Аннотация результатов, полученных в 2022 году
Толл-подобные рецепторы (TLR) являются ключевыми участниками системы врожденного иммунитета и могут выступать мишенями для новых лекарственных препаратов против ряда заболеваний, в том числе онкологических. Это массивные мембранные белки, которые характеризуются объемными внеклеточными и внутриклеточными частями, в то время как их трансмембранная часть представлена одной гидрофобной альфа-спиралью. Исследование структуры TLR и их сигнальных комплексов является необходимым для рациональной разработки лекарств и для понимания фунжаментальных принципов их функционирования. В рамках Проекта планировалось изучить структуру трансмембранной части, примембранных регионов и внутриклеточных доменов ряда толл-подобных рецепторов, в отчетном году работа по проекту велась в нескольких направлениях. Во-первых проводились работы в области белковой инженерии. Были собраны генетические конструкции для всех белков, которые планируется изучить, для ряда белков (трансмембранные домены TLR3 и TLR5, внутриклеточные домены TLR5 и TLR8, TIR домен MyD88) были разработаны методики гетерологической продукции, выделения и очистки. Эти исследования являются необходимыми для дальнейшей работы по Проекту исоздают фундамент для изучения межмолекулярных взаимодейтсвий при сигнализации посредством TLR. Во-вторых, проводились работы по изучениювзаимодействия ряда белков с цинком. Ранее было показано, что ионы цинка являются важным участником системы TLR, поэтому необходимо понять структурные основы роли цинка в функционировании рецептора. Было показано, что примембранные регионы TLR2 и TLR9, а также внутриклеточный TIR домен TLR2 взаимодействуют с ионами цинка, причем для TIR домена TLR2 удалось измерить константу диссоциации комплекса, которая составила 20 нМ, что является физиологически значимой величиной. Во всех случаях связывание с цинком приводит к олигомеризации белков. Поскольку при активации, как считается, происходят взаимодействия между TIR доменами TLR, а также взаимодействия с адаптерными белками, особое внимание в рамках проекта уделено изучению межмолекулярных взаимодействий. В отчетном году исследовали взаимодействия между TIR доменами TLR1 и TLR2. Стоит отметить, что TLR1 работает только вместе с TLR2, образую гетеромерные комплексы, однако ранее нами было показано, что TIR домены этих белков в растворе не проявляют склонности образовывать гомо- или гетродимеры. В текущем году была проверена гипотеза, что взаимодействия могут происходить в присутствии ионов цинка, что могло бы объяснить все наблюдаемые данные. Однако, оказалось, что даже в присутствии цинка никаких взаимодействий не происходит. По-видимому для образования активных комплексов TIR доменам нужна клеточная мембрана, примембранные регионы или адаптерные белки. Так как объекты исследования представляют собой мембранные белки, особое внимание в проекте было уделено методам их солюбилизации. Так, в 2022 году проводилась разработка новых типов мембраноподобных сред на основе липодисков SMA. Были предложены методы синтеза шести производных полимера SMA, наработаны значительные количества полимеров, проведены первые эксперименты по сборке липид-полимерных нанодисков. Показано, что образующиеся в смесях липид/полимер частицы имеют размер, приемлемый для исследований методами ЯМР-спектроскопии выского разрешения. Разработка новых мембраноподобных сред для ЯМР, как предполагается, позволит значительно расширить набор инструментов для имитации мембранного окружения и для стабилизации препаратов мембранных белков в растворах. Наконец, была исследована структура трансмембранных доменов (ТМД) и примембранных регионов двух TLR - TLR3 и TLR5. Показано, что ТМД TLR3 образует три спиральных участка - N-концевую примемранную спираль, ТМ спираль и цитоплазматическую примембранную спираль. Примембранные спирали погружены в гидрофобную часть мембраноподобного окружения. ТМД TLR5 образует длинную изогнутую спираль, в которой можно выделить два примембранных региона. Вместе с полученными ранее данными о структуре TLR4, TLR2 и TLR9 в распоряжении коллектива проекта есть информация о пространственной структуры мембраноассоциированных областей представителей всех подсемейств TLR, что закрывает ряд важных пробелов в структурной биологии этих белков. Оказалось, что все TLR содержат ранее не описанный структурный мотив - примембранную альфа-спираль, погруженную в липидное окружение. Для объяснения роли примембранных регионов был проведен биоинформатический анализ эволюции всех TLR, который выявил, что примембранные альфа-спирали TLR являются консервативными участками, в отличие от трансмембранных доменов. Были спланированы и совместно с китайскими коллегами проведены эксперименты по функциональному тестированию конструкций с модификациями в примембранных регионах TLR1 и TLR2. Было показано, что удаление примембранных регионов, их замена на гибкий линкер, случайное перемешивание аминокислот в примембранной спирали и замена примембранного гидрофобного региона на примембранный гидрофобный регион TLR1 полностью инактивирует TLR2. В то же время аналогичные изменения в TLR1 никак не влияют на функционирование рецептора. По-видимому, в гетеродимере TLR1/TLR2 примембранный регион TLR2 играет важную роль, кодируя некое специфическое взаимодействие, например, с примембранным регионом белка TIRAP. Резюмируя, план работ по Проекту в отчетном году был выполнен практически в полном объеме, если какие-то работы не удавалось провести, инициировались новые исследования. Все планируемые результаты были достигнуты, часть результатов было получено сверх изначального плана.

