КАРТОЧКА
ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ
Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.
ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ
Номер 22-14-00278
НазваниеТранслирующая рибосома – конформационные основы функционирования и ингибирования
РуководительКоневега Андрей Леонидович, Кандидат физико-математических наук
Организация финансирования, регион Федеральное государственное бюджетное учреждение "Петербургский институт ядерной физики им. Б.П. Константинова Национального исследовательского центра "Курчатовский институт", Ленинградская обл
| Период выполнения при поддержке РНФ | 2022 г. - 2024 г. |
Конкурс№68 - Конкурс 2022 года «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований отдельными научными группами».
Область знания, основной код классификатора 04 - Биология и науки о жизни, 04-202 - Протеомика; структура и функции белков
Ключевые словарибосома, трансляция, антибиотики, биосинтез белка, криоэлектронная микроскопия
Код ГРНТИ34.15.15
ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ
Аннотация
Пандемия новой коронавирусной инфекции в очень доступной форме продемонстрировала всему миру, насколько уязвимой является наша цивилизация, неспособная остановить распространение вирусной инфекции. В борьбе с бактериальными инфекциями на сегодняшний день позиции человечества довольно уверенные, однако постепенное возникновение и распространение бактериальных штаммов, устойчивых к применяемым антибиотикам, не может не привлекать внимание специалистов. Более того, эпидемическая, психологическая и экономическая обстановка последних лет может сыграть существенную роль в повышении количества необоснованно используемых антибиотиков и привести к угрожающему по масштабам распространению суперрезистентных бактерий. Для решения этой проблемы необходимо расширение спектра эффективных терапевтических препаратов, что требует объединенных усилий в области фундаментальных исследований и практической реализации в фармацевтической индустрии. Двумя наиболее перспективными направлениями являются 1) скрининг коллекций с природными и синтезированными соединениями для обнаружения веществ с антибактериальными свойствами и 2) изучение молекулярного механизма действия известных ингибиторов – антибиотиков, для последующего направленного создания модифицированных препаратов. Поскольку белоксинтезирующий аппарат бактерий является мишенью для 50% антибиотиков, применяемых на сегодняшний день, обоснованным является пристальное внимание, обращаемое на ингибиторы эффективной работы рибосомы. Последние исследования убедительно показывают, что для определения механизма действия антибиотика важно оценить влияние ингибитора на сложный динамический процесс последовательных конформационных изменений структурных элементов рибосомы и ее субстратов: матричной и транспортных РНК, а также факторов элонгации. В данном проекте комбинация ультрасовременных флуоресцентных методов предстационарной кинетики и микротермофореза, а также времяразрешенной криоэлектронной микроскопии будет использована для выяснения молекулярного механизма отдельных реакций цикла трансляции, а именно всех этапов доставки аминоацилированной тРНК в А сайт рибосомы и механизма действия антибиотиков – специфических ингибиторов этих реакций. Также будет проводиться работа по усовершенствованию тест-системы для скрининга коллекций с природными и синтезированными соединениями, что позволит в дальнейшем повысить вероятность обнаружения веществ с антибактериальными свойствами.
Ожидаемые результаты
Для максимально полной характеристики всех этапов процесса доставки аминоацилированной тРНК в А сайт рибосомы мы ожидаем получение новых результатов по двум основным направлениям: (1) изучение нативного процесса доставки тРНК, в том числе с использованием модуляторов этого процесса, направление действия которых известно, (2) изучение ингибиторов биосинтеза белка, молекулярный механизм действия которых неизвестен, но предположительно связан с доставкой тРНК в А сайт рибосомы (мадумицин II, пролин-богатые пептиды, терморубин). Помимо этого, будет проводиться работа по адаптации тест-системы для поиска веществ, обладающих противобактериальной активностью, для использования в жидкой среде. Данная тест-система разрабатывалась для использования на агаризованных средах и успешно применялась для скрининга природных экстрактов и химически синтезированных соединений. Однако ее адаптация для использования в жидкой среде позволит значительно расширить возможности применения данной тест-системы.
Для выполнения первого пункта
1. Будет охарактеризована термодинамика и кинетика доставки тРНК в А сайт рибосомы в том числе с использованием различных модуляторов скорости и эффективности этого процесса (снижение температуры, вариация буферных условий, использование специфических ингибиторов, немодифицированной или частично модифицированной тРНК, тРНК с измененной нуклеотидной последовательностью, неканонических гуаниновых нуклеотидов, модификации элонгационного фактора);
2. С помощью кинетических данных будет идентифицировано временное окно, в течение которого происходят конкретные этапы доставки тРНК в А сайт рибосомы с образованием соответствующих интермедиатов;
3. Методами времяразрешенной криоэлектронной микроскопии будут получены структуры промежуточных состояний рибосомных комплексов в процессе доставки тРНК в А сайт рибосомы;
4. Будет проведен анализ полученных пространственных структур для установления соответствия конформационных изменений элементов рибосомы, тРНК и элонгационного фактора EF-Tu функциональным этапам, определенным с помощью предстационарной кинетики.
