Аннотация результатов, полученных в 2022 году
В первый год выполнения проекта начаты работы по ряду направлений, связанных с изучением размера и структуры геномов байкальских амфипод, а также репродуктивных барьеров между генетическими линиями одного из массовых эндемичных видов. В рамках изучения вклада размера геномов в эволюцию байкальских амфипод проведена апробация двух основных методов для оценки размера генома — денситометрии изображений ядер, окрашенных по Фельгену (ФД), и проточной цитометрии (ПЦМ) — и определение границ их применимости для задач проекта. При апробации метода ПЦМ мы смогли оптимизировать способ выделения ядерной фракции и получить очень высокую сходимость результатов. В то же время, метод ФД обладал существенно меньшей точностью и по этой причине не подходит для сравнения размеров геномов близких видов. Далее были с высокой точностью оценены размеры геномов разных генетических линий внутри морфологического вида Eulimnogammarus verrucosus. Мы нашли статистически значимые различия между размером геномов в трёх известных генетических линиях байкальских E. verrucosus: наибольшим (8,0 пг) оказался размер генома представителей южной популяции (далее S), средним (6,9 пг) из западной популяции (далее W) и самым маленьким (6,1 пг) — из восточной популяции (далее E). Таким образом, анализ размера геномов позволил нам уточнить оценку для западной популяции E. verrucosus (около 7 пг), что принципиально для запланированной в рамках проекта сборки генома, а также показал существенные различия между популяциями E. verrucosus. Наиболее вероятной причиной различий является разное накопление повторов в их геномах, что подтверждает исходную гипотезу о важности повторов в эволюции геномов байкальских амфипод и будет исследовано далее в ходе проекта. В составе блока работ по изучению структуры геномов были отработаны методики получения метафазных пластинок и флуоресцентной гибридизации in situ. Гибридизация препаратов метафазных пластинок с зондами к наиболее распространённым в геноме E. verrucosus (W) повторам показала чёткий сигнал обоих зондов со схожей интенсивностью. Этот результат хорошо согласуется с опубликованными данными секвенирования генома этого вида. Важно, что наши данные позволяют уверенно утверждать, что повторы обоих типов присутствуют на большинстве хромосом и распределены по ним приблизительно равномерно. Эти данные не могут быть непосредственно использованы при сборке генома, однако могут быть полезны для проверки качества на этапе сборки длинных фрагментов. Кроме E. verrucosus, мы аналогичным образом изучили повторы в геномах других распространенных видов этого рода, E. cyaneus и E. vittatus. В случае каждого вида была зарегистрирована явная гибридизация только одного из типов повторов: мы наблюдали сигнал RepB в случае E. cyaneus и RepA в случае E. vittatus. Опубликованные значения размера геномов этих видов ниже, чем у E. verrucosus, что косвенно подтверждает гипотезу о существенном вкладе повторов в эволюцию геномов байкальских амфипод. В рамках изучения репродуктивных барьеров изучены генетические линии массового эндемичного вида Eulimnogammarus verrucosus в оз. Байкал, а также начаты работы по установлению происхождения этого вида в реке Ангаре, вытекающей из Байкала. Поскольку полученные данные показали наличие репродуктивных барьеров, далее мы будем называть байкальские линии криптическими видами W (западный), S (южный) и E (восточный). В данном блоке работ проведены анализ филогении по 15 митохондриальным генам и оценка времени существования последнего общего предка байкальских криптических видов E. verrucosus. Согласно полученным оценкам, возраст общего предка E. verrucosus составляет около 4,5 млн лет, а возраст общего предка E. verrucosus W и S — около 3,8 млн лет. Даже если учитывать вероятность увеличения скорости накопления замен у байкальских эндемиков, виды E. verrucosus W и S разошлись не менее 600 тыс. лет назад, что на порядок больше возраста р. Ангары. Кроме того, проведены лабораторные эксперименты по выявлению презиготических и постзиготических барьеров между криптическими видами E. verrucosus. В рамках изучения презиготических барьеров мы выяснили, что чаще всего животные выбирают представителей своего вида (22 из 31 эксперимента), реже не совершают выбор (8 экспериментов) и редко выбирают представителей другого вида (1 из 31). Таким образом, презиготическая изоляция криптических видов внутри E. verrucosus действительно существует, но не является абсолютной. В первый год проекта был проведён эксперимент по скрещиванию представителей видов W и S из точек в истоке р. Ангары, разделённых расстоянием около 1 км. Именно эта комбинация была выбрана для начала исследований потому, что мы предполагаем, что этом районе побережья Байкала ареалы представителей разных генетических линий сближаются наиболее сильно: в гипотетическом месте барьера между S и E располагается очень обширная дельта р. Селенги, а в гипотетическом месте барьера между W и E — также обширный Ангарский сор. При такой схеме эксперимента образовывались совместные