Аннотация результатов, полученных в 2022 году
1. Бимолекулярные константы скорости как функции размера нанозимов. На предыдущей стадии проекта был установлен механизм действия нанозимов «искусственная пероксидаза». Скорость-лимитирующей является стадия окисления комплекса нанозим-восстанавливающий субстрат пероксидом водорода (константа k2). Зависимость последней от диаметра нанозима линеаризуется в билогарифмических координатах с тангенсом угла наклона ~3.0. Таким образом, пероксид водорода одинаково хорошо реагирует с активными центрами, расположенными во всем объеме наночастиц. Такая зависимость для восстанавливающих субстратов (с ограниченной способностью проникать внутрь наночастиц) имеет тангенс наклона ~2.5. Для нанозимов с диаметром ~300 нм k2 для желтой кровяной соли достигает ~2·10^11 М-1с-1, для катехола ~2·10^10 М-1с-1. Эти значения на 3-4 порядка величины выше констант взаимодействия ферментов пероксидаз с Н2О2 и на 4-5 порядков выше констант скорость-лимитирующей стадии действия фермента. 2. Применение подходов предстационарной кинетики ферментативных реакций для исследования механизма действия нанозимов. Предстационарная кинетика для изучения катализа нанозимами ранее не применялась. Значения констант скорости псевдопервого порядка, найденные из наклона зависимости концентрации продукта от времени в начальный момент, линейно зависят от концентрации восстанавливающего субстрата. Кажущаяся бимолекулярная константа, найденная из их отношения, уменьшается до трех порядков при увеличении формального редокс-потенциала субстрата в пределах 0.25 В. Такое поведение константы подтверждает, что активность субстратов в катализе нанозимами «искусственная пероксидаза» существенно зависит от их восстанавливающей способности. 3. Заключительные исследования, посвященные синтезу сверхмалых нанозимов в обращенных мицеллах и их активности. В течение основного проекта были синтезированы сверхмалые нанозимы, диаметр которых (4-5 нм) практически совпадает с размером фермента пероксидазы. Модификация электродов берлинской лазурью путем нанесения суспензии наночастиц впервые позволила оценить долю электроактивного материала модифицированных электродов. Как оказалось, доля электроактивной берлинской лазури в случае модификации сверхмалыми нанозимами (93%) прекрасно укладывается на полученную ранее зависимость. Таким образом, сверхмалые наночастицы, полученные методом темплатного каталитического синтеза берлинской лазури, позволяют проверять и дополнять размерные зависимости физико-химических свойств нанозимов «искусственная пероксидаза». По синтезу и каталитическим свойствам сверхмалых нанозимов подготовлена и опубликована статья в журнале Bioelectrochemistry (Q1; IF = 5.76). 4. Создание твердоконтактных ионселективных амперометрических сенсоров на K+/Na+. Ранее в рамках проекта нами была предложена проточно-инжекционная амперометрия как альтернатива потенциометрии для твердоконтактных ионселективных электродов. Берлинская лазурь обладает селективностью к ионам калия, отклик на них в 2.5 - 4 раза выше, чем на ионы натрия. Селективности к ионам натрия (kNa/K = 1.5 - 5) удается добиться нанесением дополнительной натрий-селективной мембраны на основе ионофора-6, понижающей чувствительность к ионам калия на порядок. С другой стороны, калий-селективные мембраны на основе валиномицина приводят к улучшению как чувствительности, так и селективности к ионам калия. Преимущество проточно-инжекционной амперометрии с наночастицами берлинской лазури в качестве твердого контакта, недостижимое в потенциометрии, это независимость отклика от pH. Предложен одностадийный метод изготовления сенсоров, при котором наночастицы берлинской лазури вносятся непосредственно в смесь для формирования ионоселективной мембраны. Для сенсоров на основе такой, композитной, мембраны чувствительность к ионам калия оказалась в 5 раз выше и не зависела от задаваемого потенциала. 