Аннотация результатов, полученных в 2022 году
Диатомовые водоросли являются интересным объектом, как с фундаментальной точки зрения благодаря их уникальным оптическим и механическим свойствам, так и с прикладной точки зрения для решения задачи экстракции и переработки углекислого газа с помощью биореакторов, в которых мониторинг in situ будет проводится с помощью оптофлюидики. Оптофлюидика - это новое направление науки и техники, которое комбинирует оптические сенсоры и микрофлюидные чипы в одном устройстве [A. Kuzin et al, Analytical Chemistry 2022, 94, 14517]. Было разработано микрофолюидное устройство, которое позволяет с помощью оптической микроскопии изучать процессы происходящие на уровне одной клетки, в том числе визуализировать их деление in situ варьируя температуру и концентрацию углекислого газа. В ходе выполнения первого года проекта был разработан реактор для выращивания диатомей из коллекции ЛИ СО РАН и ФГБУН «Карадагская научная станция им. Т.И.Вяземского - природный заповедник РАН» с перемешиванием и возможностью подачи контролируемого количества углекислого газа. Биореактор разработан на основе химического реактора ТетраКвант CR-1B (ТетраКвант, РФ). Особенностью мониторинга роста водорослей в таком реакторе будет то, что анализ состояния водорослей оптическими методами будет осуществляться путем забора части образца и его анализа в микрофлюидном устройстве. Поэтому задача разработки микрофлюидных устройств является одной из важнейших задач проекта. Для оптического мониторинга роста диатомовых водорослей было разработано устройство, измеряющее пропускание кюветы содержащей диатомовые водоросли на одной длине волны (505 нм). Получены зависимости пропускания от концентрации диатомовых водорослей разных линий, которые отличаются друг от друга размером и формой. Установлено, что зависимости пропускания от концентрации линейны, что хорошо коррелирует с данными полученными на коммерческом спектрофотометре для зависимости оптической плотности от концентрации. Диатомовые водоросли различных линий охарактеризованы светлопольной и флуоресцентной микроскопией и произведена оценка их характерных размеров. Получена концентрационная зависимость тангенса угла зависимости пропускания и оптической плотности от объема единичной клетки диатомовых водорослей характерных для соответствующий линий диатомовых водорослей. Данная зависимость является монотонной и возрастающей. Тангенс угла наклона зависимости пропускания и экстинкции от концентрации водорослей является важным параметром, характеризующим эффективность фотосинтеза, а значит и производство биомассы, поскольку он зависит только от концентрации поглощающих хромофоров в одной клетке и рассеяния от одной клетки, которая определяется размером и формой диатомовых водорослей. [J.Cvjetinovic, S.A. Perkov, M.A. Kurochkin, I.S. Sergeev, S.V. German, Y. D. Bedoshvili, N.A. Davidovich, A.M. Korsunsky, D. A. Gorin, Concentration dependence of optical transmission and extinction of different diatom cultures, Journal of Biomedical Photonics and Engineering, accepted]. Поскольку оптоакустический подход для мониторинга роста диатомовых водорослей представляется перспективным, то наряду с изучением оптических свойств в проекте большое внимание уделялось изучению механических свойств диатомовых водорослей. Сотни миллионов лет эволюции оптимизировали неорганическую оболочку (панцирь) планктонных диатомовых водорослей с точки зрения уникального сочетания прочности и легкости. Это стало возможным в результате поиска оптимума между размерами, прежде всего толщиной оболочки и количеством и расположением перфораций на поверхности оболочки. Важным фактором является также присутствие органической фазы в диатомовых водорослях, которая может оказывать существенное влияние и на механические свойства диатомовых, поэтому задача исследования механических свойств клеток диатомовых водорослей, как высушенных на воздухе, так и влажных, и их сравнение с механическими свойствами панцирей является важной задачей, интересной не только с фундаментальной, но и точки зрения их практического использования. Прикладная значимость этих исследований связана с возможностью использования бионического принципа (характерные размеры, толщины, количество и размер перфораций в оболочке панциря) для разработки и создания чувствительных мембран для МЭМС устройств и устройств на основе фотонных интегральных схем для создания химических и акустических сенсоров широкого спектра применения, включая медицину, биотехнологию, экологический мониторинг, а также в использовании оптоакустики для мониторинга роста диатомовых водорослей. Особенностью проводимых нами исследований является изучение механических свойств внутренней и внешней частей очищенных панцирей, в целом панциря, и отдельных неочищенных высушенных на воздухе и влажных клеток в нано- и