Аннотация результатов, полученных в 2022 году
Все запланированные на первый год выполнения проекта результаты выполнены полностью. В работе использовали самцов крыс гипертензивной линии НИСАГ и контрольной нормотензивной линии WAG в возрасте 3 месяцев. Для проведения эксперимента были сформированы 4 группы (по 7 крыс в каждой): НИСАГ контроль (Ik), НИСАГ после воздействия рестрикционного стресса (Io), WAG контроль (Wk), WAG после воздействия рестрикционного стресса (Wo). Уровень АД в покое статистически высокодостоверно (p<0.001) различался у крыс НИСАГ и WAG. Воздействие двухчасового рестрикционного стресса (ограничение подвижности) приводило к высокодостоверному (p<0.001) увеличению уровня АД у крыс НИСАГ, но не изменяло АД у нормотензивных крыс WAG. Показано, что двухчасовое ограничение подвижности крыс привело к статистически достоверному (p<0.05) увеличению концентрации кортикостерона в плазме крови у крыс обеих линий, что подтвердило их физиологическое состояние стресса. Измерение катехоламинов (норадреналина и адреналина) в плазме крови показало, что уровень адреналина при стрессе также увеличивается. Гипоталамусы были отправлены в ООО «Институт Геномного Анализа» (г. Москва»), где был проведен анализ их транскриптомов методом RNA-Seq. Анализ проведен в четырех группах крыс: НИСАГ в покое, НИСАГ после рестрикционного стресса, WAG в покое и WAG после рестрикционного стресса (по 7 крыс в каждой группе). Библиотеки кДНК секвенировали с двух концов на платформе DNB с использованием DNBSEQ-400 (MGI Tech Co., Ltd., China). Длина секвенированных фрагментов составляла 150 оснований. Для каждого образца было получено более 30 млн. ридов. Все образцы были проанализированы как биологические повторы. Полученные данные были картированы на референсный геном крысы mRatBN7.2 (RefSeq) с использованием программного пакета STAR версии 2.7.10a. Статистический анализ дифференциальной экспрессии выполнен с помощью пакета DeSeq2. Дифференциальная экспрессия была вычислена для всех генов, демонстрирующих достаточный уровень экспрессии выше порогового (сумма покрытий гена для всех библиотек более 10 прочтений). Порог значимости для определения дифференциально экспрессирующихся генов (ДЭГ) соответствовал adjusted p-value < 5%. Были выявлены ДЭГ: НИСАГ контроль_WAG контроль:1163 ДЭГ НИСАГ стресс_WAG стресс: 1703 ДЭГ НИСАГ контроль_ НИСАГ стресс: 337 ДЭГ WAG контроль_ WAG стресс: 422 ДЭГ А) Построены тепловые карты (Heatmap) для уровней экспрессии для ДЭГ гипоталамусов крыс НИСАГ и WAG, проведена кластеризация образцов. Б) Проведена функциональная аннотация и интерпретация ДЭГ с использованием баз данных и инструментов оценки перепредставленности функциональных групп генов: RGD (http://rgd.mcw.edu/), GO (https://david.ncifcrf.gov/), KEGG (http://www.genome.jp/kegg/) и STRING (https://string-db.org/). ДЭГ, кодирующие транскрипционные факторы (TF), определялись по Атласу комбинаторной регуляции транскрипции у мыши и человека [Ravasi T, et al. Cell. 2010; 140(5):744–52]. В) Среди найденных ДЭГ были выявлены многочисленные гены, ассоциированные с гипертонией. Г) Межлинейные различия в покое (Ik_Wk) характеризуются дифференциальным уровнем транскрипции 33 генов, кодирующих транскрипционные факторы (TF). Воздействие рестрикционного стресса (сравнение Io_Wo) приводит к более чем двукратному увеличению числа ДЭГ (77 ДЭГ), кодирующих TF. Эти гены могут играть важную роль в определении межлинейных различий уровня транскрипции генов в контроле и при стрессе и влиять на формирование фенотипических признаков. Д) Поскольку наша работа в первую очередь нацелена на определение межлинейных особенностей реакции на стресс у гипертензивных крыс НИСАГ и нормотензивных крыс WAG, мы рассмотрели более подробно сравнения Ik_Io и Wk_Wo. Найдено 104 общих гена, которые однонаправленно изменили уровень транскрипции в гипоталамусе у обеих линий крыс. Согласно результатам анализа функционального обогащения сети этих ДЭГ, общий для двух линий ответ на воздействие стресса