Аннотация результатов, полученных в 2022 году
Объектами исследования по проекту являются редкие и исчезающие растения Якутии, на данном отчетном периоде нами охвачены работы и выполнены эксперименты со следующими видами растений: Dracocephalum jacutense Peschkova, категория «1», Lilium pilosiusculum (Freyn) Miscz., категория «2 б». Для расширения работ в отчетный период работы включены и следующие объекты, которые не были включены в план работ 2022 года: Artemisia martjanovii Krasch. ex Poljakov, категория «3 д» - крайне редкий подвид, реликт, Polygala sibirica L., категория «3 в» - редкий вид (Красная книга РС(Я). Разработаны и апробированы оптимальные протоколы стерилизации семенного материала и условия к культивированию in vitro асептических проростков объектов исследования D.jacutense, L.pilosiusculum, A. martjanovii, P.sibirica. Получены стерильные проростки из семян интактных растений D. jacutense, L.pilosiusculum, A.martjanovii, P.sibirica. Отработан метод стратификации и стерилизации семян для эффективного выведения проростков. Проведен эксперимент с использованием суспензии оксида графена (ОГ) с различными концентрациями (0,5; 1; 1,5; 2; 2,5; 3 мкг/л) для прорастания семян объектов. При этом процент всхожести после обработки во всех концентрациях суспензии ОГ был намного меньше, чем в контрольном варианте (контрольный вариант – семена, посаженные на питательную среду МС без обработки суспензией ОГ). При концентрации суспензии ОГ от 2 до 3,5 мкг/л наблюдалась 10-12%-ная всхожесть семян. Выполнен отбор оптимального типа экспланта проростков, выращенных in vitro к инициации асептической культуры и индукции побега D.jacutense, L. pilosiusculum, A.martjanovii, P.sibirica. Проведены работы по введению растений D.jacutense, L.pilosiusculum, A.martjanovii, P.sibirica in vitro с использованием эксплантов интактных растений. В качестве питательной среды использована среда МС с фитогормонами НУК, БАП, 2,4-Д, кинетин. Для получения интенсивного каллусообразования соответствовало сочетание 2,4-Д 1 мг/л, НУК 1 мг/л и кинетина 1 мг/л. Изучена динамика роста биомассы культуры P.sibirica L. под воздействием регуляторов роста. Путем индукции возникновения адвентивных почек тканями экспланта получили микропобеги L.pilosiusculum. Активная инициация роста побегов на чешуйках луковицы L.pilosiusculum получена при сочетании цитокинина, БАП, 2,4-Д. Инициация и рост побегов наблюдается также на питательных средах МС с добавлением БАП и ГК. Апробированы и отобраны оптимальный состав и концентрация регуляторов роста к непрямому органогенезу объектов исследования из эксплантов стерильных проростков, выращенных in vitro. Путем инициации роста побегов на каллусной ткани получены микропобеги P.sibirica, A.Martjanovii. Микроразмножение P. sibirica L. и A.Martjanovii получено на вариантах питательной среды МС с регулятором роста БАП (0,5 мг/л, 1 мг/л). Наблюдается интенсивное микроразмножение. Заложены эксперименты по инициации роста корней и корнеобразования микроразмноженных Dracocephalum jacutense, Lilium pilosiusculum, Artemisia martjanovii, Polygala sibirica на вариантах питательной среды МС с регуляторами роста НУК, ИМК с предварительным воздействием на вводимые образцы микропобегов суспензией оксида графена (в концентрации 0,5; 1,0; 1,5; 2,0; 2,5; 3,0 мкг/л). Проведение RAPD-анализа для выявления генетической изменчивости актуальна для изучения малоисследованных таксономических групп, в числе которых модельный объект D.jacutense Peschkova. Для проведения анализа генетической стабильности нами из 5 высушенных образцов были выделены и сохранены нативные геномные ДНК. Геномную ДНК выделяли из ранее высушенных образцов D.jacutense, с помощью коммерческого набора DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, Германия), в соответствии с протоколом и рекомендациями производителя. Качественный анализ выделенных геномных ДНК был проведен с использованием метода спектрофотометрии на приборе SpectroStar Omega (BMG Labtech). Количественный анализ (концентрация) выделенных геномных ДНК был проведен методом флуориметрии на приборе Qubit 2.0 (Invitrogen™, USA). Для апробации неспецифических праймеров были выбраны следующие праймеры с 5’-3 ’последовательностями: (Pr2) AATCGGGCTG; (Pr18) AATCGGGCTG. Амплификацию ДНК проводили в конечном объеме 25 мкл. ПЦР-реакцию проводили в термоциклере (С1000 Bio-Rad, Bio-Rad Laboratories, Inc) по разработанному протоколу. Продукты амплификации разделяли гель-электрофорезом на 1,5% агарозном геле в течение 110 мин при 70 В. Гель визуализировали в гель документирующей системе (GelDoc XR, Bio-Rad Laboratories, Inc.), размеры фрагментов ДНК оценивали путем сравнения со стандартной маркерной лестницей в 3 т.