Аннотация результатов, полученных в 2022 году
Согласно плану 2022 г., за отчетный период разработана реляционная база данных PhotoProteinTech, содержащая информацию о последовательностях и физико-химических свойствах целентеразин-зависимых люцифераз и кальций-регулируемых фотопротеинов, а также данные по температурам плавления, спектрам излучения и биолюминесцентной активности. База данных реализована с помощью СУБД MySQL 5.7.26 и состоит из 10 взаимосвязанных таблиц. На данном этапе она содержит информацию о светочувствительном Са2+-регулируемом фотопротеине беровине из Beroe abyssicola и его 78 мутантах, Са2+-регулируемых фотопротеинах акворине и его 96 мутантах и обелине и его 87 мутантах из Aequorea victoria и Obelia longissima, соответственно, целентеразин-зависимой люциферазе Renilla и ее 130 мутантах, а также данные по белкам с похожим типом укладки и наличием гомологии к кальций-регулируемым фотопротеинам (865 белков) и к люциферазе Renilla (11535 белков), обнаруженных в базе данных предрасчитанных структур AlphaFold DB. Таким образом, уже сейчас база данных содержит информацию, необходимую для оценки влияния мутаций на физико-химические свойства фотопротеинов и люциферазы Renilla, и может быть использована для дизайна новых мутантов с измененными биолюминесцентными свойствами. С использованием методов молекулярного моделирования и искусственного интеллекта (пакеты Rosetta, AlphaFold, DeepAccNet, ESM-IF1, ProteinMPNN) предсказаны аминокислотные замены в люциферазе Renilla, которые могут привести к изменению спектра излучения и биолюминесцентной активности люциферазы Renilla, кинетики биолюминесцентной реакции, а также повысить термостабильность фермента. На основе предсказанных замен с помощью сайт-направленного мутагенеза получены четырнадцать мутантов люциферазы Renilla (#2 - K189A, E162N, F180Y; #4 - L165T, M154D; #5 - K209P; #6 - F33H; #7 - A54P; #9 - H62N; #10 - H142F, S145A; #11 - I266E, T276Q, F273W; #13 - W104L, F105W, L50Q, P76C, I34M; #15 - V267R, E256D; #16 - Y243W; #17 - I266D; #18 - S145G, V147Y, G269I, F127L, S123V, I266N; #19 - D148G, V149P, G269F, N241S) и исследованы их биолюминесцентные (удельная активность, спектр излучения, кинетика реакции) и физико-химические (термостабильность, термоинактивация) свойства. Среди исследованных мутантов выявлено четыре (#2, #4, #9 и #19) наиболее устойчивые к действию температуры. Показано, что мутант #2 сохраняет 100% активности после 3-часовой инкубации при 37оС. Помимо запланированных на 2022 г. исследований для светочувствительного кальций-регулируемого фотопротеина беровина ктенофор Beroe abyssicola определены: удельная биолюминесцентная активность, квантовый выход биолюминесцентной реакции, а также коэффициенты экстинкции для высокоочищенного активного белка. Данные характеристики беровина будут необходимы для решения задач, запланированных на 2023 г. Кроме того, получены кристаллы кальций-разряженного обелина-v (активированного аналогом целентеразина, целентеразином-v) и определена с разрешением 2.1 Å его пространственная структура. Установлено, что основным продуктом реакции является целентерамин-v, а не целентерамид, когда в качестве субстрата используется нативный целентеразин. Поскольку целентерамин может образовываться в результате «темнового» пути распада диоксиэтанона, обнаружение целентерамина-v как основного продукта реакции, инициированной кальцием, объясняет низкую биолюминесцентную активность кальций-регулируемых фотопротеинов с этим аналогом целентеразина. Наряду со структурой активного обелина, связанного с 2-гидропероксицелентеразином-v, определенной нами ранее, пространственная структура кальций-разряженного обелина-v с продуктом реакции в активном центре будет необходима для выполнения исследований по моделированию взаимодействия целентеразина-v с кальций-регулируемыми фотопротеинами, запланированными на 2023 г.