5. Биосенсоры для непрерывного мониторинга лактата в поте на основе дополнительной диффузионно-лимитирующей мембраны. Ввиду необходимости детектировать высокие концентрации лактата (содержание в поте от 4 мМ до 60 мМ в норме и до 60 мМ – 100 мМ при интенсивных физических нагрузках) биосенсор покрывался дополнительной отрицательно заряженной мембраной. Биосенсор с диффузионно-лимитирующей мембраной, содержащей 4 % перфторсульфонированного иономера, наиболее оптимален по аналитическим характеристикам: широкий диапазон (0.5 мМ – 500 мМ), достаточная чувствительность (0.11 ± 0.03 мА М-1 см-2) и высокая операционная стабильность (~100% начального отклика в течение 5 часов в 20 мМ лактата или 3 часа в потоке пота). Линейный диапазон такого биосенсора от 0.5 мМ до 100 мМ лактата перекрывает диапазон физиологических концентраций лактата как в поте, так и в крови человека. По результатам данного и следующего разделов опубликована статья в наиболее престижном аналитическом журнале: Analytical Chemistry (Q1; IF = 8.01). 6. Непрерывный мониторинг лактата в поте биосенсором с диффузионной мембраной в условиях гипоксии. Для неинвазивного мониторинга гипоксии разработанный лактатный биосенсор был интегрирован в проточный потосборник. Правильность работы монитора подтверждена независимым методом: коэффициент корреляции Пирсона >0.99. Один монитор помещали на поверхность кожи бедра (рабочая мышца), другой –предплечья (нерабочая мышца). Во время тренировки (приседания) здорового добровольца концентрация лактата в поте с работающей мышцы растет, а после окончания упражнений – довольно быстро снижается; динамика схожа с изменением концентрации лактата в крови. Напротив, содержание лактата в поте с неработающей мышцы существенно не меняется во время тренировки. Следовательно, содержание лактата в поте может служить индикатором гипоксии в ходе интенсивной физической нагрузки. 7. Создание систем для конденсации выдыхаемого воздуха в циклонном потоке. Предложена конструкция ячейки для конденсации выдыхаемого воздуха, использующая геометрию циклонных сепараторов. Содержание лактата в отбираемом конденсате находится в промежутке от 0.04 мМ до 0.25 мМ, содержание глюкозы - от 0.005 мМ до 0.2 мМ. Предварительное сравнение показывает, что конденсат, отобранный с использованием переохлаждения, содержит в десятки раз меньше ионов натрия (данные ИСП-МС) по сравнению с конденсатом, полученным при помощи предложенной ячейки. 8. Оценка антиоксидантной активности по каталитическому и некаталитическому поглощению пероксида водорода. Антиоксидантную активность (АОА) характеризовали константой скорости поглощения Н2О2. Показано, что наночастицы берлинской лазури не проявляют АОА. Кроме способности пищевых продуктов непосредственно восстанавливать Н2О2 (некаталитическая АОА), изучена и каталитическая АОА. В присутствии нанозимов АОА появляется даже для образцов, собственная некаталитическая АОА которых не регистрировалась. Каталитическая антиоксидантная активность не зависит от используемого сенсора, но зависит от исходной некаталитической антиоксидантной активности. 9. Подготовка публикаций в высокорейтинговых журналах. В течение этапа подготовлено и опубликованы статьи в журналах Bioelectrochemistry (Q1; IF = 5.76) и Analytical Chemistry (Q1; IF = 8.01). Получен патент на изобретение. Обзор в журнале Microchimica Acta (Q1; IF = 6.41) под заголовком «Берлинская лазурь: от наилучшего электрокатализатора до нанозимов, побеждающих природный фермент» резюмирует основные достижения проекта до настоящего времени. 10. Участие в конференциях. На международных и Всероссийских конференциях сделано 2 пленарных, 4 устных и 3 стендовых доклада. 11. Участие в конкурсах научных работ молодых ученых и студентов. Комкова М.А., Дабосс Е.В. и Андреев Е.А. стали лауреатами премии Правительства Москвы. Щербачева Е.В. награждена медалью РАН, а также стала победителем программы УМНИК. 12. Защита курсовых и дипломных работ студентами химического факультета МГУ. Под руководством участников проекта выполнены и защищены 2 дипломные и 5 курсовых работ.