Для выполнения второго пункта
1. Будет изучена предстационарная кинетика доставки тРНК в А сайт рибосомы, а также, в случае необходимости, других этапов трансляции, термодинамические характеристики системы и структурные изменения рибосомного комплекса, лежащие в основе или сопровождающие ингибирующее действие антибиотиков с неизвестным механизмом действия.
Ожидаемые результаты обладают высокой значимостью для мирового научного сообщества, что подтверждается большим количеством высокорейтинговых публикаций по схожим тематикам (1-4). Можно сказать, что функциональное и структурное изучение трансляции и отдельных ее этапов является ярко выраженным трендом современной молекулярной биологии, несмотря на десятилетия исследований в этой области (6-11). Аппарат биосинтеза белка является одним из наиболее сложно устроенных макромолекулярных комплексов клетки и поэтому остается крайне интересным объектом для изучения с использованием постоянно совершенствующегося арсенала методов. Фундаментальная значимость ожидаемых результатов несомненна, а в случае выявления принципиальных закономерностей, результаты можно будет расширить и на другие макромолекулярные комплексы. Практическая значимость ожидаемых результатов заключается в том, что информация, полученная для системы, блокированной ингибитором-антибиотиком, позволит выявить детальный молекулярный механизм действия антибиотиков и даст информацию для направленной модификации ингибиторов и разработки новых антибактериальных препаратов, что является крайне актуальной задачей. Работа по усовершенствованию тест-системы для скрининга коллекций с природными и синтезированными соединениями имеет несомненную практическую значимость, так как позволит в дальнейшем повысить вероятность обнаружения веществ с антибактериальными свойствами.
ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ
Аннотация результатов, полученных в 2022 году
Была проведена адаптация тест-системы для поиска веществ, обладающих противобактериальной активностью, для использования в жидкой среде и ее апробация с использованием стандартных антибактериальных препаратов.
Использование тест-системы в жидкой среде позволяет отслеживать динамику изменений основных измеряемых параметров бактериальной культуры (плотность культуры, интенсивность сигналов флуоресценции обоих репортерных белков) и соотносить их между собой, предоставляя количественную оценку эффекта на любом временном отрезке исследования.
Было показано, что мадумицин неожиданно медленно связывается с рибосомным комплексом. Скорее всего это связано с необходимостью отгибать рибозу А76 ССА-конца Р-сайтовой тРНК. Увеличение времени инкубации антибиотика с рибосомными комплексами значительно повысило эффективность ингибирования образования пептидной связи. Было показано, что наличие мадумицина снижает прочность связывания тРНК в А сайте рибосомы и приводит к установлению нового равновесного состояния, которое в данных условиях эксперимента соответствует приблизительно 50% тРНК в А сайте без добавления антибиотика. Диссоциация тРНК происходит после гидролиза ГТФ, то есть параллельно с этапом аккомодации. Добавление стабилизатора кодон-антикодонового взаимодействия приводит к повышению уровня связывания тРНК почти до контрольных значений, однако даже такая стабилизация не приводит к формированию дипептида.
Были получены карты плотности кулоновского потенциала, в которые вписали модели 70S рибосом E. coli. Среднее разрешение полученных комплексов составило 2,2Å, что позволило однозначно вписать в плотность модели А- и Р-сайтовых тРНК, а также мадумицина. Было показано, что тРНК в Р сайте выглядит статично, видно отгибание рибозы А76 ССА-конца тРНК. В отличие от статично расположенной тРНК в Р сайте, тело тРНК в А сайте находится в дестабилизированном состоянии. Были проанализированы изменения положения 2 критически важных нуклеотидов пептидилтрансферазного центра: А2062 и U2506. В соответствии с крио-ЭМ данными, в обоих случаях имеет место не переключение из одного положения в другое, а изменение степени стабилизации. Так, в комплексе без мадумицина не обнаруживается плотность А2062, что говорит о подвижности этого нуклеотида в стандартных условиях, тогда как наличие мадумицина приводит к их взаимной стабилизации. Напротив, связывание мадумицина приводит к делокализации U2506, который в отсутствие антибиотика имеет четкое положение в пептидилтрансферазном центре. Таким образом, мы видим, что добавление антибиотика может приводить к нарушению старых контактов или формированию новых, однако, кристаллизация образца для рентгеноструктурного анализа приводит к чрезмерной стабилизации и потере информации о подвижности как отдельных нуклеотидов, так и целых лигандов.