микромасштабах, а также в статической и динамической модах. Данные результаты были получены с использованием современных методов нано- и микроиндентирования при помощи сканирующей зондовой микроскопии реализующих две моды - АСМ, путем получения кривых сила-расстояние и двухчастотной резонансной АСМ, а также подхода, позволяющего проводить in situ индентирование под контролем сканирующей электронной микроскопии. В результате проведенных исследований установлено, что модуль Юнга отдельных неочищенных клеток существенно выше (E=25±5 GPa) по сравнению с очищенными оболочками (E=15±2 GPa (внутренняя часть панциря) и E=10±4 GPa (внешняя часть панциря)). [J.Cvjetinovic, S.Yu.Luchkin, E.S.Statnik, N.A.Davidovich, P.A. Somov, A.I. Salimon, A.M. Korsunsky, D.A. Gorin, Nature’s glass lace: the nanomechanics of diatom silica frustules, Scientific Reports, under review]. В ходе выполнения проекта для мониторинга роста водорослей использовались такие методы, как флуоресцентная томография и оптоакустическая микроскопия, измерение спектров экстинкции и флуоресценции. Была получена хорошая корреляция между данными, полученными флуоресцентной томографией и оптоакустической микроскопией. Это означает, что измерение интенсивности флуоресценции и интенсивности оптоакустического отклика на характерных длинах волн для диатомовых водорослей является перспективным для мониторинга роста диатомовых водорослей и будет реализовано при дальнейшем выполнении проекта. Необходимо отметить, что в ходе первого года проекта в лаборатории биофотоники Сколтеха при финансовой поддержке данного РНФ было оборудовано помещение приборами, позволяющими культивировать и исследовать диатомовые водоросли, в том числе при различных температурах и концентрациях углекислого газа. На странице сайта лаборатории можно ознакомится кратким описанием РНФ проекта, его исполнителями, и увидеть фотографии приобретенных приборов и созданных в ходе выполнения проекта [http://biophotonicsskoltech.ru/diatoms_rsf.html]. Научные результаты полученные в ходе выполнения работы докладывались в виде устных, в том числе приглашенных и пленарных докладов на следующих конференциях: the 6th International Conference on the Physics of Optical Materials and Devices & the 5th International Workshop of Persistent and Photostimulable Phosphors, (Belgrade, Serbia) - устный доклад, Saratov Fall Meeting XXVI (Saratov, Russia) - устный доклад, IV Школа молодых ученых «Наноструктурные материалы с управляемыми свойствами» (Москва, Губкинский университет) - пленарный доклад, Биосистемы: организация, поведение, управление — 75-я Всероссийская с международным участием школа-конференция молодых ученых (Нижний Новгород) - пленарный доклад. На основе научных результатов, полученных в ходе выполнения проекта, были подготовлены следующие публикации: 1 статья опубликована в Analytical Chemistry (Q1), 1 статья принята к печати в Journal of biomedical photonics & engineering(Q2), 1 глава в книге принята к печати (издательство Wiley-Scrivener, Beverly, MA, USA), 1 тезисы конференции, 1 статья находится на рецензировании в журнале Scientific Reports (Q1)

Аннотация результатов, полученных в 2023 году
В ходе выполнения НИР в рамках второго этапа проекта были получены результаты, которые можно условно разделить на две части. Первая связана с созданием приборно-технологической базы для исследований и культивации диатомовых водорослей, вторая посвящена непосредственно исследованию морфологии, оптических, оптоакустических и механических свойств диатомовых водорослей. В рамках выполнения приборно-технологической части работы: 1. Разработан фотоколориметр, оперирующий на трех длинах волн (460 нм, 505 нм, 640 нм), совместимый с фотобиорекатором. Оценка точности измерений оптической плотности была проведена с помощью коммерческого спектрофотометра с использованием гидрозолей маггемита, а также была продемонстрирована возможность использования разработанного прибора для оценки состояния культивируемых диатомовых водорослей. 2. Была значительно переработана конструкция фотобиореактора, разработан новый блок управления и специализированное ПО. Повышена степень автоматизации процессов, количество насосов увеличено с 2 до 4-х. Новая конструкция адаптирована под применение в условиях биологической лаборатории. Камера для культивирования и ресивер автоклавируются и подключаются к системе через мембранные фильтры. Повышен контроль освещения водорослей с помощью программируемого изменения яркости и применения светонепрозрачных створок осветителя. 