КАРТОЧКА ПРОЕКТА,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

НазваниеХимическая сборка новых типов координационных соединений с ионами Zn, Cu, Ag, Au для создания активных компонентов лекарств с высокой противоопухолевой активностью: от in vitro до in vivo

РуководительЕременко Игорь Леонидович, Доктор химических наук

Организация финансирования, регионфедеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт общей и неорганической химии им. Н.С. Курнакова Российской академии наук, г Москва

КонкурсКонкурс 2022 года «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований отдельными научными группами»

Аннотация
Представляемый проект направлен на разработку новых эффективных методологий биологически активных комплексов d-металлов, содержащих ионы Zn, Cu, Ag, Au с полидентатными S-, O-, N-лигандами и проявляющих противоопухолевые и/или антибактериальные свойства. Для определения избирательности действия, полученной в результате синтетических разработок библиотеки биоактивных молекул, предполагается широкое тестирование потенциальных противоопухолевых агентов in vitro на клеточных линиях сигнальных опухолей человека (рака молочной железы T47D/E2/ERα+; SKBR3/HER2/c-erb-2; немелкоклеточного рака легкого L858R/wild-type EGFR; A549/DSCR1, VEGF, PCNA, Bax, и Bcl2; рака яичников SKOV3/ER+/mRNA; рака толстой/ободочной кишки HCT116/TGF beta 1,2/mutation KRAS/13; HT-29-DsRed/RFP; SW620/CD133+;–) с последующим тестированием активных образцов in vivo на перевиваемых опухолях мышей и человека под контролем «острой» токсичности. Для прогноза перспективности продвижения в клинику отобранных агентов будет выполнено in vitro сравнение по уровню активности c известными препаратами платины. Известно, что в медицинской практике достаточно активно используются металлсодержащие препараты, причем в первую очередь платину содержащие лекарства, которые демонстрируют хорошие противораковые свойства. Однако в последние два десятилетия химики, биологи, медработники и другие исследователи стали направлять свои усилия на развитие синтетических путей и различного рода биологических исследований «неплатиновых» противоопухолевых агентов на основе био-эссенциальных (жизненно важных) металлов Сu, Zn, Fe, Co и др. [10.1039/C3CC41143E, 0.1002/ardp.200600151, 10.2147/DDDT.S119488, 10.1016/j.jinorgbio.2020.111213]. Можно полагать, что такой поворот в поисковых работах исследователей связан с несколькими причинам, во-первых, с поиском более дешевых препаратов, а во-вторых, с уменьшением токсических свойств лекарств. Конечно, здесь следует учитывать также технологические проблемы производства платину содержащих веществ, способы выбора и свойства органических лигандов для получения таких соединений (например, в некоторых противораковых соединениях присутствуют различного рода оптически активные органические компоненты, синтез и очистка которых весьма трудоемки) и ряд других ограничений. С другой стороны, нельзя сбрасывать со счетов и соединения с антипролиферативными (направлены на подавление избыточного размножения клеток) свойствами, например, комплексы Ru, Ga, Au [10.3390/ijms17111818, 10.2147/DDDT.S119488, 10.1021/cr0781059, 