ассоциирован с терминами Response to stress и Signal transduction. Среди этих ДЭГ найдено 16, ассоциированных с термином Response to hormone, который включает гены, ассоциированные с ответом на инсулин, и ответом на стероидные гормоны, включая кортикостерон. Соответственно, можно заключить, что в гипоталамусе самцов обеих линий крыс при воздействии рестрикционного стресса происходят значительные изменения уровня транскрипции многих генов, которые влияют на сигнальную трансдукцию. И эти процессы связаны с влиянием эндогенных (гормональных) факторов, в первую очередь инсулина и стероидных гормонов. При наличии биологически значимого общего ответа на стресс, у каждой линии есть и специфический ответ, который представлен изменением уровня транскрипции значительно большего числа генов. Специфичный ответ на стресс в гипоталамусе гипертензивных крыс НИСАГ связан с изменением экспрессии 233 ДЭГ, из которых 103 (44.2%) гена снизили уровень транскрипции и 130 генов увеличили уровень транскрипции. Специфичный ответ на стресс в гипоталамусе нормотензивных крыс WAG связан с изменением экспрессии 318 ДЭГ, из которых 127 (39.9%) генов снизили уровень транскрипции и, 191 ген увеличили уровень транскрипции. Были определены основные метаболические пути и наиболее обогащенные термины Gene Ontology, описывающие биологические процессы, которые специфически изменяются в гипоталамусе гипертензивных крыс НИСАГ при воздействии рестрикционного стресса и те, которые специфически изменяются в гипоталамусе нормотензивных крыс WAG при воздействии рестрикционного стресса. Е) С использованием методов многомерной статистики проведено выявление ключевых генов, дающих наибольший вклад в формирование межгрупповых различий на уровне транскрипции при воздействии рестрикционного (эмоционального) стресса у гипертензивных крыс НИСАГ и нормотензивных крыс WAG. Ж) На основе имеющегося у научной группы предварительного задела в рамках тематики проекта проведена работа, направленная на выявление генетических основ повышенной восприимчивости гипертензивных крыс НИСАГ к воздействию стресса. Были использованы имеющиеся у группы данные секвенирования транскриптомов надпочечников крыс НИСАГ и WAG в покое, а также результаты ранее проведенного QTL анализа, который позволил определить генетические локусы, ассоциированные со специфическими фенотипическими признаками крыс НИСАГ. Было выявлено 9 ДЭГ в локусе хромосомы Х, который ранее был ассоциирован с приростом уровня АД, с приростом концентрации кортикостерона в плазме крови при воздействии рестрикционного стресса, а также с увеличенной массой надпочечников крыс НИСАГ. Анализ функций белков, кодируемых этими генами позволил предположить, что наиболее вероятным геном-кандидатом в локусе хромосомы Х, ассоциированном с повышенным уровнем стресс-чувствительности крыс НИСАГ, является ген Sms, кодирующий спермин синтазу. Дифференциальный уровень транскрипции гена Sms был подтвержден с помощью метода ПЦР в реальном времени. По этим результатам подготовлена статья: Федосеева Л.А., и соавт. Гены, ассоциированные с повышенной чувствительностью гипертензивных крыс линии НИСАГ к стрессу. Молекулярная биология. 2023. Т.57. №2. (РИНЦ и Scopus, английская версия журнала индексируется в Web of Science). З) Участие в международной конференции (тезисы): Fedoseeva L.A., et al. Changes in the expression of lncRNAs RGD1564482 and RT1-CE6 in the adrenal glands may be associated with the development of a stress-sensitive form of hypertension in ISIAH rats. P. 713. DOI:10.18699/SBB-2022-412. BGRS/SB-2022: The Thirteenth International Multiconference (04–08 July 2022, Novosibirsk, Russia); Abstracts /ICG, SB RAS. – Novosibirsk: ICG SB RAS, 2022. – 1148 p. – ISBN 978-5-91291-059-3. – DOI 10.18699/BGRS/SB-2022-00 И) В издании СО РАН "Наука в Сибири" 22 ноября 2022 г. опубликована статья «Сибирские ученые исследуют механизмы развития гипертонии на модели крыс НИСАГ» (online). Публикация содержит ссылку на финансовую поддержку работ грантом РНФ.

