Аннотация результатов, полученных в 2022 году
В соответствии с планом разработаны методы синтеза и наработаны различные исходные соединения, необходимые для синтеза новых конъюгатов. Разработаны методы синтеза конъюгатов пурина и 6-замещенных 3-метилбензоксазинов, соединенных линкерами различной длины – фрагментами омега-аминокислот. Синтез конъюгатов пурина с рацемическими бензоксазинами проводили исходя N-(омега-фталимидоалканоил)-3-метилбензоксазинов, используя последовательность реакций гидразинолиза и нуклеофильного замещения хлора. По такой же схеме получены индивидуальные (S)- и (R)-энантиомеры конъюгатов пурина исходя из соответствующих энантиомеров 3,4-дигидро-3-метил-2Н-[1,4]бензоксазина и 3,4-дигидро-3-метил-6-нитро-2Н-[1,4]бензоксазина. Разработаны методы анализа энантиомерного состава целевых соединений с помощью хиральной ВЭЖХ. Показано, что в процессе синтеза индивидуальных энантиомеров не происходит потери оптической чистоты целевых соединений. Новые N-(пурин-6-ил)-омега-аминоалкановые кислоты получены с умеренным выходом в результате нуклеофильного замещения хлора в 6-хлорпурине омега-аминокислотами. С целью увеличения растворимости и улучшения профиля цитотоксического действия N-[11-(пурин-6-иламино)ундеканоил]-3,4-дигидро-3-метил-7,8-дифтор-2H-[1,4]-бензоксазина разработан метод синтеза соединения, содержащего (2-гидроксиэтил)метильный фрагмент в положении 9 пурина. Целевое соединение получено с высоким выходом исходя из N-фталоилпроизводного путем ряда химических превращений; тем не менее, несмотря на наличие гидрофильного (2-гидроксиэтил)метильного фрагмента, оно оказалось плохо растворимо в воде. Новые конъюгаты 3,4-дигидро-3-метил-7,8-дифтор-2H-[1,4]бензоксазина с 2-аминопурином, 7-деазапурином и 2-аминопиримидином, содержащие в качестве линкера фрагмент 11-аминоундекановой кислоты, получены с умеренными выходами по реакции нуклеофильного замещения хлора в соответствующих производных. Проведена модификация синтезированных ранее биоактивных конъюгатов пурина с 3,4-дигидро-3-метил-7,8-дифтор-2H-[1,4]бензоксазином, присоединенным через фрагменты омега-аминокислот, путем окисления пуринового фрагмента мета-хлорнадбензойной кислотой; соответствующие N-оксиды получены с умеренными выходами. Были подобраны условия анализа энантиомерного состава полученных N-оксидов методом хиральной ВЭЖХ. Разработаны методы получения конъюгатов 7-хлорхинолина с 3,4-дигидро-3-метил-7,8-дифтор-2H-[1,4]бензоксазином, соединенным омега-аминокислотным линкером с различной длинной полиметиленового фрагмента. Разработаны методы синтеза сульфокислот исходя из 2-амино-4,6-дихлорпиримидина и 4,7-дихлорхинолина. Разработан метод синтеза конъюгатов 6-тиопроизводных пурина с (S)-глутаминовой кислотой. Строение всех синтезированных соединений подтверждено данными элементного анализа, хромато-масс-спектрометрии, спектроскопии ЯМР 1Н, 13С, 19F и 11B, ВЭЖХ (в том числе на хиральных неподвижных фазах), поляриметрии. Изучение противогерпетической активности 16 новых соединений в опытах in vitro проведено в Институте вирусологии им. Д.И. Ивановского ФГБУ «НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» МЗ РФ (Москва) на эталонным штамме вируса герпеса простого типа 1 (HSV-1/L2) и ацикловир-резистентном штамме HSV-1/L2/R. В качестве препаратов сравнения использовали ацикловир и фоскарнет. Наибольшей ингибирующей активностью в отношении HSV-1 обладают конъюгаты пурина и рацемических 3,4-дигидро-3-метил-2Н-[1,4]бензоксазинов, присоединённых через фрагменты омега-аминокислот; причем N-[8-(пурин-6-иламино)октаноил]-3,4-дигидро-3-метил-2H-[1,4]бензоксазин обладал и достаточно высокой избирательностью антивирусного действия (индекс селективности SI = 13). Также высокую избирательностью противовирусного действия проявили и другие конъюгаты пурина и 3-метилбензоксазина, а также конъюгаты 7-хлорхинолина с 