3. Схема установки на основе микрофлюидного устройства для визуализации деления диатомовых водорослей была переработана. Была уменьшена вероятность попадания солей на поверхность датчика СО2 и увеличена инертность изменения концентрации СО2. Увеличена стабильность поддержания уровня СО2 внутри системы аэрации при поддержании концентрации других газов равным таковой в атмосфере. Увеличена стабильность прокачки питательной среды через проточную ячейку. Были испытаны три типа конструкции проточной ячейки. Выявлены преимущества и недостатки испытанных типов проточных ячеек. Разработанные приборы и устройства будут использованы для выполнения задач третьего этапа проекта. Вторая часть результатов связана с исследованием морфологии, оптических, оптоакустических и механических свойств диатомовых водорослей: 1. Были проведены измерения спектров экстинкции в разных частях отдельных живых клеток C. oculus-iridis и створок, очищенных от органики, в ходе которых были выявлены пики поглощения, соответствующие хлорофиллу а, хлорофиллу с и каротиноидам. Также были проведены оптоакустические измерения четырех разных видов диатомовых водорослей (B. titiana, C. oculus-iridis, Amphipleura sp., U. acus) при разных концентрациях, которые показали линейное уменьшение интенсивности оптоакустического сигнала с уменьшением концентрации. Помимо этого было показано, что интенсивность флуоресцентного и оптоакустического сигналов C. оculus-iridis уменьшается линейно с уменьшением концентрации клеток, а интенсивность флуоресценции Nitzschia sp. растет с увеличением солености при всех длинах волн возбуждения. Интенсивность оптоакустического сигнала Nitzschia sp. также зависит от солености и максимум наблюдается при 100 ‰; 2. Было показано, что время жизни флуоресценции для различных видов морских диатомей варьируется от 0,4 до 0,8 наносекунд. Пресноводные диатомеи также обладают различными временами жизни флуоресценции. Например, у A. formosa - 0,5 нс, а у Amphipleura sp. - 1,1 нс. Также исследования показали отсутствие связи между соленостью питательной среды и временем жизни флуоресценции: время жизни Nitzschia sp. при различных соленостях составляет 250-400 пс; 3. Было показано, что диатомовые водоросли C. oculus-iridis реагируют на соленость, к которой они были адаптированы, с оптимальными соленостями при 36‰ и 26‰, соответственно. 4. Был изучен рост Nitzschia sp., выращенного в среде ESAW с разной соленостью (20, 40, 60, 80, 100 и 150 ‰). Результаты экспериментов показали замедление роста при соленостях 40 и 80‰ на 10-й день, а при 60 и 100‰ на 15-й день. Оптимальная освещенность для вегетативного роста данного вида близка к 1,5 клк. Экспериментально было показано, что темп деления не зависит от длины клеток. Впервые описаны особенности морфогенеза створок и ультраструктуры клеток штамма Nitzschia sp., клетки которого росли в среде с соленостью от 20 до 150 ‰. Было показано, что количество аномалий в развитии кремнеземных створок возрастало при солености среды 60 ‰, при этом был выявлен механизм образования створок с нарушенной морфологией - формирование необычного утолщенного полисахаридного слоя оказывало влияние на происходящий одновременно с этим морфогенез створки. Выбраны наиболее подходящие штаммы диатомовых водорослей для выращивания при пониженных температурах - Ulnaria acus LT200 и Hannaea baicalensis BK479. 5. Мониторинг деления культур C.oculus-iridis в проточной кювете показал отсутствие деления клеток в течение 20-46 часов при повышенных концентрациях углекислого газа (900-2500 ppm), в отличие от первого этапа проекта, где было зафиксировано их деление при концентрации углекислого газа 500 ppm. 6. Расчеты резонансных частот панцирей C. oculus-iridis в диапазоне 1-8 МГц, выполнены с помощью COMSOL Multiphysics были впервые экспериментально подтверждены с помощью оптической системы атомно-силового микроскопа. Знание резонансных частот диатомей необходимо, чтобы воспроизвести их «природный дизайн» при изготовлении элементов миниатюрных устройств - микроэлектромеханических систем либо фотонных интегральных схем. 7. Результаты, полученные с использованием атомно-силовой микроскопии, показали, что модуль Юнга для Nitzschia sp. изменяется в пределах от 26 до 33 ГПа в зависимости от солености среды и не показывает статистически значимой корреляции с уровнем солености. Также было показано, что модуль Юнга уменьшается от стороны к центру панциря C. oculus-iridis, а его значения в зависимости от места вдавливания могут изменяться пятикратно. Полученные научные результаты были опубликованы в 2 статьях в Q1 журналах Scientific Reports и Applied Physics Letters, 1 статье в Q2 журнале Materials Today: Proceedings, 1 тезисах на международной конференции. Исполнитель проекта Юлияна Цветинович успешно защитила диссертацию “Оптические и механические свойства структурных элементов диатомовых водорослей”(https://www.skoltech.ru/obrazovanie/zashhity-phd/yuliyana-tsvetinovich/) и продолжает работать над проектом в качестве научного сотрудника. Результаты НИР обсуждались на профильных научных конференциях в РФ и за рубежом. Всего было сделано 3 устных доклада и один приглашенный.