прекопулы, но развитие гибридных эмбрионов останавливалось. Вероятно, гибридные эмбрионы E. verrucosus прекращают развитие из-за несовместимости каких-то факторов материнского и отцовского генома. Эти данные показывают наличие постзиготической изоляции видов W и S. Полученные данные дополнительно показывают, что генетические группы внутри E. verrucosus являются (псевдо)криптическими биологическими видами, разделёнными репродуктивно. В рамках изучения репродуктивных барьеров также впервые изучено генетическое разнообразие E. verrucosus в р. Ангаре. Эта река, единственный сток Байкала, является естественной модельной системой для изучения взаимодействия разных генетических линий байкальских видов. Известно, что данный момент в Байкале с разных сторон истока реки обитают разные генетические линии E. verrucosus согласно оценке по гаплогруппам митохондриального гена первой субъединицы цитохром C-оксидазы (COI) и ядерного гена 18S рРНК (18S), однако молекулярного анализа представителей этого вида в р. Ангаре ранее не проводилось. Для изучения генетического разнообразия E. verrucosus в рамках этой работы мы использовали те же маркерные последовательности. Было собрано более 100 образцов животных, морфологически схожих с E. verrucosus, в 10 точках, и начато их генотипирование методом секвенирования филогенетических маркеров. Наиболее важным и неожиданным результатом оказалось то, что ни одно из этих животных не принадлежало к западной байкальской гаплогруппе, хотя представители западного вида в массе обитают у истока реки. Основная часть образцов (около 2/3 по каждому гену) принадлежали к кластерам, в которые также входили животные из южного байкальского вида. Другие образцы (около трети) оказались достаточно схожи с E. verrucosus (доля различий в гене COI около 10 %, что сопоставимо с различиями между байкальскими криптическими видами), но не принадлежали ни к одной из известных байкальских групп. Вероятно, что они являются представителями собственной ангарской популяции, достаточно давно отделившейся от байкальских. Данные по размерам геномов, филогении и экспериментальному скрещиванию представителей байкальских криптических видов E. verrucosus опубликованы в статье в журнале IJMS (IF=6, Q1, doi: 10.3390/ijms231810858).

Аннотация результатов, полученных в 2023 году
В 2023 г. продолжена работа по оценка размера геномов амфипод Байкальского региона. В частности, установлено сходство размеров геномов экологически схожих, но не сестринских видов Eulimnogammarus cyaneus и E. messerschmidtii — интересный факт, который заслуживает более подробного изучения на уровне секвенирования для изучения повторов. Кроме того, был изучен размер генома голарктического вида G. lacustris, обитающего в мелководных заливах Байкала и других водоёмах Байкальского региона. Оценка размера генома этого вида оказалась меньше, чем известные значения для представителей этого морфологического вида из других точек. Наконец, был изучен род Ommatogammarus, включающий 6 видов и подвидов глубоководных падальщиков, 4 из которых генетически не были изучены. Чтобы уточнить филогению этого рода, мы провели секвенирование участка гена первой субъединицы цитохром c-оксидазы (COI) и подтвердили близкое родство изученных видов, а также выявили, что три морфологических подвида O. carneolus соответствуют двум генетическим группам. Согласно молекулярной датировке, последний общий предок O. carneolus существовал около 3 млн. лет назад, а всего рода Ommatogammarus — около 4,6 млн. лет назад. Затем мы изучили размер геномов трёх видов (O. flavus, O. albinus и подвида O. carneolus melanophthalmus) и выявили, что он коррелирует с размером тела, но не с предпочитаемым диапазоном глубин. В рамках изучения структуры геномов проведено ознакомительное секвенирование геномов трёх видов E. verrucosus, E. vittatus и E. cyaneus, а также Baikalogammarus pullus (имеет наименьший среди байкальских амфипод размер генома). Мы обнаружили, что большинство повторов во всех этих геномах является сателлитами. Состав повторов внутри трёх биологических видов, входящих в морфологический вид E. verrucosus, принципиально схож, в то время как различия повторов в геномах этих видов и в геномах E. vittatus и E. cyaneus гораздо более значительны. Это очень интересный результат, поскольку согласно оценке методом молекулярных часов время существования общего предка трёх видов внутри группы E. verrucosus составляет около 4,5 млн лет, возраст общего предка E. verrucosus и E. vittatus составляет всего лишь около 6,5 млн лет. Также получены длинные чтения генома E. verrucosus W с помощью технологии Oxford Nanopore. Для аннотации собраны наборы последовательностей рамок считывания консервативных генов из сборок транскриптомов (выявлены полные последовательности 93,2 % универсальных однокопийных ортологов, характерных для членистоногих) и отдельных хорошо изученных семейств генов (hsp70, опсинов, ABC-транспортёров). В текущем году были завершены эксперименты по скрещиванию представителей трёх байкальских криптических видов E. verrucosus. В них наблюдали связь между образованием прекопул и выживаемостью самок: во всех экспериментах, где образование прекопул было сильно затруднено, число самок быстро падало. Эти результаты говорят о наличии агрессии в случаях, когда представители родственного вида не воспринимаются животными как потенциальные половые партнёры. Возможно, это один из механизмов изоляции, способствующих видообразованию. В течение всего эксперимента проводили сбор выпавших яиц и оценивали стадию их развития. Экспериментальные и контрольные скрещивания принципиально различались: в то время как в контрольных последовательно наблюдали различные стадии развития эмбрионов, в экспериментальных скрещиваниях преобладали эмбрионы на стадии «футбольного мяча», т.