3,4-дигидро-3-метил-7,8-дифтор-2H-[1,4]бензоксазином. Таким образом, в изученном ряду соединений вновь продемонстрирована обнаруженная нами ранее важная роль бензоксазинового фрагмента для проявления противовирусной активности синтезированных соединений. Противовирусная активность всех изученных соединений сохраняется в отношении варианта HSV-1, глубоко резистентного к действию ацикловира. Изучение ингибирующей активности полученных соединений в опытах in vitro проведено в Санкт-Петербургском НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера на эталонном штамме вируса гриппа A/Puerto Rico/8/34 (H1N1) и штамме вируса гриппа B/Florida/4/2006 (тест на подавление вирус-индуцированного цитопатического действия (ЦПД)) в культуре клеток MDCK. В качестве препарата сравнения использовали осельтамивир. Жизнеспособность инфицированных и здоровых клеток оценивали с помощью МТТ-теста. Наибольшей противогриппозной активностью обладали производные 7-хлорхинолина. В 2022 г. для выявления связи структура-активность в ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр имени Н.Н. Блохина» МЗ РФ (Москва) было продолжено изучение цитотоксической активности конъюгатов пурина и рацемического 3,4-дигидро-3-метил-7,8-дифтор-2H-[1,4]бензоксазина, соединенных фрагментами омега-аминокислот с различной длиной полиметиленовой цепи, и их структурных аналогов, синтезированных в 2022 г., в отношении опухолевых клеток человека и мыши, а также клеток нормальной ткани. Изучение противоопухолевой активности в опытах in vitro проводили с использованием МТТ-теста; в качестве препарата сравнения использовали Доксорубицин. Установлено, что конъюгат пурина и 3,4-дигидро-3-метил-7,8-дифтор-2H-[1,4]бензоксазина, присоединённый через фрагмент 11-ундекановой кислоты, обладает высокой цитотоксической активностью на большем количестве изученных клеточных линий по сравнению с другими конъюгатами, что делает его перспективным кандидатом для дальнейших исследований. Изучение цитотоксической активности специально синтезированных родственных соединений позволило сделать вывод о том, что для проявления цитотоксической активности важным является наличие как фрагмента пурина, так и дифторбензоксазина, соединенных линкером определенной длины. Исследования по получению клонов HSV-1, резистентных к соединению-лидеру, проведено в ФГБУ «НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России под руководством зав. лаб. молекулярного патогенеза хронических вирусных инфекций, к.б.н. В.Л. Андроновой. Получен штамм HSV-1, резистентный к соединению-лидеру, выделение и секвенирование ДНК этого штамма позволит выявить мутации и определить наиболее вероятные мишени действия соединения-лидера. Изучение механизма противоопухолевого действия некоторых из полученных соединений, включая их влияние на фазы клеточного цикла, проведено в Центре биологических исследований и биоинженерии ЦНИЛ Сибирского государственного медицинского университета (Томск). Для исследования цитостатического действия наиболее активного соединения, показавшего высокий цитотоксический эффект в культурах опухолевых клеток, выбран метод анализа клеточного цикла с использованием проточной цитофлуориметрии путем окрашивания ДНК йодистым пропидием. В исследовании использованы две клеточные линии: MDA-MB-231, продемонстрировавшая высокую устойчивость к действию вещества, и COLO201, проявившая самую высокую чувствительность среди всех тестируемых линий. Установлено, что N-[11-(пурин-6-иламино)ундеканоил]-3,4-дигидро-3-метил-2H-[1,4]бензоксазин блокирует синтез ДНК в клетках. В 2022 г. опубликовано 4 статьи в изданиях, индексируемых в международных базах данных и RSCI: 3 статьи в Известия АН, сер. хим. (IF 1,704) и 1 статья в журнале Molecules (IF 4,927, Q1). Результаты работ по проекту были представлены на 2-х международных конференциях в виде 1 стендового, 2х устных и 1 приглашенного докладов.