Аннотация результатов, полученных в 2023 году
Все запланированные на второй год выполнения проекта результаты достигнуты полностью. В работе использовали самцов крыс гипертензивной линии НИСАГ и контрольной нормотензивной линии WAG в возрасте 3 месяцев. Для проведения эксперимента были сформированы 4 группы (по 7 крыс в каждой): НИСАГ контроль (Ik), НИСАГ после воздействия рестрикционного стресса (Io), WAG контроль (Wk), WAG после воздействия рестрикционного стресса (Wo). Методом RNA-Seq проведено секвенирование транскриптомов гипофизов и надпочечников самцов крыс НИСАГ и WAG в возрасте 3-х месяцев в покое и после воздействия разового краткосрочного рестрикционного стресса (по 7 образцов в каждой группе). Глубина секвенирования составила более 20 млн. прочтений для каждого образца. Все образцы были проанализированы как биологические повторы. Выполнена сравнительная оценка изменения уровня транскрипции экспрессирующихся генов в четырех попарных сравнениях для каждой ткани: НИСАГ контроль_WAG контроль (Ik_Wk); НИСАГ стресс_WAG стресс (Io_Wo); НИСАГ стресс_НИСАГ контроль (Ik_Io); WAG стресс_WAG контроль (Wk_Wo); А) Среди найденных ДЭГ были выявлены многочисленные гены, ассоциированные с гипертонией. Б) Показано, что межлинейные различия в покое (Ik_Wk) характеризуются дифференциальным уровнем транскрипции 42 генов, кодирующих транскрипционные факторы (TF) в гипофизе и 83 генов, кодирующих TF в надпочечнике. Воздействие рестрикционного стресса приводит к увеличению числа ДЭГ, кодирующих TF, в 1.5 раза в гипофизе и в 2 раза в надпочечнике. Большинство ДЭГ, кодирующих TF, увеличили уровень транскрипции. Эти гены могут играть важную роль в формировании межлинейных различий при стрессе. В) Проведена функциональная аннотация и интерпретация ДЭГ с использованием баз данных и инструментов оценки перепредставленности функциональных групп генов. Сравнение списков дифференциально экспрессирующихся генов (ДЭГ), вовлеченных в ответ на стресс в обеих проанализированных структурах гипертензивных крыс НИСАГ и нормотензивных крыс WAG, показало наличие как общих, так и линия-специфических ДЭГ, участвующих в реакции на рестрикционный стресс. При анализе метаболических путей в гипофизе в общем ответе на стресс наиболее значимые изменения ассоциированы с термином Neuroactive ligand-receptor interaction, а также с изменениями в серотонинергических синапсах, изменениями экспрессии генов, ответственных за тонус гладкомышечных клеток сосудов, а также ДЭГ ассоциированных с контролем MAPK сигнального пути. В отчете приведены также метаболические пути, с которыми ассоциированы ДЭГ гипофизов крыс НИСАГ и WAG, представляющие специфический ответ на стресс в каждой из линий крыс. В группе ДЭГ общего ответа на стресс в надпочечнике значительное число ДЭГ (128 генов) ассоциировано с Metabolic pathways. Анализ функционального обогащения сети этих 128 ДЭГ в базе данных STRING продемонстрировал, что эта группа генов представляет сумму двух процессов, ассоциированных с биосинтезом и катаболизмом. В отчете представлен подробный анализ наиболее обогащенных процессов, связанных с биосинтезом и катаболизмом, а также результаты анализа метаболических путей, с которыми ассоциированы ДЭГ надпочечников крыс НИСАГ и WAG, представляющие специфический ответ на стресс в каждой из линий крыс. Г) Были определены наиболее достоверно обогащенные термины Gene Ontology, описывающие как общие биологические процессы, так и те, которые специфически изменяются в гипофизе и надпочечниках у каждой из исследуемых линий крыс при воздействии рестрикционного стресса. Д) С использованием методов многомерной статистики проведено выявление ключевых генов, дающих наибольший вклад в формирование межгрупповых различий на уровне транскрипции при воздействии рестрикционного (эмоционального) стресса в гипофизе и надпочечниках гипертензивных крыс НИСАГ и