10.1016/j.ccr.2009.02.019]. Ранее, проведенные нами исследования [10.1002/slct.202003101; 10.31857/S0132344X20060055; 10.31857/S0132344X20110109; 10.31857/S0132344X2012004X; 10.1016/j.poly.2021.115241] комплексов с эссенциальными металлами и анионами пирослизевой кислоты в совокупности с N-донорными лигандами показали в ряде случаев высокую биологическую активность против штаммов M. smegmatis и M. tuberculosis. Кроме этого, нами было обнаружено, что биологически активный комплекс [Cu(fur)2phen] [10.31857/S0132344X20060055] в отношении непатогенного и патогенного микобактериальных штаммов (МИК = 2 нмоль/диск для M. smegmatis; 2.5 мкМ/мл - М. tuberculosis H37Rv) также показывает высокую биологическую активность против раковой линии аденокарциномы яичника (SCOV3) (4 мкмоль, в отличие от цисплатина – 10 мкмоль). Такой же высокий противоопухолевый эффект показывают и другие комплексы с одновременно низкими значениями IC50 (например, комплексы Сo, Fe, Mn). Таким образом, цель проекта заключается в разработке новых способов химической сборки координационных соединений Zn, Cu, Ag, Au с органическими лигандами и подбор такой комбинации металл–лиганд, при которой противоопухолевая активность будет выраженной, а цитотоксичность наименьшей. С этой точки зрения будут синтезированы соединения d-металлов в качестве комплексообразователей и в совокупности с различными органическими лигандами будут установлены (на основе строения, физических и физико-химических характеристик) факторы, обусловливающие проявление биологической активности комплексом. При этом стратегия исследования будет определяться тем, что создание мишень-ориентированных координационных соединений d-металлов невозможно без понимания факторов, формирующих характер их взаимодействия с клеткой патогена. К числу таковых относятся физические, химические и биологические свойства как самих металлов-комплексообразователей (природа, электронные характеристики), органического окружения, так и готового комплекса в целом. Соответственно, при конструировании соединений с последующим их тестированием in vitro на различных раковых линиях будут учитываться следующие свойства комплекса: его архитектура, устойчивость/лабильность в растворах (глюкозы, физиологическом растворе, фосфатно-буферной смеси и др), термостабильность, растворимость в различных средах, валентные и координационные возможности комплексообразователя, варьирование степеней окисления, спиновое число, кислотно-основные свойства, жесткость и мягкость пары лиганд-комплексообразователь и др. Корреляционный анализ биологической активности позволит не только выявить наиболее активные комплексы, сделать выводы о влиянии типов лигандов, их координации на эффективность проявления противоопухолевых свойств, но и выйти на возможные биологические мишени (мембраны, белки, ДНК), которые активируются/инактивируются под давлением комплексов. Проведение исследований в данном направлении, на наш взгляд, внесет вклад в решение фундаментальной проблемы современной медицинской химии – создание стратегии конструирования препаратов противоопухолевой направленности с новыми механизмами действия на основе координационных соединений.

