КАРТОЧКА ПРОЕКТА,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

 

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ


Номер 22-14-00082

НазваниеИсследование генетической предрасположенности к повышенной стресс-реактивности гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой системы в условиях рестрикционного (эмоционального) стресса, ассоциированного с формированием гипертензивного статуса у крыс НИСАГ.

РуководительРедина Ольга Евгеньевна, Доктор биологических наук

Организация финансирования, регионФедеральное государственное бюджетное научное учреждение "Федеральный исследовательский центр Институт цитологии и генетики Сибирского отделения Российской академии наук", Новосибирская обл

Годы выполнения при поддержке РНФ 2022 - 2024 

КонкурсКонкурс 2022 года «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований отдельными научными группами»

Область знания, основной код классификатора 04 - Биология и науки о жизни, 04-104 - Общая генетика

Ключевые словаСтресс; артериальная гипертония; гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковая система; рестрикционный стресс; экспрессия генов; RNA-Seq;

Код ГРНТИ34.23.37


 

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ


Аннотация
Болезни сердечно-сосудистой системы являются одной из наиболее важных проблем общественного здравоохранения во всем мире. Предполагается, что к 2025 году число пациентов с артериальной гипертонией приблизится к 60%, составив в общей сложности более полутора миллиардов человек. Поэтому изучение механизмов развития гипертонической болезни с целью ее профилактики, диагностики и повышения эффективности лечения является приоритетной задачей современной науки. Гипертоническая болезнь является мультифакториальным заболеванием. Одним из факторов риска, от которых может зависеть развитие гипертонической болезни является психоэмоциональный стресс. Наличие в раннем возрасте повышенной реакции артериального давления (АД) на психоэмоциональный стресс, а также часто встречающийся в человеческой популяции феномен «гипертонии белого халата» (повышение АД в присутствии врача), рассматривают как предвестники развития гипертонической болезни. Однако генетическая основа повышенной реакции АД на психоэмоциональный стресс остается мало изученной до настоящего времени. Во многих работах, проведенных как при анализе конкретных генов-кандидатов, так и в полногеномных исследованиях, выполненных на больших выборках людей показана полигенная природа гипертонии. Процесс изучения механизмов развития гипертонической болезни приводит к тому, что число вовлеченных факторов постоянно увеличивается, также как и список эффектов повышенного уровня АД на функционирование различных систем организма. Сложность изучения молекулярно-генетических механизмов развития гипертонии состоит в том, что вовлеченность в процесс большого числа генов сопровождается малым вкладом каждого из них в проявление фенотипа. Изучение генетических основ развития гипертонической болезни затрудняется также тем, что значительный вклад в изменчивость вносит не только генетическая, но и средовая компонента, что требует наличия подходящих моделей инбредных животных. Для изучения генетической основы повышенной реакции АД на психоэмоциональный стресс среди всех известных гипертензивных линий крыс наиболее адекватной моделью является линия крыс НИСАГ, селектированных по признаку резкого повышения уровня АД в условиях эмоционального стресса, вызванного получасовой рестрикцией. Стойкий гипертензивный статус крыс НИСАГ формируется к возрасту 2-х месяцев. С учетом вышеизложенного, основной целью проекта является сравнительное изучение на уровне транскриптома реакции гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой системы (ГГНС) на воздействие рестрикционного (эмоционального) стресса у гипертензивных крыс линии НИСАГ и нормотензивных крыс линии WAG. Для этого планируется провести анализ изменений транскриптомов гипоталамуса, гипофиза и надпочечников с помощью секвенирования РНК (метод RNA-Seq) в 4-х группах самцов в возрасте 3-х месяцев: НИСАГ в покое, НИСАГ после воздействия рестрикционного стресса, WAG в покое и WAG после воздействия рестрикционного стресса. Данный анализ ориентирован на решение нескольких задач: (1) сравнение изменений в экспрессии генов после воздействия рестрикционного (эмоционального) стресса у гипертензивных крыс НИСАГ и нормотензивных крыс WAG; (2) выявление молекулярно-генетических механизмов (биологических процессов и метаболических путей), лежащих в основе различной физиологической реакции ГГНС в условиях эмоционального стресса у гипертензивных крыс НИСАГ и нормотензивных крыс WAG; (3) выявление ключевых генов, дающих максимальный вклад в формирование межлинейных различий в уровне транскрипции после воздействия рестрикционного (эмоционального) стресса у гипертензивных крыс НИСАГ и нормотензивных крыс WAG; (4) выявление генов-кандидатов, контролирующих повышенную стресс-реактивность ГГНС крыс НИСАГ, в генетических локусах, ассоциированных нами ранее с признаком "прирост уровня АД при стрессе". Запланированная работа является полностью оригинальной.