Аннотация результатов, полученных в 2023 году
1. В фотопротеине беровине выделены три области, аминокислотные замены в которых могли бы привести к сдвигу оптимума активации в сторону физиологических значений pH и снижению зависимости эффективности активации от соли. Были выбраны следующие возможные комбинации мутаций: 1 – P62S, M79H, L129W, Y133V; 2 – L38H, K90A, W103F, N107M; 3 – F188H и S130G, а также одиночная замена K90A. Показано, что все замены приводят к сдвигу оптимального значения рН активации с 9,0 у беровина дикого типа до 6,0–6,5 у мутантов и к исчезновению зависимости эффективности активации от соли. Несмотря на подобранные оптимальные условия активации, выход активного белка всех мутантов был значительно ниже, чем у беровина дикого типа. Добавочная мутация N107S к K90A или K90M способствовала увеличению стабильности фотопротеинового комплекса при 37оС. 2. Проверена гипотеза о функциональной роли молекулы воды, а также ряда аминокислот активного центра (His, Tyr, Trp и Ser), расположенных вблизи N1 атома 2-гидропероксицелентеразина, формирующих «протонный канал», необходимый для переноса протона в процессах образования эмиттера и каталитического окисления субстрата. Для этого были сконструированы мутанты обелина и акворина с одиночными и двойными заменами указанных аминокислот, а также исследованы их биолюминесцентные и физико-химические свойства. На основании полученных результатов по исследованию свойств мутантов обелина и акворина, а также пространственной структуры мутанта обелина с заменой His на Phe сделан вывод, что наличие молекулы воды и водородных связей, формируемых His, необходимо для эффективного протекания биолюминесцентной реакции. (https://new.ras.ru/activities/news/izuchen-mekhanizm-svecheniya-fotoproteina-gidromeduzy/) (https://rscf.ru/news/biology/v-novom-svete-uchenye-izuchili-stroenie-fotoproteinov/) 3. C помощью предобученной модели ESM-IF1 и методов молекулярного моделирования, таких как Rosetta и ESMFold, были предсказаны варианты одиночных и множественных замен в аминокислотных последовательностях обелина и акворина, которые, согласно моделям, должны улучшить физико-химические свойства и изменить биолюминесцентные свойства кальций-регулируемых фотопротеинов гидромедуз. Для проверки этого были сконструированы мутанты обелина и акворина с одиночными и множественными заменами предсказанных аминокислотных остатков, а также исследованы их биолюминесцентные и физико-химические свойства (эффективность активации, удельная активность, кинетика биолюминесцентного сигнала, спектры биолюминесценции мутантов и спектры флуоресценции соответствующих кальций-разряженных фотопротеинов). Исследование мутантов обелина и акворина с заменой аминокислотных остатков активного центра, предсказанных с помощью предобученной модели, показало, что все предложенные на данном этапе мутации не привели к повышению стабильности фотопротеинов, увеличению выхода активного белка и удельной активности, а также существенному сдвигу максимума спектра биолюминесценции. Полученные результаты будут внесены в базу данных, используемую для предсказания мутаций методами молекулярного моделирования. 4. Регрессионный анализ биолюминесцентной активности мутантов обелина и акворина выявил линейную зависимость активности этих белков с физико-химическими свойствами аминокислотных замен. Корреляция наблюдалась между биолюминесцентной активностью мутантов обелина, активированных немодифицированным целентеразином, и объемом аминокислотных остатков (R=0.77). Множественный коэффициент корреляции, описывающий связь двух физико-химических характеристик (объем аминокислот и гидрофильность) и биолюминесцентной активностью мутантов обелина, был равен 0.81. Для экспериментальных данных по мутантам обелина, активированных целентеразином-v, множественный коэффициент корреляции, связывающий объем аминокислот и гидрофильность с биолюминесцентной активностью мутантов, составил 0.65. Множественная корреляция между физико-химическими свойствами (гидрофобность и полярность) и биолюминесцентной активностью мутантов обелина и акворина составила 0.855. Полученные результаты могут быть использованы для дальнейшего прогнозирования эффективных аминокислотных замен фотопротеинов для получения белков с заданным свойствами. 5. Проанализированы мутанты люциферазы Renilla, предложенные с помощью современных биоинформатических подходов, основанных на использовании обучающихся нейросетей ProteinMPNN, AlphaFold2, Rosetta и ESMFold. Оптимизирована продукция высокоочищенных препаратов рекомбинантных мутантных люцифераз и исследован широкий спектр физико-химических свойств полученных мутантов. Обнаружены варианты люциферазы, обладающие свойствами усовершенствованных биолюминесцентных репортеров: с повышенной удельной активностью, температурным оптимумом в области 37oС, измененным спектром излучения, повышенной термостабильностью. Так, мутант #4 показал себя как термостабильный вариант люциферазы, сохраняющий максимальную биолюминесцентную активность при длительной инкубации при 37оС. Мутанты #12 и #15 проявили свойства «медленных» люцифераз, что является несомненным преимуществом в ряде биолюминесцентных анализов. Мутант #3 с максимумом биолюминесценции в фиолетовой области спектра при 402 нм в перспективе мог бы использоваться для разработки анализов, основанных на одновременной двухволновой детекции эмиссии. Также было показано, что одиночная аминокислотная замена K189Q повышает не только температурный оптимум биолюминесценции люциферазы до 37оС, но и аффинность к обоим субстратам (CTZ и CTZ-v), а также увеличивает значение Vmax. Таким образом, проведенное исследование позволило расширить спектр имеющихся репортеров для биолюминесцентных тест-систем, пополнив его новыми перспективными мутантами, и в то же время продемонстрировало потенциал современных методов рационального дизайна молекул ферментов. Кроме того, анализ ряда мутантов из группы, смоделированной для изменения аминокислотного окружения субстрата, позволил определить, что положение аминокислотных остатков 180 и 189 играет критическую роль в образовании эмиттера биолюминесцентной реакции. 6. Сконструированы три синтетических фотопротеина с использованием современных подходов генеративного моделирования. Для этого использовали подходы RFDiffusion и ProteinMPNN, а также модель ESMFold для валидации предсказаний. В результате предсказаны три оригинальные последовательности: SPhP1, SPhP2 и SPhP3, обладающие структурным сходством с различными Ca2+-связывающими белками, а также наличием потенциального сайта связывания CTZ-v. Последовательность SPhP1 была предсказана с использованием пакета RFDiffusion для реконструкции фрагментов структуры, не связанных с субстратом. Последовательности SPhP2 и SPhP3 были предсказаны с использованием модели ProteinMPNN и структуры акворина (PDB ID 1EJ3). Показано, что идентичность SPhP1 с известными фотопротеинами минимальная – не более 24%, что делает его перспективным как для фундаментальных исследований механизмов биолюминесценции, так и для использования в качестве аналитического инструмента. SPhP2 и SPhP3 были сконструированы таким образом, чтобы аминокислотные остатки, находящиеся вдали от каталитического сайта, были заменены на предлагаемые нейросетью. Благодаря такому подходу могут быть получены новые свойства фотопротеина без кардинального изменения структуры белка. Все три разработанные аминокислотные последовательности новых искусственных фотопротеинов были преобразованы в нуклеотидные с учетом дальнейшей экспрессии генов этих белков в E. coli и произведен синтез соответствующих генов с учетом последующего клонирования их в экспрессионные векторы.