Ожидаемые результаты
С момента открытия противораковых свойств цисплатина [PtCl2(NH3)2] (1978 г, B. Rosenberg) и его одобрение для использования человеком в качестве противоракового агента в медицинской неорганической химии, стало одним из самых важных направлений исследований [10.1021/ed083p728, 10.1039/C3CC41143E]. По мнению ведущих специалистов нашего времени, использование металлсодержащих препаратов в терапии рака предоставляет возможности, недоступные для индивидуальных органических молекул. Несмотря на впечатляющий успех широко применяемых в лечения рака препаратов платины (цисплатина, карбоплатина, оксалиплатина) и новых органометаллических комплексов платины (недоплатин, лобаплатин, гепаплатин и др), поиск новых биологически активных координационных соединений не теряет актуальности в рядах других металлов (Zn(II), Co(II), Cu(II) и т.п.) с органическими лигандами [10.1016/j.ejmech.2021.113404, 10.2147/DDDT.S119488, 10.1016/j.jinorgbio.2020.111213]. Требуется современный методический подход к отбору агентов не только со значимой специфической активностью, но и с избирательным действием на конкретные биомишени, определяющими избирательность поражения опухолевых клеток. Такие агенты демонстрируют благоприятные профили активности и более низкие побочные эффекты по сравнению с известными клиническими препаратами платины. Несмотря на прогресс, достигнутый за последнее время в этой области [10.1039/C5DT02211H, 10.1002/aoc.2988, 10.1039/B921019A, 10.1039/D0DT03566A], конструирование и применение комплексов не-платитновых металлов противоопухолевой направленности все еще находятся в перспективной стадии исследования. Но уже очевидно, что металлсодержащие кандидаты Au, Ag, Zn, Cu являются перспективными, поскольку способны воздействовать помимо ДНК сразу на несколько мишеней, в частности, на регуляторные белки, в т.ч., мембранные, пролиферативные ферменты и т.п. [10.1016/j.bmc.2020.115880, 10.1016/j.reprotox.2016.11.004]. В данном проекте предполагается развитие общей стратегии направленного химического конструирования координационных соединений d-металлов (Zn2+, Cu2+, Ag+, Au3+) с различными O-, S-, N-органическими лигандами (фуран-, тиофен-, индолкарбоновыми кислотами, фенантролиновыми и пиридиновыми лигандами и др), что представляет научный интерес для биокоординационной химии, медицинской химии, химиотерапии, биохимии, генетики, микробиологии. Использование разных металлов-комплексообразователей, различного типа органических лигандов и ко-лигандов, варьирование их числа, а также условий комплексообразования позволит выделить группы координационных соединений и выявить у них особенности строения, ответственные за наличие противоопухолевых свойств. На основании структурных, спектральных, термических и электрохимических данных, а также результатов биохимических испытаний на биоактивность в отношении аденокарциномы яичника, рака молочной железы, рака яичника, T47D/E2/ERα+; SKBR3/HER2/c-erb-2; немелкоклеточного рака легкого L858R/wild-type EGFR; A549/DSCR1, VEGF, PCNA, Bax, and Bcl2; рака яичников SKOV3/ER+/mRNA; рака толстой/ободочной кишки HCT116/TGF beta 1,2/mutation KRAS/13; HT-29-DsRed/RFP; SW620/CD133+;–) будет изучено влияние лиганда, природы комплексообразователя на биоэффективность. Построение корреляционных зависимостей «структура-свойства-биологическая активность» позволит сформулировать принципы химической сборки молекул с целью поиска противоопухолевых координационных соединений d-металлов. Кроме того, получение мишень-ориентированных металлокомплексов будет сопровождаться современным биоконтролем с использованием значимых опухолевых моделей. Совершенно очевидно, что дальнейшие исследования в этой области, в особенности поиск новых противораковых свойств координационных соединений, изучение фундаментальных взаимосвязей «структура-активность», формулирование принципов рационального дизайна биологически активных комплексов, а также разработка удобных масштабируемых способов получения таких соединений важны как с фундаментальной, так и прикладной точек зрения. Актуальность подобных разработок в нашей стране определена Президентом РФ (Указ Президента РФ № 642 от 1.12.2016 г.) в предложенной «Стратегии научно-технологического развития Российской Федерации».

