектирующей системы. На примере пептида для Тропонина Т без ароматических аминокислот продемонстрировано снижение фоновой флуоресценции по сравнению с исходной последовательностью. Синтезированы пептиды и их модификации для миоглобина и миелопероксидазы, а также исходный пептид для лактоферрина. На основе анализа пространственной структуры целевых маркерных белков с целью расширения списка тестируемых компонентов были исследованы структуры белков: лактоферрина, лептина и С-реактивного белка, к ним предложены последовательности для создания селективных зондовых пептидов. 5. Протестирован набор пептидных аптамеров на целевых белках с помощью системы оптического детектирования и стандартных лабораторных методик. На примере тропонина Т продемонстрировано снижение предела детектирования с 6,5 нг/мл до 1,35 нг/мл за счет повышения объема пробы. Общее время анализа с помощью разработанной биосенсорной системы, включая пробоподготовку, составило около 8 минут. Для расширения набора пептидных аптамеров для определения маркерных белков на данном этапе были синтезированы последовательности, комплементарные к миоглобину, миелопероксидазе и лактоферрину. С помощью микротермофореза удалось определить последовательности, селективно связывающиеся с миоглобином и мономером миелопероксидазы, а капиллярный электрофорез позволил уточнить связывание лактоферрина с предложенным к нему пептидом. 6. Создан и протестирован лабораторный прототип мобильной аналитической системы с линейкой одноразовых микрофлюидных чипов для диагностики с использованием технологий формирования микрофлюидной системы с помощью пленочного фоторезиста и прецизионной лазерной абляции полимерного материала.

Аннотация результатов, полученных в 2023 году
Предложена методика, разработаны и программно реализованы алгоритмы тестирования потенциальных диагностических решений на основе in silico моделирования взаимодействия диагностического лиганда с целевым маркерным белком и набором неспецифических белков, потенциально присутствующих в предполагаемой пробе. Проведен компьютерный поиск пептидных последовательностей, пространственно комплементарных к целевым белкам – маркерам неинфекционных заболеваний в направлении расширения размерности диагностической панели путем добавления маркеров воспаления и окислительного стресса. Исследование пространственных структур заданных белков проводили с помощью базы данных RCSB Protein Data Bank (RCSB PDB), и затем с помощью программы Protein D выполняли атомно-молекулярный дизайн пространственно-комплементарных протеомных структур, однозначно определяемых последовательностями аминокислотных остатков в олигомерных пептидных цепях. Проведен анализ структуры белков, представляющих интерес с точки зрения диагностики воспалительных процессов и окислительного шока. C помощью визуализатора белковых структур Protein 3D, осуществлен анализ пространственной структуры областей контакта субъединиц упомянутых выше маркерных белков, выделены комплементарные участки в этих областях и на основе критерия образования ССИВС проведена оценка их перспективности для получения комплексов «целевой белок–аптамер». На основе проведенного анализа предложены пептидные фрагменты для шести белков (цитохром P450, каталаза, фактор некроза опухоли – альфа, сиртуин-1, интерлейкин-6, белок теплового шока 70), пригодные для апробации их использования в качестве якорных группировок (лигандов) микрочипов, для детектирования маркерных белков в биологических жидкостях. С целью уточнения мест пришивки ножки (линкера) к предложенным пептидным фрагментам, с помощью программы Protein 3D проведен структурный анализ взаимодействия маркерных белков с предложенными аптамерами и на его основе внесены соответствующие предложения. Ведется синтез указанных шести пептидов. Выполнены экспериментальные исследования in vitro связывания белков для верификации предиктивных алгоритмов, основанных на предложенных моделях 3D представления белков и предварительных оценок их взаимодействия, полученных in silico. Оценку взаимодействия миелопероксидазы с аптамерами проводили с помощью микромасштабного термофореза (MST) и поверхностного плазмонного резонанса (SPR). Были разработаны топологии микрофлюидных чипов с 2 и 4 распознающими площадками, на которые можно иммобилизовать различные пептидные аптамеры, обладающие селективностью к определенным белкам. Исследована химическая устойчивость различных защитных покрытий из полимерных материалов, в которых с помощью лазерной резки создаются отверстия для иммобилизации аптамеров. В разработанные топологии биочипов интегрированы планарные фильтрационные ловушки, позволяющие удалять из пробы крупные клетки крови, являющиеся источником паразитной флуоресценции. Исследована эффективность разных геометрий и размеров фильтров. Проведено тестирование связывания целевых белков (сердечного тропонина T и лактоферрина) с иммобилизованными на чипе пептидными аптамерами с помощью детектирования собственной флуоресценции белков. Определены концентрационные зависимости и пределы детектирования для каждого белка в одиночных и смешанных растворах. Рассмотрена возможность реализации альтернативного метода детектирования на основе импедиметрического сенсора с наностержнями оксида цинка. Продемонстрирована работоспособность безметочного импедиметрического биосенсора для обнаружения антител с помощью электродов, покрытых наностержнями ZnO, синтезированными методом спрей-пиролиза. Предложена архитектура экспертной системы для автоматизированной разработки мультипараметрических диагностических биочипов, включающая в себя модель мультипараметрического биочипа, в котором каждый канал отвечает за специфический маркер. Поскольку по результатам моделирования взаимодействия in silico и экспериментальных исследованиях in vitro было показано, что специфичность связывания отдельных аптамеров оказывается потенциально недостаточной для однозначного определения патогномоничных маркеров, предполагается построение мультипараметрических биочипов с комплексированием результатов диагностики по отдельным аптамерам в различных каналах. Кандидатные аптамеры при этом выбираются в соответствии с методикой, описанной в п.1, по критерию наибольшей диагностической комплементарности с использованием стандартных статистических критериев включения признаков в множественную диагностическую модель. Первичный отбор кандидатных аптамеров взаимодействующих с заданными целевыми маркерными белками осуществляется на основе анализа данных различных экспериментальных исследований, содержащих структурную информацию о формируемых комплексах. Предпочтение отдается кандидатным аптамерам, взаимодействующим с различными участками целевых белков. Для поиска конкретных участков взаимодействия выполняется анализ взаимодействий как с использованием как автоматизированного инструментария поиска и построения сетей ССИВС https://proteintools.uni-bayreuth.de/, так и оригинального программного инструмента ProteinTools. Для выбранного набора кандидатных аптамеров выполняется первичная оценка чувствительности и специфичности взаимодействия in silico согласно методике, описанной в п. 1. На основе результатов моделирования взаимодействия формируется сокращенный перечень кандидатных аптамеров. Для выбранного сокращенного перечня кандидатных аптамеров выполняется химический синтез и анализ взаимодействия in vitro с использованием экспериментальных методик (ICT, MST, SPR), описанных в п. 2. По результатам экспериментальных исследований выполняется уточненная оценка показателей эффективности (чувствительности, специфичности, общей диагностической точности, положительной и отрицательной предсказующей ценности), при достижении целевых показателей выполняется конструирование и прототипирование мультипараметрического биочипа. Предложены пути дальнейшего повышения диагностической эффективности может быть построено на комплексировании результатов диагностики с использованием различных целевых маркерных белков на основе единого комплексированного или линейки мультипараметрических биочипов по аналогичным принципам.