Аннотация результатов, полученных в 2023 году
В 2023 г. проведена химическая модификация выявленных ранее наиболее активных соединений с целью повышения специфической активности, установления связей структура-активность, увеличения биодоступности и улучшения других качеств, необходимых для создания лекарственных препаратов. Разработан подход к получению модифицированных нуклеозидов на основе 3,4-дигидро-3-метил-4-[11-(пурин-6-иламино)ундеканоил]-7,8-дифтор-2H-[1,4]бензоксазина путем введения в положение N9 пурина остатков сахаров в результате реакции трансгликозилирования, катализируемой пурин-нуклеозидфосфорилазой. Полученные модифицированные нуклеозиды лучше растворимы в воде, чем исходный конъюгат пурина, что позволяет предполагать их большую биодоступность. Разработаны методы синтеза конъюгатов 2-хлорпурина и 2-амино-6-хлопиримидина с 3,4-дигидро-3-метил-7,8-дифтор-2H-[1,4]бензоксазином, соединенным фрагментами омега-аминокислот с различной длиной полиметиленовой цепи. Изучены два синтетических подхода к получению конъюгатов пурина и 2-аминопурина с нидо-карборанилэтилендиамином. В результате реакций нуклеофильного замещения хлора в 6-хлорпуринах как под действием нидо-карборанилэтилендиамина, так и под действием нидо-карборанилглицина целевые продукты образовывались в следовых количествах. Возможной причиной низкой реакционной способности аминогруппы производных карборана является их существование в виде прочной внутренней соли, разложить которую под действием карбонатов щелочных металлов не удается. Это предположение подтверждено результатами квантово-химических расчетов (DFT). Синтезированы новые конъюгаты пурина и 2-аминопурина, содержащие по два остатка клозо- или нидо-карборана. Разработаны методы синтеза конъюгатов 6-меркаптопурина и 2-амино-6-меркаптопурина с 3-ацетамидо-нидо-карбораном. Разработаны методы синтеза конъюгатов 7-дихлорхинолина и 2-амино-6-хлорпиримидина с (S)-глутаминовой кислотой, присоединенной через остаток сульфокислоты. Разработаны методы получения энантиомерно чистых конъюгатов и методы контроля энантиомерной чистоты. В результате изучения противогерпетической активности 20 новых соединений в опытах in vitro в отношении эталонного штамма вируса герпеса простого типа 1 (HSV-1) и ацикловир-резистентного штамма установлено, что изученные соединения являются мало- или умеренно токсичными в отношении клеток Vero E6. Наибольшей ингибирующей активностью в отношении HSV-1 обладают конъюгаты 2-аминопурина и 7-деазапурина с рацемическим 3-метил-7,8-дифтор-3,4-дигидробензоксазином, присоединённым через остаток 11-аминоундекановой кислоты, причем оба соединения обладали высокой избирательностью антивирусного действия. Впервые высокая избирательность антивирусного действия обнаружена у производного 7-хлорхинолина, содержащего в качестве линкера производное сульфокислоты. Противовирусная активность всех изученных соединений сохраняется в отношении ацикловир-резистентного варианта HSV-1. В НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера (Санкт-Петербург) изучена in vivo активность соединения-лидера, выявленного на ранних этапах выполнения Проекта, на моделях герпетического энцефалита, вызванного ВПГ-1, и герпетического вагинита, вызванного ВПГ-2, а также острой токсичности при внутрибрюшинном введении. В случае герпетического энцефалита тестируемое соединение проявляло способность к снижению специфической смертности на 37.5% по сравнению с группой плацебо. В случае герпетического вагинита применение этого соединения приводило к снижению степени проявления патологии на всех сроках эксперимента. Острая токсичность при однократном внутрибрюшинном введении мышам составляет 332 мг/кг. Полученные результаты свидетельствуют о том, что соединение-лидер обладает определенной противовирусной активностью в опытах in vivo, умеренно токсично и может служить