Аннотация результатов, полученных в 2022 году
Синтезированы карбоксилатные моно- и биядерные комплексы Au(III), Ag(I), Cu(II), Zn(II) и Mg(II) c различными органическими кислотами (2- и 3-фуранкарбоновые, 2- и 3-индолкарбоновые, 5-нитро-2-фуранкарбоновая и трифторметансульфоновая) с фенантролиновыми лигандами (1,10-фенантролин (phen), 2,9-диметил-phen (neoc), 5-нитро-phen (5NO2-phen)): (H2phen)[AuCl4]Cl (1), [Cu(fur)2(neoc)] (2), [Zn(fur)2(phen)] (3), [Zn(phen)3]∙2otf∙EtOH (4), [Cu2(fur)4(5NO2-phen)2]·H2O (5), [Cu2(nfur)4(5NO2-phen)2]·MeOH (6), [Mg(H2O)3(3-ind)]∙2(3-Hind)∙phen∙H2O (7), [Ag(2ind)(NH3)] (8). Строение всех полученных соединений установлено методом РСА. Ионный комплекс 1 включает плоско-квадратный анион [AuCl4]‒, анион хлора и дважды протонированную форму молекулы phen – (H2phen)2+ (редкий случай для phen). Атомы H при N(1) и C(6) катиона (H2phen)2+ участвуют в образовании H-связей с атомом Cl(3), формируя бесконечную супрамолекулярную ленту вдоль оси 0b, при этом соседние цепочки связаны в псевдополимерный слой (hkl = 1, 0, -1) за счет C‒H…Cl контактов. Результаты биологических испытаний 1 в отношении тестовой линии аденокарциномы яичника SKOV3 показали хорошую токсичность для опухолевых клеток, чем для здоровых фибробластов (IC50 для SKOV3 и HDF составляет 27 μМ и >150 μМ, соответственно). Молекулярные комплексы 2 и 3 несмотря на однотипность молекулярного состава, формируют различные полиэдры {CuO2N2} (2) и {ZnO4N2} (3), в которых комплексообразователи реализуют координационные числа (КЧ) 4 и 6, соответственно. В ионном соединении 4, цинк бидентатно координирует три молекулы фенантролина (КЧ = 6), тогда как анионы otf- и молекулы этанола находятся во внешней координационной сфере. В биядерных комплексах 5 и 6 комплексообразователь Cu(II) формирует два полиэдра {CuN2O3}, соединенные между собой мостиковыми фуранкарбоксилатными группами. Наблюдаемое упрочнение связей Cu–N в 6 в сравнении с 5 на 0.265 Å является следствием проявления отрицательного индукционного эффекта NO2-групп в составе N-донорного лиганда. Устойчивость 5 и 6, проанализированная методом Uv-vis-спектроскопии путем регистрации электронных спектров поглощения в физиологическом 0.9% растворе NaCl в течение двух суток показала высокую стабильность обсуждаемых соединений при растворении. Моноядерный комплекс магния [Mg(H2O)3(3-ind)]∙2(3-Hind)∙phen∙H2O (7) представляет собой сольват, во внешней сфере которого располагаются молекулы phen, которые в конкурентной координации с молекулами воды не смогли сформировать ковалентные связи с комплексообразователем Mg2+. Неординарным представляется линейный комплекс серебра [Ag(2ind)(NH3)] (8), в котором комплексообразователь координирует по одной молекуле аммиака и фрагмент 2-индолкарбоновой кислоты. При этом дополнительную стабилизацию 8 на надмолекулярном уровне осуществляют взаимодействия между пи-ароматической системой кислоты с атомами серебра (2.985 Å). Взаимодействие ацетонитрилхлоридного комплекса Pt(II) с замещенными редокс-активными 1,4-диаза-1,3-бутадиенами в абсолютном метаноле привело к образованию трех новых дииминовых соединений Pt(II), являющиеся производными цис-платина - [(dpp-DAD)PtCl2] (9), [(Mes-DAD(Me)2)PtCl2] (10) и [(dpp-DAD(Me)2)PtCl2 (11). По данным ЯМР сигнал винильных протонов в спектре ЯМР 1Н 9 сдвинут в слабое поле по сравнению со свободным лигандом (8.81 и 8.11 м.д. соответственно). Кроме того, сателлиты из-за связи на ядрах 195Pt наблюдаются с 3J (1H, 195Pt) 91.4 Гц. В спектрах ЯМР 13С соединений 9 и 11 сигналы иминных атомов углерода также сдвинуты в слабое поле по сравнению со свободными лигандами на 3 и 8 м.