Было показано, что наличие терморубина не оказывало влияния на скорость связывания тройного комплекса с рибосомой, но снижало скорость аккомодации тРНК в А сайте приблизительно 8 раз. Рибосомные комплексы, содержащие терморубин, были значительно менее эффективны в образовании дипептида (59% дипептида от контрольного уровня), что дополнительно подчеркивает влияние термомрубина на аккомодацию тРНК.
Рассчитанное сродство пептидил-тРНК к А сайту рибосомы, содержащей терморубин, было в 12 раз ниже по сравнению с рибосомными комплексами, не содержащими лекарственного средства. Снижение прочности взаимодействия пептидил-тРНК с А сайтом было связано с увеличением константы скорости диссоциации тРНК в присутствии антибиотика, при этом константа скорости реакции ассоциации мало зависела от наличия терморубина.
Публикации
1. Параньпе М.Н., Марина В.И., Грачев А.А., Мавиза Т.П., Толичева О.А., Полесскова Е.В., Остерман И.А., Сергиев П.В., Коневега А.Л., Поликанов Ю.С., Гагнон М.Г. Insights into the molecular mechanism of translation inhibition by the ribosome-targeting antibiotic thermorubin Nucleic Acids Research, - (год публикации - 2023)
Аннотация результатов, полученных в 2023 году
Пролин-богатые пептиды (ПБП) – это пептиды, эндогенно синтезируемые рядом животных и обладающие антибактериальной активностью. В данной работе был проведен функциональный анализ ингибирующего действия ПБП – представителя нового семейства ПБП жвачных.
Онкоцин-подобные ПБП связываются в выходном тоннеле бактериальной рибосомы и ингибируют трансляцию. Механизм ингибирования на сегодняшний момент неизвестен, однако на основании структурных исследований (рентгеноструктурный анализ рибосомных инициаторных комплексов с различными ПБП) предполагается, что N-концевая область ПБП выступает в область А-сайтовой щели и препятствует корректному расположению ССА-конца тРНК, доставляемой в А сайт рибосомы.
В данной работе было показано, что новый представитель ПБП входит в выходной тоннель в обратной ориентации относительно растущей полипептидной цепи и использует множественные водородные связи, стэкинг и взаимодействия Ван-дер-Ваальса, чтобы закупорить его. Более того, наличие ПБП полностью блокирует прохождение пептдилтрансферазной реакции, указывая на то, что основной ингибирующий эффект – нарушение трансляции на этапе реакции транспептидации, а не стерическая невозможность растущего пептида пройти в выходной тоннель рибосомы.
Среднее разрешение рибосомных комплексов, содержащих ПБП составило 1,95Å. Отчетливая плотность, наблюдаемая внутри выходного тоннеля рибосомы, может быть однозначно отнесена к аминокислотным остаткам 12–27 ПБП, находящегося в вытянутой конформации. Для первых 11 аминокислотных остатков N-концевой части ПБП не удалось обнаружить плотность, предположительно из-за ее подвижности. Можно предположить, что эта часть ПБП проникает в карман связывания А-тРНК.
Было показано, что антибиотик терморубин эффективно модулирует А-сайтовые реакции, в частности снижает скорость аккомодации тРНК. Было показано, что этот эффект зависит от нуклеотидной последовательности доставляемой тРНК, а также от наличия модификаций оснований тРНК.
Была разработана система детектирования пошагового синтеза пептидов при помощи их электрофоретического разделения в полиакриламидном геле в денатурирующих условиях с использованием флуорофора Bodipy. Данная методика позволяет идентифицировать вплоть до 0,1 пмоль пептида. Данный метод может использоваться для идентификации ингибиторов трансляции, а также для первичного определения механизма их действия (продемонстрировано на ингибиторах трансляции с известным механизмом действия).
Публикации
1. Марина В.И., Биджиева М., Терещенков А.Г., Орехов Д., Сагитова В.Е., Сумбатян Н.В., Ташлицкий В.Н., Ферберг А.С., Мавиза Т.П., Касацкий П., Толичева О., Полесскова Е.В., Польшаков А.И., Остерман И.А., Донцова О.А., Коневега А.Л., Сергиев П.В. An easy tool to monitor the elemental steps of in vitro translation via gel electrophoresis of fluorescently labelled small peptides RNA, - (год публикации - 2024)