Аннотация результатов, полученных в 2023 году
1. Ионоселективные электроды на основе наночастиц берлинской лазури в качестве твердого контакта Чувствительность самого твердого контакта в режиме проточно-инжекционной амперометрии возрастает с увеличением концентрации наночастиц берлинской лазури, достигая предела выше Γ(БЛ) = 2 нмоль/см2. Чувствительность калий-селективного электрода с мембраной, содержащей валиномицин, достигает 40-60 мкА/см2·М. Буфер Бис-Трис без катионов щелочных металлов позволил добиться селективности к К+ относительно Na+: lgk ≈ –2.5. Чувствительность натрий-селективных электродов на основе ионофора VI на порядок ниже (4±1 мкА/см2·М). Диапазоны линейности для обоих датчиков схожи: от 1×10^-6 до 1×10^-4 М. Преимущество проточно-инжекционной амперометрии над традиционной потенциометрией заключается в пониженных на 2 порядка пределах обнаружения, позволяя детектировать ионы в более широком диапазоне (1 мкМ – 10 мМ). Оба сенсора применимы для анализа биологических жидкостей: содержание Na+ на порядок выше, чем K+. Правильность работы созданных ионоселективных электродов подтверждена анализом контрольных сывороток крови. 2. Сенсоры на пероксид водорода, объемно модифицированные нанозимами «искусственная пероксидаза» на стадии трафаретной печати Для объемной модификации суспензии каталитически синтезированных наночастиц берлинской лазури различных концентраций вводили в углеродную пасту, использованную для печати рабочего электрода. Полученные сенсоры характеризовались значительно (до 6 раз) большим соотношением сигнал:шум. Предел обнаружения пероксида водорода после дополнительной обработки водно-изопропанольной смесью достиг 0.1 мкМ. На основе разработанных Н2О2 сенсоров изготовлены биосенсоры на глюкозу и лактат. Их пределы обнаружения оказались в 2-4 раза ниже по сравнению с биосенсорами, разработанными исполнителем ранее. Валидация биосенсоров также проводилась анализом контрольных образцов сыворотки крови. Объемная модификация на стадии печати существенно облегчает масштабирование и удешевляет (био)сенсоры при массовом производстве, а также позволит достигать более низких пределов обнаружения, важных для неинвазивной диагностики. 3. ДНК-сенсор с нанозимными электрокаталитическими метками На основе функционализированных азидо-группами нанозимов «искусственная пероксидаза» разработаны сенсоры на олигонуклеотиды. Эффективность применения нанозимов в качестве электрокаталитических меток показана на примере взаимодействия двух линейных ДНК-цепочек в диапазоне от 0.01 до 3 нМ; константа диссоциации Kd составляет 7.5±0.2×10^-10 М. Показана возможность дифференциации сигналов полностью комплементарных и частично некомплементарных (несоответствие 5 нуклеотидов) олигонуклеотидов. Разработан ДНК/РНК-сенсор «сэндвич»-типа. Последовательная гибридизация олигонуклеотида HULC с зондами на электроде, а затем с мечеными цепочками позволяет детектировать этот маркер карциномы в концентрациях от 0.2 до 100 нМ (Kd=2.8±0.2×10^-8 M). Методом введено-найдено показана возможность детекции HULC в сыворотке крови в наномолярных концентрациях. 4. Сравнение уровней глюкозы в поте и крови больных для неинвазивного мониторинга сахарного диабета Возможные нарушения потоотделения у больных сахарным диабетом диктуют необходимость, в первую очередь, исследовать у них скорость секреции пота. Установлено, что средняя скорость потоотделения больных (12 женщин и 10 мужчин) составляет 1.9±0.8 мкл/мин и 1.3±0.7 мкл/мин, соответственно, что примерно в два раза ниже, чем для здоровых добровольцев (3.3±1.7 мкл/мин). Однако такой скорости достаточно для непрерывного мониторинга проточными биосенсорами. Выявлена взаимосвязь между содержаниями глюкозы в поте и крови (статистика по 20 больным). Принципиально возможным неинвазивный контроль состояний гипо-/гипергликемии по анализу неинвазивно отбираемого пота делает наблюдаемое для одного и того же больного постоянство отношения концентрации глюкозы в крови к ее содержанию в поте вплоть до месяца. 