е. их развитие останавливалось. Наконец, в эксперименте наблюдали выход молоди и в контрольных скрещиваниях, и в некоторых экспериментальных комбинациях, хотя и в существенно меньшем количестве. Таким образом, расширенный эксперимент показал, что виды внутри E. verrucosus разделены презиготическим и постзиготическим репродуктивными барьерами, и хотя оба барьера не абсолютны, их сочетание способно обеспечить репродуктивную изоляцию при встрече представителей разных линий. Кроме того, для сравнения начаты аналогичные эксперименты для двух других массовых литоральных видов, E. vittatus и E. cyaneus, из местообитаний, разделённых истоком р. Ангары. Также для этих видов изучено разнообразие ядерного маркера, фрагмента гена 18S рРНК, в этих местообитаниях, поскольку таких данных ранее не было. В случае E. vittatus, подразделённого по последовательности COI, было показано наличие постзиготического репродуктивного барьера, а также то, что разделение истоком р. Ангары видов поддержано 18S, хотя различие и составляет всего одну замену. В случае E. cyaneus (у этого вида по разным сторонам истока Ангары обитают популяции с одинаковым разнообразием гаплогрупп COI) предварительные данные секвенирования 18S также показали различие в одну замену, что позволяет предположить, что поток генов между этими популяциями отсутствует. Эксперимент по выбору партнёра для спаривания не показал какого-либо существенного предпочтения животных из той же популяции. В скрещиваниях наблюдали выход молоди во разных комбинациях. Мы можем сделать предварительный вывод о репродуктивной совместимости представителей вида из местообитаний, разделённых истоком р. Ангары. В совокупности полученные данные позволяют предположить, что слабое генетическое разделение E. cyaneus могло сформироваться при возникновении русла р. Ангары. В совокупности данные по изучению репродуктивной изоляции для двух видов позволяют заключить, что для данных видов кластеры по маркеру COI совпадают с биологическими видами. В отчётном периоде был завершён первый анализ разнообразия генетического происхождения E. verrucosus в реке Ангаре. Всего за 2022 и 2023 гг. было проанализировано 149 образцов из 17 точек по обоим маркерным генам. Новые данные принципиально не изменили предварительные выводы, сделанные ранее при анализе образцов из Иркутска (преобладание линии S и новой линии A), однако позволили их существенно дополнить. Мы обнаружили, что на правом берегу Ангары (с этой стороны от истока в Байкале обитает вид E. verrucosus W) в точке на расстоянии 600 м от истока уже встречаются представители вида S совместно с представителями W, что говорит о конкуренции этих видов у истока реки. В этой работе мы наши в р. Ангаре новую генетическую линию E. verrucosus, не соответствующую ни одной из байкальских. Согласно данным по оценке возраста последнего общего предка, ангарская линия отделилась от предков других E. verrucosus первой около 5,5 миллионов лет назад. Мы не нашли образцов, которые бы принадлежали к разным линиям по разным маркерам (COI и 18S). По этим причинам мы предполагаем, что скрещивание между ангарской и другими генетическими линиями крайне маловероятно, и ангарскую линию возможно рассматривать как новый биологический вид и поднять до видового ранга после морфологического описания. Данные по молекулярно-генетической характеристике видов рода Ommatogammarus опубликованы в статье «Comparison of olfactory sensilla structure in littoral and deep-water amphipods from the Baikal region» в журнале Inland Water Biology (IF=0,686, Q3), https://doi.org/10.1134/S1995082923050140. Результаты анализа филогении суперсемейства ABC-транспортёров у байкальских амфипод по данным секвенирования транскриптомов для последующей аннотации генома вошли в статью «The ABCs of the amphipod P-glycoprotein: Heterologous production of the ABCB1 protein of a model species Eulimnogammarus verrucosus (Amphipoda: Gammaridae) from Lake Baikal», опубликованную в журнале Comparative Biochemistry and Physiology, Part C (IF=4,52, Q1), https://doi.org/10.1016/j.cbpc.2023.109677. По данным о генетического разнообразии и происхождении E. verrucosus в реке Ангаре подготовлена статья «Genetic diversity in a Baikal amphipod species Eulimnogammarus verrucosus in Angara, the only outflow of Lake Baikal: A novel lineage and possible competition at the river source».