КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

Номер 22-14-00232

НазваниеРоль NeuroD2/6 и WWP1/2 в формировании кортико-кортикальных связей

РуководительБабаев Алексей Александрович, Кандидат биологических наук

Прежний руководитель Тарабыкин Виктор Степанович, дата замены: 27.06.2023

Организация финансирования, регион федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Национальный исследовательский Нижегородский государственный университет им. Н.И. Лобачевского", Нижегородская обл

Период выполнения при поддержке РНФ

2022 г. - 2024 г.

Конкурс№68 - Конкурс 2022 года «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований отдельными научными группами».

Область знания, основной код классификатора 04 - Биология и науки о жизни, 04-106 - Биология развития

Ключевые словаNeuroD2/6, WWP1/2, кортико-кортикальные связи, навигация аксонов

Код ГРНТИ34.15.23

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ

Аннотация
Кора головного мозга является венцом эволюции млекопитающих. Она отвечает за абстрактное мышление и другие высшие когнитивные способности, которые отличают человека от других приматов. Нарушение развития коры приводит к широкому спектру патологий у человека, которые называются пороками развития коры головного мозга (Malformations of Cortical Development, MCD). Обмен информации между нейронами разных полушарий головного мозга необходим животным с билатеральной нервной системой. Пучки аксонов, называемые комиссурами, пересекают среднюю линию больших полушарий мозга для того, чтобы координироватъ задачи, требующие прямого обмена информацией между разными регионами коры. Мозолистое тело (СС) - самая большая комиссура в организме человека, содержащая около 80% комиссуральных аксонов всего головного мозга. Мозолистое тело в большой степени отвечает за эффективность разных аспектов высшей нервной деятельности, включая функцию исполнения решений, социальное взаимодействие, память и язык. Частичная или полная потеря мозолистого тела называется агенезией мозолистого тела (agenesis of the corpus callosum, АСС) и встречaется в более чем 70 врожденных синдромах у человека. АСС может быть вызван множеством факторов и может присутствовать либо в чистом виде, либо в сочетании с другими врожденными синдромами. В течение последних десятилетий было идентифицировано много генов, которые необходимы для нормального формирования мозолистого тела (Donahoo and Richards 2009). Большинство из них контролируют слияние полушарий головного мозга в процессе развития в районе средней линии или пересечение средней линии аксонами мозолистого тела (Fenlon and Richards 2015). Однако очень мало известно о механизмах, которые непосредственно контролируют начальные этапы роста и навигации аксонов мозолистого тела в ипсилатеральной коре. Существует два транскрипционных фактора Satb2 и NeuroD2/6, роль которых в начальной фазе роста аксонов была открыта в нашей лаборатории (Britanova et al., 2008; Srivatsa et al., 2014, Bormuth et al., 2013). В последние несколько лет нами были идентифицированы молекулярные каскады зависимые от активности Satb2, которые необходимы для инициации роста аксонов мозолистого тела. В частности, в процессе выполнения проекта РНФ, 19-14-00345, было показано, что Sema7A является ключевым белком необходимым для инициации роста ахонов мозолистого тела. Однако следующий после инициации этап формирования мозолистого тела, - навигация аксона по направлению к средней линии больших полушарий мозга и пересечение её, не до конца изучен. В частности, нам удалось не только показать, что транскрипционая активность хотя бы одного из двух транскрипционных фактора семейства NeuroD: NeuroD2 и NeuroD6, абсолютно необходима для этого процесса, но и идентифицировать один из белков, EfnA2, играющих важную роль в этом процессе. Тем не менее ключевые молекулы необходимые для навигации аксонов в сторону средней линии больших полушарий так и не были найдены и изучены. Недавно нами также было обнаружено неожиданное сходство фенотипов NeuroD2 и NeuroD6 двойного нокаута и двойного нокаута убиквитин лигаз WWP1 и WWP2. В частности, у мышей с двойным нокаутом по генам WWP1 и WWP2, также как и у мышей с двойным нокаутом по генам NeuroD2 и NeuroD6 наблюдается агенезия мозолистого тела и аналогичные нарушения дифференцировки нейронов. Полное понимание процесса навигации аксонов коры головного мозга и формирования межполушарных связей позволит создать новые животные модели, которые можно будет использовать в качестве моделей пороков развития коры головного мозга человека вообще и ACC в частности. Это, в свою очередь, поможет понять роль мозолистого тела в функционировании мозга и поможет разработать рекомендации для постнатального лечения детей с диагнозом АСС, а также будет иметь значение для пренатальной диагностики таких пациентов. Целью данного проекта является идентификация и дальнейшее изучение молекулярного каскада активируемого транскрипционными факторами NeuroD2 и NeuroD6 и убиквитин лигаз WWP1/WWP2 в нейронах коры головного мозга. В частности, мы планируем идентифицировать и охарактеризовать гены-мишени этих транскрипционных факторов, которые необходимы для безошибочной навигации аксонов коры головного мозга, образующих межполушарные связи. Мы планируем найти гены, восстановление экспрессии которых в коре головного мозга мутантных мышей с двойным нокаутом NeuroD2 и NeuroD6, и WWP1/WWP2 приводит к восстановлению формирования мозолистого тела. Кроме того, в рамках данного проекта будет проведено исследование молекулярных и генетических взаимодействий двух молекулярных каскадов: NeuroD2/D6 и WWP1/WWP2.

