КАРТОЧКА
ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ
Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.
ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ
Номер 22-14-00400
НазваниеСинтетическая биология агробактерий
РуководительМишин Александр Сергеевич, Кандидат биологических наук
Организация финансирования, регион Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук, г Москва
| Период выполнения при поддержке РНФ | 2022 г. - 2024 г. |
Конкурс№68 - Конкурс 2022 года «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований отдельными научными группами».
Область знания, основной код классификатора 04 - Биология и науки о жизни, 04-206 - Физиология и биохимия растений
Ключевые словаагробактерии, агробактериальная инфекция, синтетическая биология, биоинженерия, флуоресценция, люминисценция, сверхразрешающая микроскопия, трансгенные растения, T4SS,
Код ГРНТИ34.15.27
ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ
Аннотация
Доставка ДНК в живые организмы является необходимым элементом большинства как фундаментальных, так и прикладных исследований в области молекулярной биологии и биотехнологии. В биотехнологии растений для доставки ДНК в целевой организм наиболее часто используются бактерии вида Agrobacterium tumefaciens, выработавшие в процессе эволюции эффективный аппарат переноса части плазмидной ДНК в геном организма-хозяина. В помощью агробактериальной трансформации получены большинство используемых в сельском хозяйстве сортов генно-модифицированных растений, а в научных исследованиях агробактериальная трансформация является основным методом создания трансгенных растений, а также многих плохо поддающихся генетической трансформации микроорганизмов.
Несмотря на свою экономическую и научную значимость, механизм и динамика заражения и переноса ДНК при агробактериальной трансформации изучены недостаточно. В научной литературе до сих пор нет ответов на такие базовые вопросы, как взаимодействие молекул на поверхности агробактерий с клеточной стенкой растений, способы уклонения агробактерий от молекулярных защитных механизмов растений, пределы размеров переносимой последовательности ДНК. В литературе также содержатся противоречивые данные о роли отдельных растительных белков в транслокации оцДНК в ядро. Даже роль в развитии инфекции отдельных vir-генов, например VirF, не до конца прояснена. На удивление мало разработан и инструментарий для воздействия на генетику и физиологию агробактерий: в частности, до сих пор не существует систематических данных о функционировании конститутивных и индуцируемых промоторов в агробактериях, нет доступных агробактериальных инструментов оптогенетического контроля экспрессии генов, нет оптимизированных для агробактерий инструментов редактирования генома.
Настоящий проект направлен на создание набора хорошо охарактеризованных генетических элементов для синтетической биологии агробактерий. Создание такого набора позволит быстро и модульно объединять различные репортерные и эффекторные генетические элементы в реплицирующиеся в агробактериях плазмиды с предсказуемой копийностью и уровнем экспрессии. Разработка набора с использованием современных подходов синтетической биологии позволит создать инструментарий, широко применимый для фундаментальных исследований этой важной группы бактерий. С его помощью можно будет также проводить точные исследования динамики и механизмов заражения растений агробактериями, механизмов интеграции геномной ДНК и взаимодействия с хроматином растений. Наконец, инструментарий для генетического редактирования агробактерий и изменения их физиологических процессов откроет возможности для создания новых штаммов с высокой эффективностью переноса ДНК в немодельные растения.
Ожидаемые результаты
В ходе реализации настоящего проекта впервые будет создан современный инструментарий синтетической биологии, адаптированный для изучения агробактерий.
Этот набор генно-инженерных инструментов (плазмиды, репортерные белки, конститутивные и индуцируемые промоторы) впервые будет адаптирован для использования в агробактериях, и приведен к стандартам современных методов модульного клонирования, применяемых в синтетической биологии. Созданный набор будет востребован растительными биологами, а также может быть применен в биотехнологии.
С использованием разработанных подходов впервые будет проведено систематическое исследование всех стадий развития агробактериальной инфекции на единой экспериментальной платформе. Современные методы флуоресцентной микроскопии будут применены для визуализации заражения агробактериями растений на всех стадиях – от индукции vir-генов, до встройки в геном растения и активации защитных механизмов со стороны растений. Решение этой задачи позволит получить ответы как на фундаментальные вопросы (уточнение последовательности и длительности стадий заражения и механизмов интеграции в геном), так и на прикладные: улучшение эффективности переноса ДНК и частоты получения трансгенов, тестирование возможности использования созданной платформы для скрининга ингибиторов секреторной системы IV типа, сходной по строению и функциям с аналогичными системами многих возбудителей инфекционных болезней, а также важного и в распространение устойчивости к антибиотикам в микробиологических сообществах.
Поскольку данные результаты будут получены на воспроизводимой, масштабируемой, и современной модельной системе, мы ожидаем, что специалисты в области молекулярной биологии растений, физиологии растений, и растительной биотехнологии, а также специалисты, изучающие горизонтальный перенос генов в микробных сообществах будут использовать полученные нами наработки и результаты в качестве основы своих будущих исследований.
ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ
Аннотация результатов, полученных в 2022 году
Целью данного проекта является создание и применение современного инструментария для исследования основных процессов биологии Agrobacterium tumefaciens с целью адаптации и оптимизации их для прикладной инженерии.
В рамках выполнения Проекта в отчетном периоде были выполнены следующие задачи:
1. В результате биоинформатического анализа генома A. tumefaciens были отобраны нуклеотидные последовательности, идентифицированные как промоторы и терминаторы.
2. Была получена коллекция агробактериальных точек начала репликации, адаптированных под стандарты модульного клонирования MoClo.
3. Были собраны и протестированы стандартизированные агробактериальные вектора, совместимые со стандартом клонирования MoClo, содержащие различные кассеты селективных маркеров, точки начала репликации в E. coli, а также различные точки начала репликации агробактерий.
4. Были получены коллекции MoClo-совместимых регуляторных элементов: промоторов и терминаторов.
5. Также были получены коллекции различных репортерных систем: флуоресцентных и флуороген-активируемых белков и систем автономной биолюминесценции.
6. Были получены различные инструменты редактирования генома и контроля экспрессии (оптического и химического), адаптированные для агробактерий.
7. Был проведен систематический скрининг различных вариантов транскрипционных единиц, кодирующих зеленый флуоресцентный белок на модели агробактериального заражения растительных клеток. Были определены наилучшие комбинации промотор-терминатор, а также выявлена зависимость уровня экспрессии репортерного белка от количества агробактерий, использованных для заражения.
Достигнутые результаты закладывают основу молекулярного инструментария для исследования процессов заражения растительных клеток агробактериями.
Публикации
1. Шахова Е.C., Маркина Н.М., Митюшкина Т.Ю., Бугаева Е.Н., Каратаева Т.А., Палкина К.А., Фахранурова Л.И., Ямпольский И.В., Саркисян К.C., Мишин А.С. Systematic comparison of plant promoters in Nicotiana spp. expression systems International Journal of Molecular Sciences, 23(23), 15441 (год публикации - 2022) https://doi.org/10.3390/ijms232315441
Аннотация результатов, полученных в 2023 году
Целью данного проекта является создание и применение современного инструментария для исследования основных процессов биологии Agrobacterium tumefaciens с целью адаптации и оптимизации их для прикладной инженерии. В рамках данного проекта за прошлый отчетный период был создан набор флуоресцентных и люминесцентных репортеров, а также промоторы и терминаторы для регуляции экспрессии целевых белков в агробактериальных клетках.
Продолжая выполнение задач Проекта в текущем отчетном периоде было определено влияние созданных ранее промоторов и терминаторов на уровень экспрессии белков в клетках агробактерий. Было обнаружено несколько промоторов, которые обеспечивают более высокий уровень экспрессии, чем сильный синтетический промотор J23100, которые были добавлены в создаваемый набор.
Были определены оптимальные концентрации IPTG, салицилата натрия и тетрациклина для индукции экспрессии с использованием соответствующих индуцибельных систем. Для данных систем были определены динамические диапазоны ответа.
Была показана возможность использования левансукразы SacB для негативной селекции агробактериальных клеток. В то же время, с использованием фотосенсибилизаторов KillerRed и KillerOrange не удалось достичь снижения жизнеспособности агробактерий.
Была проведена визуализация белка VirE2, участвующего в заражении растительных клеток Nicotiana tabacum BY-2 и гистона H2B. Также в условиях локализационной микроскопии были получены субдифракционные изображения VirE2 в клетках агробактерий и клатрина в клетках BY-2.
Было определено влияние некоторых параметров агробактериального заражения культуры растительных клеток на уровень транзиентной экспрессии. Было показано, что стадия инкубации полусухих растительных клеточных агрегатов с агробактериями не является необходимой. Также показано заметное влияние температурных условий культивации агробактерий на начальных этапах агробактериального заражения, и определен оптимальный температурный диапазон для культивации агробактерий.
Публикации
1. Палкина К.А., Каратаева Т.А., Перфилов М.М., Фахранурова Л.И, Маркина Н.М., Гонзалес Л.C., Гарсия-Перез Е., Вазкуез-Вилар М., Родригез-Родригез М., Вазкуез-Вилриалес В., Шахова Е.С., Митюшкина Т., Белозерова О.А., Ковальчук С.И., и др. A hybrid pathway for self-sustained luminescence Science Advances, - (год публикации - 2023)
2. Шахова Е.С., Каратаева Т.А., Маркина Н.М., Митюшкина Т., Палкина К.А., Перфилов М.М., Вуд М.Г., Хоанг Т.Т., Холл М.Р., Фахранурова Л.И, Блохина А.Е., Малышевская А.К., Горбачев Д.А., Бугаева Е.Н., Плетнева Л.К., Бабенко В.В., и др. An improved pathway for autonomous bioluminescence imaging in eukaryotes Nature Methods, - (год публикации - 2023)