Аннотация результатов, полученных в 2022 году
Для решения фундаментальной задачи исследования было показано, что непраймированные эндотелиоциты (культура клеток EA.hy926) в течение длительного времени стабильно экспрессируют Р- и Е-селектины, интегрины VCAM-1, ICAM-1 и эндоглин, а непраймированные нейтрофилы основные молекулы комплекса интегринов (CD18, CD11a, CD11b). Стабильность экспрессии позволила оценить суммарную силу и работу межклеточных адгезионных контактов в системе «нейтрофил-эндотелиоцит». Выявлена значительная вариабельность силы и работы адгезии в зависимости от донора нейтрофилов. Измерения силы адгезии показало, что она может варьировать от 20 до 50 пН, а работа адгезии определяется в диапазоне от 200 до 800 аДж в зависимости от донора нейтрофилов. Моделирование ситуации септикоцемии in vitro дает однозначные данные о статистически значимом снижении силы и работы межклеточных адгезионных контактов под воздействием как грамположительных (S.aureus), так и грамотрицательных (E.coli) бактерий. Таким образом, при септикоцемии одним из факторов патогенности бактерий может являться стратегия срыва адгезии - начального этапа процесса трансэндотелиальной миграции нейтрофилов. Происходит своеобразный «арест» нейтрофилов в кровяном русле. Показано преимущество метода сканирующей ион-проводящей микроскопии в исследовании живых клеток крови, которое позволяет в высокоскоростном режиме получать не только морфологическое изображение клетки, но и строить карту ригидности лимфоцитов, нейтрофилов, эритроцитов. Для решения прикладной задачи исследования была создана коллекция бактериальных штаммов (клинических изолятов). Был определен их биохимический профиль и чувствительность/ резистентность к антибиотикам классическим диско-диффузионным методом. Была разработана принципиально новая система детекции чувствительности/ резистентности к антибиотикам на основе определения нанодвижений бактерий. Нанодвижения регистрировались по осцилляции кантилевера на атомно-силовом микроскопе. Для оптимального снятия DFL сигнала были отработаны: температура, время, среда, в которой проводилось наблюдение, концентрация антибиотика, режим функционализации кантилевера. Кроме того, был выбран математический алгоритм обработки сигнала, дающий релевантные результаты. Созданная система дает следующие варианты поведения: (1) незначительные колебания функционализированного кантилевера – контроль, (2) сильная осцилляция связанная с нанодвижениями бактерий на кантилевере, которые, в свою очередь, обусловлены метаболической активностью бактерий, (3) падения амплитуды осцилляции вследствие гибели бактерий, вызванной воздействием антибиотика, свидетельствующие о чувствительности бактерий к антибиотику, (4) сохранение высокой амплитуды колебаний или даже ее усиление после воздействия антибиотика, свидетельствующее о резистентности бактерий к антибиотику. Проведено сравнение вновь созданной системы с классическими методами оценки антибиотикорезистентности: диско-диффузионным и методом подсчета КОЕ и показано полное соответствие получаемых результатов. Преимуществом вновь созданной системы является то, что она дает ответ об антибиотикорезистентности уже через час после начала исследования.

Аннотация результатов, полученных в 2023 году
При моделировании бактеремии важно отслеживать изменение уровня экспрессии селектинов и интегринов, играющих важнейшую роль в реакциях трансэндотелиальной миграции (особенно на стадиях адгезии, роллинга и переползания). Экспрессию молекул на мембране эндотелиальных клеток детектировали с использованием флуоресцентной микроскопии, а уровень экспрессии оценивали методом проточной цитометрии. В качестве положительного контроля использовали TNF. Уровень экспрессии эндоглина статистически значимо увеличивался через 4 ч наблюдений под влиянием S. aureus, экспрессия VCAM1 возрастала через 1 ч под действием TNF и снижалась через 3-4 ч под действием S. aureus. Количество обнаруживаемых на поверхности эндотелиальных клеток P- и Е- селектинов также снижалось под действием золотистого стафилококка на 2-4 ч наблюдения, при этом наблюдалась индукции экспрессии этих молекул через 1 ч под влиянием TNF. При анализе основных молекул адгезии нейтрофилов (CD18, CD11a, CD11b) не было выявлено каких-либо значимых изменений в уровнях экспрессии этих молекул с течением времени. Подавление экспрессии VCAM-1, P- и E-селектинов является возможным объяснением снижения адгезионных взаимодействий между нейрофилами и эндотелиоцитами, которое было обнаружено на первом этапе исследования. Методом Вестерн-блота впервые показано, что снижение представительства селектинов, интегринов и адгезинов не связано с шеддингом рецепторов с поверхности мембран эндотелиоцитов и нейтрофилов. Однако, наличие следовых количеств растворимых молекул VCAM-1 после инкубации с E.coli заставило нас задуматься о возможном разрушении растворимых форм рецептора бактериальными протеазами, поэтому на следующем этапе исследования будут использованы ингибиторы бактериальных протеаз для подтверждения отсутствия шеддинга рецепторов под воздействием исследуемых штаммов. Исследование опсонизации S.aureus и E.coli на кондиционирующий эффект бактерий в системе взаимодействия «эндотелиоцит-нейтрофил» показало, что сила адгезии между нейтрофилом и эндотелиоцитом снижается в большей степени под воздействием опсонизированных S.aureus в сравнении с неопсонизированными, тогда как работа на разрыв, напротив, статистически значимо увеличивается. Это может свидетельствовать о том, что при кондиционировании взаимодействия опсонизированными S.aureus аффинность связи