Ожидаемые результаты
Работа будет проводиться с использованием самцов гипертензивных крыс НИСАГ с наследуемой индуцированной стрессом артериальной гипертонией и нормотензивных крыс линии WAG (Wistar Albino Glaxo). Предварительно все крысы, взятые в эксперимент, будут охарактеризованы по уровню систолического артериального давления (АД) в покое. Дальнейший эксперимент, запланированный в данном проекте, будет проводиться после 7-дневного периода покоя. Сравнительный анализ изменений транскриптомов гипоталамуса, гипофиза и надпочечников с помощью секвенирования РНК (метод RNA-Seq) будет проведен у 4-х групп самцов в возрасте 3-х месяцев: НИСАГ в покое, НИСАГ после воздействия рестрикционного стресса, WAG в покое и WAG после воздействия рестрикционного стресса. Каждая группа будет состоять из 6 крыс (либо по 5 животных, если цены на проведение анализов резко вырастут). Рестрикционный стресс будет заключаться в ограничении подвижности крысы в стандартной пластмассовой клетке-холдере, используемой для измерения АД, в течение 2.5 часов. По окончании рестрикционного стресса, который можно классифицировать и как эмоциональный стресс, будет проведено измерение АД. Соответственно, для каждой крысы будут получены характеристики как базального, так и индуцированного стрессом уровня АД. Секвенирование транскриптомов будет проведено с участием специализированной компании ЗАО «Геноаналитика» (г. Москва, Россия), которая оказывает услуги по выполнению технологической части анализа транскриптома (RNA-Seq), а именно, выделение РНК из присланных образцов ткани, проведение секвенирования и первичный биоинформатический анализ полученных результатов. В каждом образце будет проанализировано не менее 20 млн ридов. В результате будут определены уровни экспрессии всех транскриптов в изучаемых органах/тканях (структурные гены, псевдогены, длинные некодирующие РНК), а также проведена оценка дифференциальной экспрессии генов, что позволит выявить гены, различно изменяющие уровень транскрипции после воздействия рестрикционного (эмоционального) стресса у гипертензивных крыс НИСАГ и нормотензивных крыс WAG. Для определения основных изменяющихся биологических процессов и метаболических путей будет проведена функциональная аннотация дифференциально экспрессирующихся генов с использованием баз данных и инструментов оценки перепредставленности функциональных групп генов: RGD (http://rgd.mcw.edu/), GO (https://david.ncifcrf.gov/), KEGG (http://www.genome.jp/kegg/), STRING (https://string-db.org/). Также будут выявлены дифференциально экспрессирующиеся длинные некодирующие РНК (lncRNA) и с помощью корреляционного анализа будут выявлены те из них, которые могут участвовать в регуляции экспрессии генов, ассоциированных с повышенной стресс-чувствительностью крыс НИСАГ. С помощью методов многомерной статистики будут выявлены ключевые гены, дающие максимальный вклад в формирование межлинейных различий на уровне транскрипции после воздействия рестрикционного (эмоционального) стресса у гипертензивных крыс НИСАГ и нормотензивных крыс WAG. Будет проведен анализ коэкспрессии генов и другие виды кластеризации и построения сетей по экспрессии генов в различных экспериментальных состояниях, для выявления корегулируемых групп генов, а возможно и их мастер-регулятора. С помощью комплексного геномно-транскриптомного подхода в генетических локусах, ассоциированных нами ранее с признаком "прирост уровня АД при стрессе" будут выявлены гены, контролирующие повышенную стресс-реактивность крыс НИСАГ. Верификация дифференциальной экспрессии генов-кандидатов и длинных некодирующих РНК будет проводиться методом ПЦР с детекцией в реальном времени. Измерение белковых продуктов некоторых генов-кандидатов будет проведено с помощью иммуноферментных тест-систем (при наличии ELISA-kits для измерения соответствующих белковых продуктов генов-кандидатов) или с помощью Western-blot анализа (при наличии коммерчески доступных антител). В сыворотке крови будут определены концентрации катехоламинов (норадреналин и адреналин) и кортикостерона для физиологической характеристики уровня стресса экспериментальных крыс, что потребуется для подтверждения наличия у экспериментальных крыс состояния стресса при публикации данных транскриптомных анализов. Уровень катехоламинов в сыворотке крови будет измерен методом высокоэффективной жидкостной хроматографии при помощи электрохимической детекции. Измерение концентрации кортикостерона в сыворотке крови будет проведено иммуноферментными методами с использованием набора реактивов ELISA (Abcam, USA). По результатам работы за три года выполнения проекта будет опубликовано 9 полнотекстовых статей в научных изданиях, индексируемых в базах данных «Сеть науки» (Web of Science Core Collection) или «Скопус» (Scopus). Таким образом, результаты, полученные при выполнении проекта, позволят на уровне транскриптома дать полную картину различий в реакции гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой системы на воздействие рестрикционного (эмоционального) стресса у гипертензивных крыс линии НИСАГ и нормотензивных крыс линии WAG. Будут описаны молекулярно-генетические механизмы (биологические процессы и метаболические пути), и выявлены ключевые гены-кандидаты, контролирующие повышенную стресс-реактивность крыс НИСАГ, что, с одной стороны, составит фундаментальную молекулярно-генетическую картину реакции гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой системы на воздействие рестрикционного (эмоционального) стресса у гипертензивных крыс линии НИСАГ по сравнению с нормотензивными крысами линии WAG, а с другой стороны, полученные результаты позволят определить новые молекулярные мишени для потенциального использования в диагностике, терапии и профилактике физиологических последствий психоэмоционального стресса. Полученные результаты будут полностью оригинальными, что обеспечивается уникальностью процесса селекции крыс линии НИСАГ, моделирующих наследственную стресс-чувствительную форму артериальной гипертонии. Запланированные результаты будут соответствовать мировому уровню исследований. Выполнение всех поставленных в проекте задач в полном объеме гарантируется опытом выполняемых экспериментальных работ собранного коллектива авторов.