Ожидаемые результаты
В ходе выполнения проекта будут идентифицированы прямые мишени транскрипционных факторов NeuroD2 и NeuroD6 в нейронах коры головного мозга. Среди мишеней NeuroD2 и NeuroD6 будут идентифицированы те мишени, которые непосредственно контролируют поздние этапы навигации аксонов мозолистого тела. Будут подробно изучены взаимодействия и общие молекулярные мишени NeuroD2 и NeuroD6 транскрипционных факторов с одной стороны, и WWP1/WWP2 убиквитин лигаз с другой стороны. Также будут идентифицированы молекулярные основы этих взаимодействий. С другой стороны, мы планируем идентифицировать те компоненты сигнальных каскадов, контролируемых факторами транскрипции NeuroD2/6 и убиквитин лигазами WWP1/WWP2 , которые необходимы для поздних этапов навигации аксонов коры головного мозга. Это поможет понять молекулярные механизмы формирования кортико-кортикальных нейрональных связей. Результаты этого проекта могут быть полезны для разработки новых подходов к пренатальной диагностики синдромов вызванных нарушениями развития коры.

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

Аннотация результатов, полученных в 2022 году
Был выполнен сравнительный транскриптомный анализ мРНК единичных клеток коры головного мозга мышей NeuroD2/6 dKO и дикого типа. Полученные данные были проанализированы с помощью платформы Reactome (https://reactome.org/PathwayBrowser/#/). Аналогичный анализ транскриптома провели и для коры головного мозга мышей WWP1/WWP2 dKO. При Reactome анализе нами было обнаружено, что Erk и Ntf3 каскады являются основными мишенями NeuroD2/6, в то время, как основным каскадом в WWP1/2 нокауте - ErbB. Раннее нами было обнаружено, что неканонический сплайс-вариант рецептора TrkC (TrkC-T1) является, с одной стороны, рецептором Ntf3, а с другой - контролирует активность Erk киназы и, таким образом, влияет на формирование цитоархитектуры коры и кортико-кортикальных связей. Также было показано, что многие РНК-связывающие белки (RBP) играют решающее значение в кортикогенезе. Чтобы идентифицировать такие белки, мы предприняли биоинформатический поиск РНК-связывающих белков, которые экспрессируются в коре в процессе развития и могут связываться с пре-мРНК TrkC. Для этого нами были использованы четыре онлайн-инструмента (CISBP39, RBPDB40, ATtRACT41 и RBPmap42) и две базы данных, содержащие паттерны экспрессии (http://genebrowser.unige.ch/telagirdon/; и https://developingmouse.brain-map.org). Таким образом, нами было обнаружено 32 фактора сплайсинга (SF), которые удовлетворяли требованиям. Чтобы проверить, регулирует ли какой-либо из этих факторов баланс транскриптов TrkC-T1:TrkC-TK+ (TrkC-TK+, канонический вариант содержащий киназный домен), мы исследовали влияние отдельных факторов путем подавления экспрессии с помощью siРНК. Для этого были заказаны 32 набора соответствующих siРНК и использованы в экспериментах с клеточной линией N2A. Оказалось, что оба варианта, как T1 так и TK+ присутствуют в данной клеточной линии. Соотношение T1 к TK+ оценивалось с использованием Real Time ПЦР, различающего оба сплайс-варианта. Оказалось, что из 32 протестированных факторов, два - Srsf1 и Elavl1, оказывают наибольшее влияние на альтернативный сплайсинг TrkC изоформ. Нокдаун Elavl1 увеличивал долю T1 в общем пуле транскриптов TrkC более чем на 30%, а нокдаун Srsf1, наоборот, уменьшал его почти на 15%. Таким образом, Srsf1 и Elavl1 смещали пропорцию T1 к TK+ в противоположные стороны.