5. Электроаналитическая система детекции компонентов аэрозоля на основе капиллярной конденсации Для детекции компонентов аэрозоля в момент выдоха электрохимические сенсоры на основе берлинской лазури адаптированы модификацией гигроскопичным электролитом (KF) и конденсирующим покрытием на основе оксида графена (ОГ). Их одновременное использование (≈6 мкмоль/см2 KF и > 15 мкг/см2 ОГ) обеспечивает наиболее быстрое достижение максимальной электроактивности катализатора (15 сек.) в ответ как на продувку модельным аэрозолем, так и на человеческий выдох. Установлено, что в режиме предварительной поляризации рабочего электрода при 0.65 В разработанная система обеспечивает детекцию пероксида водорода в диапазоне концентраций, охватывающем предполагаемый диапазон физиологических содержаний Н2О2 в аэрозоле (от 1 до 15 мкМ). Сигнал сенсора слабо зависит от скорости подачи аэрозоля в диапазоне скоростей выдоха. Таким образом, разработанная система применима для экспресс-детекции пероксида в выдыхаемом аэрозоле. 6. Система сбора выдыхаемого аэрозоля на основе смешения турбулентных потоков Проведена оптимизация конструкции ячейки для сбора аэрозоля: 1) направление потоков выхода воздуха и стока образца, 2) обработка неионогенным ПАВ (Triton X-100, SPAN-80, Tween-80), 3) установка обратного клапана. Вариация направлений потоков и модификация ПАВ не оказывают влияния на итоговый объем конденсата, обратный клапан его уменьшает. Оптимальным является сбор конденсата натощак в течение получаса. Кроме того, необходимо применение назального вдоха и исключение отбора образцов с внутренних стенок ячейки. Разброс значений ионной силы, оцененной из спектров электрохимического импеданса собранных у трех здоровых субъектов образцов, оставался в пределах статистической погрешности в течение нескольких недель. Это доказывает воспроизводимость разработанного способа сбора конденсата выдыхаемого аэрозоля. 7. Препараты двойного действия на основе нанозимов «искусственная пероксидаза» для снижения содержания активных форм кислорода (АФК) Синтезированы гибридные наночастицы на основе миРНК, ориентированных на подавление экспрессии онкогенного белка ганкирина (PSMD10), и нанозимов «искусственная пероксидаза», инкапсулированных в липидные оболочки. Каталитические константы скорости наночастиц берлинской лазури достигают значений ~2×10^3 с-1, что на порядок выше, чем для природного фермента. Сколковским институтом науки и технологий подтверждена эффективность разработанных гибридных наночастиц по двукратному снижению уровня АФК в опухолевых тканях, что обеспечивает двукратное увеличение эффективности противоопухолевого препарата. 8. Предстационарная кинетика действия нанозимов «искусственная пероксидаза» Методом остановленной струи показано, что при увеличении размера нанозимов начальная скорость их восстановления падает тем существеннее, чем выше редокс-потенциал субстрата. Последний также определяет полноту восстановления катализатора. Применение метода остановленной струи позволило оценить бимолекулярные константы скорости восстановления нанозима субстратом (k1): ~5×10^9 М-1·с-1 для желтой кровяной соли, ~6×10^8 М-1·с-1 для гидрохинона, что на порядок величины выше, чем константы скорости бимолекулярной реакции взаимодействия нанозим-субстратного комплекса с Н2О2 (скорость-лимитирующей стадии). По порядку величины найденные константы k1 согласуются с оценкой, проведенной ранее на основе данных стационарной кинетики (~10^9 М-1·с-1). 9. Опубликовано 9 статей (7 в журналах Q1), в том числе обзор в наиболее престижном в России: «Успехи Химии». 10. Участники проекта выступили на 3 Международных и 1 Всероссийской конференциях. Руководителем сделаны 3 пленарных доклада. 11. Участники проекта получили награды на 3-х научных конкурсах, в том числе первую премию Совета молодых ученых МГУ, стипендии Президента, стипендии для молодых сотрудников МГУ; студенты получили повышенные стипендии. 12. Под руководством участников научного коллектива защищены 5 курсовых работ.