 

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ


Аннотация результатов, полученных в 2022 году
Все запланированные на первый год выполнения проекта результаты выполнены полностью. В работе использовали самцов крыс гипертензивной линии НИСАГ и контрольной нормотензивной линии WAG в возрасте 3 месяцев. Для проведения эксперимента были сформированы 4 группы (по 7 крыс в каждой): НИСАГ контроль (Ik), НИСАГ после воздействия рестрикционного стресса (Io), WAG контроль (Wk), WAG после воздействия рестрикционного стресса (Wo). Уровень АД в покое статистически высокодостоверно (p<0.001) различался у крыс НИСАГ и WAG. Воздействие двухчасового рестрикционного стресса (ограничение подвижности) приводило к высокодостоверному (p<0.001) увеличению уровня АД у крыс НИСАГ, но не изменяло АД у нормотензивных крыс WAG. Показано, что двухчасовое ограничение подвижности крыс привело к статистически достоверному (p<0.05) увеличению концентрации кортикостерона в плазме крови у крыс обеих линий, что подтвердило их физиологическое состояние стресса. Измерение катехоламинов (норадреналина и адреналина) в плазме крови показало, что уровень адреналина при стрессе также увеличивается. Гипоталамусы были отправлены в ООО «Институт Геномного Анализа» (г. Москва»), где был проведен анализ их транскриптомов методом RNA-Seq. Анализ проведен в четырех группах крыс: НИСАГ в покое, НИСАГ после рестрикционного стресса, WAG в покое и WAG после рестрикционного стресса (по 7 крыс в каждой группе). Библиотеки кДНК секвенировали с двух концов на платформе DNB с использованием DNBSEQ-400 (MGI Tech Co., Ltd., China). Длина секвенированных фрагментов составляла 150 оснований. Для каждого образца было получено более 30 млн. ридов. Все образцы были проанализированы как биологические повторы. Полученные данные были картированы на референсный геном крысы mRatBN7.2 (RefSeq) с использованием программного пакета STAR версии 2.7.10a. Статистический анализ дифференциальной экспрессии выполнен с помощью пакета DeSeq2. Дифференциальная экспрессия была вычислена для всех генов, демонстрирующих достаточный уровень экспрессии выше порогового (сумма покрытий гена для всех библиотек более 10 прочтений). Порог значимости для определения дифференциально экспрессирующихся генов (ДЭГ) соответствовал adjusted p-value < 5%. Были выявлены ДЭГ: НИСАГ контроль_WAG контроль:1163 ДЭГ НИСАГ стресс_WAG стресс: 1703 ДЭГ НИСАГ контроль_ НИСАГ стресс: 337 ДЭГ WAG контроль_ WAG стресс: 422 ДЭГ А) Построены тепловые карты (Heatmap) для уровней экспрессии для ДЭГ гипоталамусов крыс НИСАГ и WAG, проведена кластеризация образцов. Б) Проведена функциональная аннотация и интерпретация ДЭГ с использованием баз данных и инструментов оценки перепредставленности функциональных групп генов: RGD (http://rgd.mcw.edu/), GO (https://david.ncifcrf.gov/), KEGG (http://www.genome.jp/kegg/) и STRING (https://string-db.org/). ДЭГ, кодирующие транскрипционные факторы (TF), определялись по Атласу комбинаторной регуляции транскрипции у мыши и человека [Ravasi T, et al. Cell. 2010; 140(5):744–52]. В) Среди найденных ДЭГ были выявлены многочисленные гены, ассоциированные с гипертонией. Г) Межлинейные различия в покое (Ik_Wk) характеризуются дифференциальным уровнем транскрипции 33 генов, кодирующих транскрипционные факторы (TF). Воздействие рестрикционного стресса (сравнение Io_Wo) приводит к более чем двукратному увеличению числа ДЭГ (77 ДЭГ), кодирующих TF. Эти гены могут играть важную роль в определении межлинейных различий уровня транскрипции генов в контроле и при стрессе и влиять на формирование фенотипических признаков. Д) Поскольку наша работа в первую очередь нацелена на определение межлинейных особенностей реакции на стресс у гипертензивных крыс НИСАГ и нормотензивных крыс WAG, мы рассмотрели более подробно сравнения Ik_Io и Wk_Wo. Найдено 104 общих гена, которые однонаправленно изменили уровень транскрипции в гипоталамусе у обеих линий крыс. Согласно результатам анализа функционального обогащения сети этих ДЭГ, общий для двух линий