Публикации

1. Гавриш М.С., Тутукова С.А., Бабаев А.А., Тарабыкин В.С. Поиск мишеней NeuroD и их вклад в навигацию аксонов мозолистого тела ФГАОУ ВО РНИМУ им. Н.И. Пирогова — Москва:Квант Медиа, Нейротехнологии будущего: тезисы участников конференции «Нейрокампус 2022 : старт!»/ФГАОУ ВО РНИМУ им. Н.И. Пирогова — Москва:Квант Медиа, 2022. — 130 с. (год публикации - 2022) https://doi.org/10.24412/CL-36983-2022-1-141-145

2. Тарабыкин В.С. Роль трансляции в судьбе нейронов ФГАОУ ВО РНИМУ им. Н.И. Пирогова — Москва:Квант Медиа, Нейротехнологии будущего: тезисы участников конференции «Нейрокампус 2022 : старт!»/ФГАОУ ВО РНИМУ им. Н.И. Пирогова — Москва:Квант Медиа, 2022. — 130 с. (год публикации - 2022) https://doi.org/10.24412/CL-36983-2022-1-8-9

3. - Виктор Тарабыкин: о роли генов в поведении человека, нелинейности прогресса и о любимых молекулах Биомолекула, 30 ноября (год публикации - )

Аннотация результатов, полученных в 2023 году
Была проведена сравнительная in situ гибридизация мРНК для генов Srsf1 и Elavl1 на срезах коры головного мозга на эмбриональных стадиях е12.5-е14.5 и е16.5. Экспрессия Srsf1 наиболее выражена в зонах активного нейрогенеза – вентрикулярной (VZ) и субвентрикулярной (SVZ) зонах, в то время как уровень экспрессии в дифференцирующихся нейронах интермедиальной зоны (IZ) и кортикальной пластины (CP) был значительно снижен. Напротив, мРНК Elavl1 были распределены более равномерно во всем неокортексе. На основе этих данных были выполнены эксперименты по инактивации и повышению экспрессии Srsf1 и Elavl1 на стадии е12.5. Повышение экспрессии Srsf1 увеличивает долю Ctip2 за счет пула Satb2 клеток, тогда как инактивация Srsf1 имела противоположный эффект. В отношении Elavl1 – увеличение экспрессии Elavl1 уменьшало долю Ctip2 клеток и увеличивало Satb2, а при инактивации Elavl1 наблюдался противоположный эффект. Следовательно, и Srsf1, и Elavl1 являются антагонистами в контроле выбора судьбы нейронов верхних и нижних слоёв, что также дополнительно подтверждается результатами in situ гибридизация мРНК. Более того, при помощи алгоритмов HBond и MAXENT, Ensembl был проанализирован экзон 13А, определяющий экспрессию TrkC-T1 изоформы, а также его взаимосвязь с Srsf1 и Elavl1. На основе полученных результатов была опубликована статья в журнале Nucleic Acids Res https://academic.oup.com/nar/article/51/19/10218/7269183

Публикации

1. Вебер А.И., Партасарати С., Борисова Е., Епифанова Е., Пройснер М., Русанова А., Амброцкевич М.С., Бесса П., Ньюман А.Г., Мюллер Л., Шаал Х., Хейд Ф., Тарабыкин В. Srsf1 and Elavl1 act antagonistically on neuronal fate choice in the developing neocortex by controlling TrkC receptor isoform expression Nucleic Acids Res, 51(19):10218-10237 (год публикации - 2023) https://doi.org/10.1093/nar/gkad703

2. Кондакова Е.В., Гавриш М.С.,Тарабыкин В.С., Ян К. NeuroD 2/6 регулируют баланс экспрессии транскрипционных факторов, контролирующих цитоархитектуру коры головного мозга Гены и клетки, Т. 18, No 4. (год публикации - 2023) https://doi.org/10.23868/gc568125