д. соответственно. Сдвиг полосы поглощения в сторону меньших значений указывает на координацию двух атомов азота α-диимина. По данным РСА комплексы являются моноядерными, где центральный ион платины(II) координирует два Cl- и два атома азота α-дииминового фрагмента, образуя плоско-квадратное окружение, что весьма характерно для Pt2+. Электрохимическое восстановление 9-11 протекает в две последовательные катодные стадии - первый катодный пик является квазиобратимым и одноэлектронным, что указывает на образование моноанионных частиц, относительно стабильных в течение времени эксперимента; вторая стадия восстановления для комплексов 9-11 необратима, что свидетельствует об образовании нестабильного интермедиата. Высокая стабильность генерированных моноанионных комплексов и отсутствие пика реокисления хлоридов (1.40–1.50 В) на обратных развертках ЦВА, который может образовываться при восстановлении металлов, подтверждают участие лиганда в редокс процессах. Изучение антиканцерогенных свойств 9-11 методом МТТ на раковой линии аденокарциномы яичника человека SKOV3 показал высокую цитотоксичность комплекса 11 в отношении патологических клеток (IC50 = 12 μM), тогда как 9 и 11 оказались практически безопасными как для раковых (IC50 около 100 μM), так и здоровых фибробластов. Комплексы 2-4, 7, 8 были исследованы на противоопухолевую активность. Первый этап доклинических исследований противоопухолевых препаратов подразумевает тестирование цитотоксической активности (метод МТТ) на культивируемых in vitro опухолевых клетках человека SKOV3 (рак яичника), MCF7 (рак молочной железы) и A172 (глиобластома ЦНС). Наименьшую выживаемость раковых клеток различных тестовых линий показал комплекс 2. При этом процент выживаемости патологических клеток под действием других соединений намного выше, а для некоторых (3, 8) составляет практически 100 %. Дальнейший скрининг 2 и определение полумаксимальной ингибирующей концентрации (IC50) показал высокую цитотоксическую активность в отношении рака яичника SKOV3 – почти в 4 раза активнее CP, рака легкого MСF7 – в 12 раз и максимальную, в 2,3 раз эффективнее CP. Для определения предполагаемого пути гибели клетки под действием 2 был проведен эксперимент по окрашиванию плазматической мембраны. Апоптотические клетки можно отличить от некротических путем совместного окрашивания йодидом пропидия (PI), поскольку он проникает в некротические клетки, но исключается из апоптотических. Результаты исследования показали, что 2 индуцирует апоптоз в клетках. Комплекс 2, предварительно отобранный (in vitro) методом MTT продемонстрировал цитотоксичность в значимых пределах (IC50<10-4 M) и был подвергнут изучению противоопухолевой активности in vivo на перевиваемой опухоли (В16 меланома) на лабораторных мышах. В результате проведенного лечения 2 показал хорошую переносимость без гибели или патологической симптоматики параллельно с устойчивым и достоверным уровнем противоопухолевой активности на уровне ТРОmax=59; 77 и 68% (p=0,001–0,00005) в течение недели после отмены. Результаты показали, что на прогностически значимой солидной мышиной меланоме В16 комплекс 2 при однократном в/б введении в переносимых дозах проявил противоопухолевую активность, удовлетворяющую критерию скрининга (ТРО≥50%). Таким образом, по результатам 1 годы работы выявлено соединение-лидер, биологические испытания позволяют считать его отобранным для продолжения скрининга. Публикации по результатам первого года выполнения проекта: Согласно представленному плану на 2022 год, научный коллектив должен опубликовать в первый год работы над проектом одну статью, индексируемую WoS. По материалам настоящего отчета вышло 2 статьи, одна из которых является Q1. 1) Dmitriy S. Yambulatov, Irina A. Lutsenko, Stanislav A. Nikolaevskii, Pavel A. Petrov, Ivan V. Smolyaninov, Irina K. Malyants, Viktoriya O. Shender, Mikhail A. Kiskin, Alexey A. Sidorov, Nadezhda T. Berberova, Igor L. Eremenko. α-Diimine cisplatin derivatives: Synthesis, Structure, Cyclic 2 Voltammetry and Cytotoxicity // Molecules. 2022. (IF=4.927; Q1) 2) Луценко И.А., Лосева О.В., Иванов А.В., Мальянц И.А., Шендер В.О., Кискин М.А., Еременко И.Л. Антиканцерогенные свойства комплексов Au(III) // Коорд. Химия. 2022. (IF=1.814; Q3). Таким образом, план работ за первый год выполнения проекта можно считать успешно выполненным.

Публикации

1. Луценко И.А., Лосева О.В., Иванов А.В., Мальянц И.А., Шендер В.О., Кискин М.А., Еременко И.Л. Антиканцерогенные свойства комплексов Au(III) Координационная химия, 12, 48, 739-744 (год публикации - 2022)

2. Ямбулатов Д.С., Луценко И.А., Николаевский С.А., Петров П.А., Смольянинов И.В., Мальянц И.К., Шендер В.О., Кискин М.А., Сидоров А.А., Берберова Н.Т., Еременко И.Л. α-Diimine cisplatin derivatives: Synthesis, Structure, Cyclic 2 Voltammetry and Cytotoxicity Molecules, 27, 8565 (год публикации - 2022) https://doi.org/10.3390/molecules27238565