между рецепторами иммунных клеток снижается, однако, клетки пытаются скомпенсировать это снижение за счет установления большего количества специфических и неспецифических межклеточных контактов. В случае кондиционирования адгезионных процессов E. coli наблюдается обратная тенденция: под воздействием опсонизированных бактерий сила адгезии между нейтрофилом и эндотелиоцитом падает меньше. Это может быть обусловлено тем фактом, что липополисахарид (ЛПС) и другие поверхностные факторы патогенности оказываются заэранированными опсонинами и не вносят такого существенного вклада в снижение межадгезионных контактов. Нельзя также исключить сборку мембран-атакующего комплекса комплемента, который мог вызвать разрушение бактериальных клеток. Требуется дополнительное исследование влияния ЛПС на адгезию между нейтрофилами и эндотелиоцитами. Важным выводом является выявление разного эффекта опсонизации на кондиционирующий эффект, вызванный Грам(+) и Грам(-) бактериями в системе адгезионных контактов между нейтрофилами и эндотелиоцитами. Было разработано несколько двухсекционных моделей для исследования процесса трансэндотелиальной миграции нейтрофилов по градиенту хемоаттрактации с помощью высокоразрешающей микроскопии. Было показано, что использование атомно-силовой микроскопии (АСМ) невозможно для моделирования процесса септикопиемии и исследования диапедеза нейтрофилов. Это объясняется: (1) наличием ундуляции мембраны, на которой стерильно выращивалась культура эндотелиальных клеток Ea.hy926, при использовании резонансных режимов сканирования, и разрыв мембраны при использовании контактного режима, (2) ограничениями сканирования по оси z (при исследовании процесса миграции нужно не просто отслеживать морфологию монослоя, но высоты сканера должно хватать на прописывание эндотелиоцитов и нейтрофилов). Выходом явилось использование сканирующей ион-проводящей микроскопии (СИПМ), обладающей преимуществами перед АСМ: (1) практически полным отсутствием воздействия на клетки, (2) намного более высокой скоростью сканирования, (3) намного более высоким разрешением при сканировании по оси z (за счет "прыжкового" режима"), (4) возможностью создавать карту ригидности клеток. Была получена информация не только о микроструктуре мембран эндотелиоцитов, но и определена структура микрофиламентозных образований и ядрышек. Ригидность мембран эндотелиоцитов варьировала от 357 до 796 Па. Максимальная ригидность отмечается у филаментов клеток – 1536 Па, и ядрышек – 1729 Па. Для решения задачи по экспресс-тестированию антибиотикорезистентности использовали АСМ в режиме осцилляции. Для подтверждения релевантности вновь разработанной методики использовали классические методы: (1) подсчета КОЕ для определения жизнеспособности (предыдущий год), (2) диско-диффузионный (в прошлом и в этом году). Результаты всех трех используемых методов полностью совпадают. Но в отличие от классических методов использование экспресс-тестирования антибиотикорезистентности методом АСМ по определению нанодвижений бактерий позволяет получить результаты по чувствительности/ резистентности уже через час от начала исследования. То, что нанодвижения бактерий обусловлены их метаболической активностью было доказано благодаря использованию «бедных» и «богатых» питательных сред. Аналитический сигнал DFL падал статистически значимо у всех штаммов при культивировании в физиологическом растворе, по сравнению с более «богатой» средой LB. Анализ профилирования продемонстрировал особенности метаболической активности бактерий в разных питательных средах. В частности, S.aureus 2879 M и P.mirabilis 649-2 оказались высокочувствительными к высокой концентрации соли и давали слабый отклик на среде LB (Миллер), тогда как E.coli 321 была индифферентна к концентрации соли в LB, но резко снижала метаболическую активность и нанодвижения в МПБ (аналитический сигнал был даже ниже, чем в физиологическом растворе), а K.pneumonia 173-p2, напротив, отдавала предпочтение высокой концентрации соли, ее максимальная метаболическая активность регистрировалась на среде LB (Миллер). Помимо культуральных методов анализа для доказательства гибели бактерий под воздействием антибиотиков была использована высокоразрешающая сканирующая электронная микроскопия, которая также продемонстрировала полное совпадение результатов с культуральными методами и с разработанным нами методом экспресс-тестирования. АСМ в режиме осцилляции использован для тестирования антибиотикорезистентности широкого диапазона микроорганизмов, выделенных и охарактеризованных на предыдущем этапе исследования: P. mirabilis 649-2, K.pneumoniae 173-p2, и культуры высокочувствительные E.coli 321, S. aureus 2879M, A.baumannii 173-p1. Все эксперименты проводились не менее чем в 4-5 повторностях, помимо самого факта чувствительности/ резистентности исследовалась динамика этого свойства. Обнаружена интересная тенденция: при определении чувствительности/резистентности бактерий к антибиотикам можно уже на основе времени падения осциллирующего сигнала, свидетельствующего о жизнеспособности бактерий, сделать прогноз о степени чувствительности бактерий к антибиотикам. В случае падения сигнала на 15 минуте можно рассчитывать на высокую чувствительность бактерии к антибиотику, в случае падения сигнала на 30-45 мин можно ожидать умеренную чувствительность, а если сигнал не падает до 60 мин исследования, то бактерия с высокой вероятностью будет резистентна к антибиотику. Полученные данные являются чрезвычайно перспективными и привлекательными для использования в клинической практике и позволят избежать стадии эмпирической антибиотикотерапии.