ответ на воздействие стресса ассоциирован с терминами Response to stress и Signal transduction. Среди этих ДЭГ найдено 16, ассоциированных с термином Response to hormone, который включает гены, ассоциированные с ответом на инсулин, и ответом на стероидные гормоны, включая кортикостерон. Соответственно, можно заключить, что в гипоталамусе самцов обеих линий крыс при воздействии рестрикционного стресса происходят значительные изменения уровня транскрипции многих генов, которые влияют на сигнальную трансдукцию. И эти процессы связаны с влиянием эндогенных (гормональных) факторов, в первую очередь инсулина и стероидных гормонов. При наличии биологически значимого общего ответа на стресс, у каждой линии есть и специфический ответ, который представлен изменением уровня транскрипции значительно большего числа генов. Специфичный ответ на стресс в гипоталамусе гипертензивных крыс НИСАГ связан с изменением экспрессии 233 ДЭГ, из которых 103 (44.2%) гена снизили уровень транскрипции и 130 генов увеличили уровень транскрипции. Специфичный ответ на стресс в гипоталамусе нормотензивных крыс WAG связан с изменением экспрессии 318 ДЭГ, из которых 127 (39.9%) генов снизили уровень транскрипции и, 191 ген увеличили уровень транскрипции. Были определены основные метаболические пути и наиболее обогащенные термины Gene Ontology, описывающие биологические процессы, которые специфически изменяются в гипоталамусе гипертензивных крыс НИСАГ при воздействии рестрикционного стресса и те, которые специфически изменяются в гипоталамусе нормотензивных крыс WAG при воздействии рестрикционного стресса. Е) С использованием методов многомерной статистики проведено выявление ключевых генов, дающих наибольший вклад в формирование межгрупповых различий на уровне транскрипции при воздействии рестрикционного (эмоционального) стресса у гипертензивных крыс НИСАГ и нормотензивных крыс WAG. Ж) На основе имеющегося у научной группы предварительного задела в рамках тематики проекта проведена работа, направленная на выявление генетических основ повышенной восприимчивости гипертензивных крыс НИСАГ к воздействию стресса. Были использованы имеющиеся у группы данные секвенирования транскриптомов надпочечников крыс НИСАГ и WAG в покое, а также результаты ранее проведенного QTL анализа, который позволил определить генетические локусы, ассоциированные со специфическими фенотипическими признаками крыс НИСАГ. Было выявлено 9 ДЭГ в локусе хромосомы Х, который ранее был ассоциирован с приростом уровня АД, с приростом концентрации кортикостерона в плазме крови при воздействии рестрикционного стресса, а также с увеличенной массой надпочечников крыс НИСАГ. Анализ функций белков, кодируемых этими генами позволил предположить, что наиболее вероятным геном-кандидатом в локусе хромосомы Х, ассоциированном с повышенным уровнем стресс-чувствительности крыс НИСАГ, является ген Sms, кодирующий спермин синтазу. Дифференциальный уровень транскрипции гена Sms был подтвержден с помощью метода ПЦР в реальном времени. По этим результатам подготовлена статья: Федосеева Л.А., и соавт. Гены, ассоциированные с повышенной чувствительностью гипертензивных крыс линии НИСАГ к стрессу. Молекулярная биология. 2023. Т.57. №2. (РИНЦ и Scopus, английская версия журнала индексируется в Web of Science). З) Участие в международной конференции (тезисы): Fedoseeva L.A., et al. Changes in the expression of lncRNAs RGD1564482 and RT1-CE6 in the adrenal glands may be associated with the development of a stress-sensitive form of hypertension in ISIAH rats. P. 713. DOI:10.18699/SBB-2022-412. BGRS/SB-2022: The Thirteenth International Multiconference (04–08 July 2022, Novosibirsk, Russia); Abstracts /ICG, SB RAS. – Novosibirsk: ICG SB RAS, 2022. – 1148 p. – ISBN 978-5-91291-059-3. – DOI 10.18699/BGRS/SB-2022-00 И) В издании СО РАН "Наука в Сибири" 22 ноября 2022 г. опубликована статья «Сибирские ученые исследуют механизмы развития гипертонии на модели крыс НИСАГ» (online). Публикация содержит ссылку на финансовую поддержку работ грантом РНФ.

