Аннотация результатов, полученных в 2022 году
В ходе реализации проекта проведена серия поведенческих экспериментов с личинками Danio rerio на разных стадиях развития. Оценивалась значимость поведенческих показателей для оценки воздействия следующих переменных факторов: наличие депривации или нормального цикла сна, воздействие ингибитора EGFR, и ротенона, который нарушат работу дофаминовой системы и снижает выработку дофамина. Личинки данио подверженные ингибитору PD168393 были дополнительно морфологически изучены на предмет аномалий миграции клеток нервного гребня, количества шванновских клеток и развития симпатических и хромаффинных клеток. Экспериментально выявлено, что EGFR ингибитор (PD 168393) добавленный на стадии 16 часов после оплодотворения (стадия миграции клеток нервного гребня) в течении двух часов способен нарушать миграцию SOX10-иммунопозитивных клеток нервного гребня и нерв-ассоциированных Шванновских клеток личинок данио. Ингибитор PD168393, добавленный на16 часов после оплодотворения вызывал снижение количества TH+/HuC/D+--иммунопозитивных симпатических нейронов в верхнем шейном узле и симпатической цепочке на 51% ± 0.58 и 58% ± 0.71 соответственно. У личинок, обработанных ингибитором PD 168393 на 24 ч. после оплодотворения снижение количества симпатических нейронов было ещё более выраженно – 66% ± 1.11. У личинок, обработанных ингибитором PD 168393 на 33 ч. и 48 ч. после оплодотворения не было зарегистрировано никакой разницы по сравнению с контрольной группой. Тем не менее, положение симпатической цепи было нарушено в сравнении с контрольными животными. Для личинок D.rerio после инкубации в ротеноне, проявлялись симптомы, подобные болезни Паркинсона. У личинок после инкубации в ротеноне повышалась скорость движения в то время, как депривация на для этих особей оказывала замедляющий эффект. У групп, подверженных депривации сна скорость движения была ниже. Показатели скорости движения с депривацией были ниже, чем у групп с ротеноном при нормальном цикле сна, но выше, чем у групп не подверженных влиянию ротенона, но подверженных депривации. При воздействии ингибитора EGFR, также, наблюдается статистически значимое повышение средней скорости групп (P<0.05). При совместном воздействии ингибитора EGFR и ротенона наблюдалось снижение средней скорости, как при воздействии депривации сна так и без него. В свою очередь, наблюдается снижение показателей у групп при совместном воздействии ротенона и ингибитора EGFR при депривации сна. Однако при нормальном цикле сна, в этой группе снижается только эффект повышения средней скорости от ингибитора EGFR, но не от ротенона. По результатам статистической обработки было выявлена значимая зависимость влияния исследуемых факторов и цикла сон-бодрствование. Также, из полученных данных можно сделать вывод о взаимосвязи EGFR системы и дофаминергической системы с циклом сон-бодрствование. Полученные данные о влиянии депривации сна на личиночные особи D.rerio после воздействия ротенона. За время работы, были новые данные о влиянии EGFR системы на цикл сон-бодрствование и ключевые нейрорегуляторные системы организма.Полученные результаты проекта могут помочь исследованиям человеческого сна, в частности, помочь лучше понять причины нарушений сна у человека.

Аннотация результатов, полученных в 2023 году
В процессе реализации проекта в 2023 году были выполнены эксперименты по выявлению уровня некоторых нейротрансмиттеров у данио, подверженных депривации сна у личинок данио (10 дней развития) в сравнении с контрольными личинками (без всякого воздействия). Показано ,что после депривации сна у данио наблюдается снижение общего серотонина у рыб. Причем, достоверные изменения был выявлены только в ЦНС, но не в ПНС. Биохимический анализ дофамина в личинках 10 дней развития (5 дней световой импульсной дипревации) не выявил никаких изменений в концентрации дофамина. Разработан протокол для окрашивания больших объектов. Биохимичекий анализ ГАМК в личинках 10 дней развития (5 дней световой импульсной дипревации) показал уменьшение ГАМК в ЦНС. После дипревации сна наблюдалось увеличение экспрессии орексинов 1 и 2 в гипоталамусе без изменение количества клеток. Используя имумногистохимический подход, а также трансгенную линию Hb9-GFP (не индуцибельная линия) у которой все моторные нейроны спинного могза экспрессируют белок GFP было показано ,что после депревации сна не происходит ни изменение количества нейронов спинного мозга ни изменения уровня экспресии GFP у трансгенных личинок. Данные были подтверждены иммутоцитохимией с помощью антител к ChAT – маркеру мотонейронов. Иммуномаркирвоание хромаффинных клеток ренальной железы и Sox10-иммунопозитивной глии не выявили видимых изменений в личинках после депревации Показано ,что беременные самки, подвергшиеся длительной (от 7 дней) депривации имели преждевременные роды (выметывание икры ) в 50% случаев. Кроме того, личинки которые выживали (70%) имели ретардацию развития на 24 часа в сравнении с контрольными особями. Проведен поведенческий тест с полученными личинками (shoaling test). Данный тест заключается в помещении группы конспецифичных рыб в новый аквариум и количественной оценке социальной сплоченности в группе рыб, которая часто измеряется средним расстоянием между членами (представлено стрелками). В результате теста рыбы с деривационный нагрузкой матери зачастую держались на длительном расстоянии от основного косяка. Эти данные указывают, что материнская депривация все же влияет на поведение мальков. Безусловно, полученные данные имеют больше прикладное значение, поскольку вносят вклад в понимание появления психических расстройств ,включая аутизм у детей которое зависит от состояние материнского организма. Используя метод CLICK-реакции после инкубации с EdU личинок данио после дипревации и без нее было показано, что даже длительная дипревация сна не оказывает влияние на пролиферацию ни 5-HT-, PHOX2b-, GABA- и dopamine- или орексин-иммунопозитивных нейронов. Видимо, для смерти нейронов необходимы более длительные промежутки депривации. Тем не менеее, даже недельная депривация сна личинок данио и взрослых особей не вызвала пролиферативной разницы между эспериментальными и контрольными рыбами. Разработано новое программное обеспечение для оценки поведение личинок. Данная программа которое позволяет отслеживать нескольких животных одновременно, сохраняя их идентичность даже при наличии окклюзий (потеря непрерывности изображение) и генерирует результаты по общему расстоянию и скорости личинок D.rerio. Разработанное программное обеспечение, успешно апробировано. В 99% случаев были детектировать все животные находящиеся под видео наблюдением. При этом, в отличие от большинства доступных приложений для детекции, преимуществом разработанного нами программного обеспечение - это возможность обрабатывать большие видеофайлы (до 20 минут) и в высоком разрешении (2048 × 2048 пикселей). Данное программное обеспечение не использует дополнительные сервисы при обработке и выдает данные активности объекта в виде готовой таблицы параметров движения. Новое программное обеспечение отслеживает движение групп до 30 особей личинок D.rerio, несмотря на небольшие размеры животных. Разработанная программа является удобным инструментом для корректного анализа поведения объектов в норме и при разного рода экзогенных и эндогенных воздействий и может быть использовано как в фундаментальных, так и в прикладных биомедицинских исследованиях, включая нейрофармакологию и тестирование лекарственных препаратов нового поколения. Получены эмбрионы с Crispr-Cas9 редактированием.