нормотензивных крыс WAG. Е) Для выявления молекулярно-генетических механизмов, лежащих в основе различной физиологической реакции гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой системы в условиях рестрикционного стресса у крыс НИСАГ и WAG, с использованием полученных в первый и второй год выполнения проекта данных по анализу транскриптомов гипоталамусов, гипофизов и надпочечников был проведен анализ обогащения промоторных областей белок-кодирующих ДЭГ сайтами связывания с транскрипционными факторами. Для этого использовали ресурс Enrich (https://maayanlab.cloud/Enrichr/enrich). Показано, что в гипоталамусе регуляция ответа на стресс у крыс НИСАГ связана в первую очередь с глюкокортикоидным рецептором (NR3C1). В гипоталамусе крыс WAG значимую роль играют другие транскрипционные факторы, в первую очередь SUZ12 (SUZ12 polycomb repressive complex 2 subunit). В гипофизе у обеих линий крыс значимую роль также играет SUZ12. В надпочечнике обеих линий крыс в регуляции ответа на стресс участвуют и SUZ12 и NR3C1, наряду с некоторыми другими транскрипционными факторами. Ж) RNA-Seq анализ позволил выявить многочисленные дифференциально экспрессирующиеся длинные некодирующие РНК (lncRNA). Для выявления среди них lncRNAs, которые могут участвовать в регуляции уровня артериального давления и генетически обусловленной повышенной стресс-чувствительности крыс НИСАГ, использовали корреляционный анализ между уровнем транскрипции lncRNAs и экспрессией белок-кодирующих ДЭГ, ассоциированных с гипертонией и с ответом на стимул в сравнении НИСАГ_контроль–НИСАГ_стресс. Выявлены lncRNAs, которые имеют максимальное число корреляций с белок-кодирующими генами, ассоциированными с гипертонией и с ответом на стимул. З). В гипоталамусе взрослых самцов гипертензивных крыс НИСАГ исследована динамика экспрессии гена Fos (маркер активации нейронов) и некоторых связанных с ним генов после однократного воздействия рестрикционного стресса разной продолжительности (30, 60 и 120 мин). Динамика активации гена Fos совпадает с динамикой увеличения артериального давления. В процессе активации нейронов гипоталамуса изменяется уровень транскрипции и других генов, кодирующих транскрипционные факторы (Jun Nr4a3, Jdp2, Ppargc1a), ассоциированные с развитием кардиоваскулярных заболеваний. Результаты позволили заключить, что повышенная стрессовая реактивность гипоталамо-гипофизарно-адренокортикальной и симпатоадреналовой систем гипертензивных крыс НИСАГ при кратковременном рестрикционном стрессе сопровождается активацией нейронов гипоталамуса и повышением уровня артериального давления. И). С использованием многомерной статистики (метод главных компонент) проведена работа по изучению взаимосвязей между ключевыми признаками проявления гипертензивного состояния и чувствительности к рестрикционному стрессу у гипертензивных крыс НИСАГ и нормотензивных крыс WAG. В работе использованы две группы самцов гибридов F2(НИСАГxWAG) разного возраста, полученных путем скрещивания гипертензивных крыс линии НИСАГ и нормотензивных крыс WAG. Показано, что развитие стресс-чувствительной гипертонии у крыс линии НИСАГ сопровождается не только возрастным стойким повышением базального артериального давления, но и снижением реакции на стресс, а также усилением тревожности по сравнению с молодыми крысами. К). По результатам, полученным за первые два года выполнения проекта, опубликованы 4 полнотекстовые статьи в журналах, индексируемых в библиографических базах WoS и/или Scopus. Две из них опубликованы в журналах, входящих в первый квартиль (Q1) по импакт-фактору JCR. Л). Основные результаты, полученные за отчетный период, были представлены на 4 отечественных и международных научных конференциях. Ход выполнения проекта и получения запланированных результатов был отражен в средствах массовой информации со ссылкой на финансовую поддержку работ грантом РНФ.