 

Публикации

1. - Сибирские ученые исследуют механизмы развития гипертонии на модели крыс НИСАГ Издание Сибирского Отделения Российской Академии Наук "Наука в Сибири", 22 ноября 2022 г. (online) Ссылка на РНФ: Исследование проводится при финансовой поддержке Российского научного фонда (грант № 22-14-00082). (год публикации - ).

2. - Сибирские ученые исследуют механизмы развития гипертонии на модели крыс НИСАГ Сайт Российского Научного Фонда. Новости., 22 ноября 2022 г. перепечатано из "Наука в Сибири". Ссылка на РНФ: Исследование проводится при финансовой поддержке Российского научного фонда (грант № 22-14-00082). (год публикации - ).

3. - Гены, контролирующие рост артериального давления при стрессе, ищут новосибирские ученые Интерфакс Россия, Интерфакс Россия, Главные события, 22 ноября 2022 года. Ссылка на РНФ: Исследование будет проводиться в 2022-2024 годах при финансовой поддержке Российского научного фонда (год публикации - ).

4. Федосеева Л.А., Смоленская С.Э., Маркель А.Л., Редина О.Е. Гены, ассоциированные с повышенной чувствительностью гипертензивных крыс линии НИСАГ к стрессу. Молекулярная биология, - (год публикации - 2023).