Аннотация результатов, полученных в 2023 году
Толл-подобные рецепторы (TLR) являются ключевыми участниками системы врожденного иммунитета и могут выступать мишенями для новых лекарственных препаратов против ряда заболеваний, в том числе онкологических. Это массивные мембранные белки, которые характеризуются объемными внеклеточными и внутриклеточными частями, в то время как их трансмембранная часть представлена одной гидрофобной альфа-спиралью. Исследование структуры TLR и их сигнальных комплексов является необходимым для рациональной разработки лекарств и для понимания фундаментальных принципов их функционирования. В рамках Проекта планировалось изучить структуру трансмембранной части, примембранных регионов и внутриклеточных доменов ряда толл-подобных рецепторов, в отчетном году работа по проекту велась в нескольких направлениях. По первому направлению, которое посвящено продукции TIR-доменов, были разработаны протоколы получения TIR домена белка TIRAP, одного из ключевых адаптерных белков TLR, а также варианты TIR доменов TLR1 и TLR2 c мутациями по цистеинам, с целью изучения взаимодействия данных белков с цинком. По второму направлению, посвященному исследованию структуры трансмембранных доменов TLR (ТМД TLR), было изучено взаимодействие ТМД TLR1 и ТМД TLR2, так как именно гетерокомплекс TLR1/TLR2 является функциональной единицей в клетке. Во-первых, были получены высокоэффективные экспрессионные конструкции и разработан протокол получения и очистки ТМД TLR1. Во-вторых, было показано, что ТМД TLR1 и ТМД TLR2 образуют слабые гомодимеры. В-третьих, обнаружено, что константа гетеродимеризации более чем в 10 раз превышает константу гомодимеризации. При этом показано, что трансмембранные домены с гидрофобными примембранными регионами TLR1 и TLR2 слабо взаимодействуют друг с другом. Кроме того, по данному направлению была опубликована статья в журнале Nature Communications (10.1038/s41467-023-37042-6). По направлению 3, которое посвящено исследованию пространственной структуры TLR-TIR, были подобраны условия выделения и очистки TIR домена рецептора TLR7. Данный белок был охарактеризован методом КД-спектроскопии и показано, что белок имеет вторичную укладку, свойственную для TIR доменов других представителей семейства TLR, однако, в отличие от TLR1 и 2, данный белок агрегирует при концентрациях выше 0.1-0.2 мг/мл. По четвертому направлению, которое посвящено исследованию взаимодействий TLR и адаптерных белков с ионами цинка, было показано, что ряд трансмембранных доменов с примембранными регионами TLR связывают цинк с высокой аффинностью. Кроме того, взаимодействие белка TIRAP-TIR с Zn2+ приводит к частично необратимой олигомеризации, а TIR-MyD88 не взаимодействует с цинком. По пятому направлению, которое посвящено исследованию белок-белковых взаимодействий TIR доменов, было показано, что TIR-MyD88 не взаимодействует с TIR-TLR1 и TIR-TLR2. Полученные результаты позволяют предположить, что TIR-домен MyD88 не взаимодействует напрямую с TIR-доменами TLR1/2 и для образования сигнальных комплексов необходима либо какая-то модификация белка, либо ещё один участник. По направлению 6, посвященному получению нативно свернутых белков, содержащих ТМ и внутриклеточные домены TLR, был разработан протокол лигирования ТМД и TIR доменов и показано, что таким способом возможно получить ТМД-TIR TLR, используя бесклеточную и бактериальную систмы экспрессии. По седьмому направлению, посвященному разработке мембраноподобных сред на основе SMA, было изучено поведение полимера SMA при различных значениях pH методами ЯМР, ДРС, ИК- и флуоресцентной спектроскопии, а также проведены квантово-химические расчеты, что позволило предложить механизм конформационного перехода. Кроме того, были получены и изучены липодиски на основе SMA и показано, что они образуют частицы, содержащие бислой, однако, данные частицы очень гетерогенны. Резюмируя, план работ по Проекту в отчетном году был выполнен в полном объеме.