основой для создания препарата для лечения герпеса. В 2023 г. проведено высокопроизводительное секвенирование ДНК клонов ВПГ-1, резистентных к соединению-лидеру. Результат секвенирования позволили определить значимую мутацию T321I в гене UL15, который кодирует большую субъединицу терминазы. Совокупность результатов молекулярного докинга и молекулярно-динамических симуляций позволяют рассматривать субъединицу pUL15 в качестве биологической мишени исследуемого соединения. Это позволяет предположить, что соединение-лидер, связываясь с рUL15, воздействует на терминазный комплекс UL15, принимающий непосредственное участие в процессинге и упаковке вирусной ДНК. Следует подчеркнуть, что используемые в настоящее время для лечения ВПГ-инфекций противовирусные препараты 1-го и 2-го рядов воздействуют на вирусную полимеразу. Открытие антивирусных агентов, которые поражают другие мишени, расширит возможности воздействия на ВПГ-инфекции, включая резистентные к базовым лекарствам. В настоящее время не существует средств лечения герпесвирусной инфекции, действие которых основано на ингибировании терминазы. В НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера проведено изучение противовирусной активности синтезированных соединений в отношении вируса гриппа A/Puerto Rico/8/34 (H1N1) и B/Florida/4/2006. Наибольшей активностью в отношении гриппа А обладали конъюгаты 2-хлорпурина с 3,4-дигидро-3-метил-7,8-дифтор-2H-[1,4]бензоксазином, присоединенным через фрагмент омега-аминокислоты, которые представляют новую перспективную группу конъюгатов пурина. Среди конъюгатов 2-амино-6-хлорпиримидина наиболее активным оказалось производное, содержащее в качестве линкера фрагмент 6-аминогексановой кислоты. Указанные соединения оказались неактивными в отношении гриппа В. В результате скрининга впервые было обнаружено производное карборана, проявляющее активность в отношении вирусов гриппа А и В. Это позволяет считать перспективным поиск новых активных соединений в ряду конъюгатов пурина, содержащих карборановое ядро. Среди коньюгатов пурина, содержащих фрагменты сульфокислот лишь одно соединение проявило заметную активность в отношении гриппа А. Скрининговые исследования противовирусной активности 21 конъюгата пурина в отношении вируса SARS-CoV-2 проведены в Институте полиомиелита. Противовирусной активности в отношении SARS-CoV-2 не обнаружено. Изучение специфической туберкулостатической активности in vitro 9 конъюгатов 7-хлорхинолина и 2-амино-6-хлорпиримидина, содержащих в качестве линкера производные аминосульфокислот, в отношении микобактерий туберкулеза H37Rv, показало, что конъюгаты 7-хлорхинолина/2-амино-6-хлорпиримидина и (S)-глутаминовой кислоты, присоединенной через фрагмент п-аминосульфокислоты или таурина в качестве линкера, существенно уступают по туберкулостатической активности препарату сравнения (изониазиду). В результате изучения антибактериальной активности 18 синтезированных конъюгатов пурина в отношении грамположительных и грамотрицательных бактерий, а также некоторых грибов установлено, что наиболее активными являются конъюгаты пурина и 3,4-дигидро-3-метил-7,8-дифтор-2Н-[1,4]бензоксазина, присоединённого через фрагменты омега-аминокислот с длинной полиметиленовой цепью [(CH2)n]. Четыре вещества (n = 8-11) проявили антибактериальную активность в отношении контрольного штамма Neisseria gonorrhoeae; два соединения (n = 6 и 7) показали МИК = 25-50 мкг/мл в отношении грибов-дерматофитов. В 2023 г. опубликовано и принято в печать семь статей в изданиях, индексируемых в базах данных Web of Science Core Collection / Scopus и RSCI, из них две статьи опубликованы в журнале Molecules (импакт-фактор 4,6) первого квартиля Q1. Результаты работ по проекту представлены на 4-х российских и международных конференциях в виде 2-х стендовых докладов, 2 устных выступлений и 2-х приглашенных докладов.