п.н. (Step100 Long «BiolabMix»). На основе анализа принято решение использовать в дальнейших экспериментах праймер Pr18. С помощью методов ВЭЖХ и ВЭЖХ в сочетании с масс-спектрометрией в режиме четырехступенчатого разделения ионов (MS/MS режим) нами впервые изучен полифенольный состав и соединения других групп в интактном и культивированном D.jacutense Peschkova. Для анализа использованы отдельно надземная фитомасса растений, и по отдельности соцветия, листья, стебли. Для выполнения разделения многокомпонентных смесей использовали жидкостный хроматограф высокого давления Shimadzu LC–20 Prominence HPLC (Shimadzu, Япония). Масс-спектрометрические данные высокой точности записаны на масс-спектрометр amaZon SL (производство фирмы «BRUKER DALTONIKS», Германия), оснащенный источником ESI в режиме отрицательных и положительных ионов. Каждый вид экстракта D. jacutense показал существенное различие в составе полифенолов, а также в составе других биоактивных соединений. Структурную идентификацию каждого соединения проводили на основе их точной массы и фрагментации МС/МС с помощью ВЭЖХ-ESI-ионной ловушки-МС/МС. В общей сложности 156 биологически активных соединений были успешно охарактеризованы в экстрактах D. jacutense на основе их точной МС, фрагментных ионов, поиска в онлайн-базах данных и литературных данных. Все идентифицированные соединения вместе с молекулярными формулами, данными МС/МС и их сравнительным профилем для D. jacutense суммированы в виде таблицы (в публикации). В экстрактах растения из ценопопуляции D. jacutense и интродуцированного растения D. jacutense идентифицировано 105 полифенольных соединений и 51 соединение других химических групп, всего 156 соединений. Из них полифенолы в экстрактах дикорастущих растений составляют 70,2 % (91 соединение), в экстрактах интродуцированных растений – 65 % (52 соединения). Сходство экстрактов дикорастущего и интродуцированного D. jacutense отмечено по 54 соединениям, относящимся к 12 группам полифенолов и 12 группам других соединений. Полное сходство по количеству и индивидуальным соединениям для полифенолов отмечено в группе флаванонов. В составе других групп соединений как дикого, так и интродуцированного D. jacutense обнаружены бензолдиол, птерокарпан, вебонол, фенилпропановая кислота, дигидрохалкон, кумарин, кумарин глюкозид, стеаридоновая и линоленовая кислоты. Различие между экстрактами дикорастущего и интродуцированного D. jacutense отмечено по 103 индивидуальным соединениям, в том числе 13 группам полифенолов и 24 группам других соединений. Организованы и выполнены стационарно-маршрутные экспедиционные работы на естественные местообитания редких и исчезающих видов растений Якутии с целью обследования, описаний, сбора образцов к работам. Собраны экземпляры Artemisia Martjanovii, Polygala sibirica, Lilium pilosiusculum, Dracocephalum jacutense. Информация по выполнению проекта размещена на сайтах https://www.s-vfu.ru/universitet/nauka/news/news_detail.php?ELEMENT_ID=193022 и https://www.s-vfu.ru/news/detail.php?SECTION_ID=15&ELEMENT_ID=193067. По результатам работы было подготовлено 3 рукописи, из которых одна рукопись принята к публикации в рецензируемом Web of Science и Scopus журнале (Q1) на 2022 год, одна рукопись принята к публикации в рецензируемом Web of Science и Scopus журнале (Q3) на 2023 год.

Аннотация результатов, полученных в 2023 году
При культивировании на МС с добавлением БАП (1 мг/л) из листовых и стеблевых эксплантов от интактного растения инициирован in vitro каллусогенез Dracocephalum jacutense в условиях фитостеллажа при 25°С, влажности 60%, интенсивности освещения 5000 лк с фотопериодом 18/6. При пересадке стерильных проростков D. jacutense на МС с добавлением ИМК (1 мг/л) на 30-ые сутки наблюдается обильное корнеобразование; на МС с добавлением БАП (1 мг/л) на 15-ые сутки наблюдается развитие и обильное образование побегов. При культивировании на МС с добавлением 2,4-Д (1 мг/л), БАП (1 мг/л), НУК (1 мг/л) получали стабильно растущие каллусные культуры клеток Polygala sibirica. При этом прирост сырого веса был больше в 1,9±0,2 раза, сухого веса в 5,5±0,1 раза, чем на варианте МС с добавлением 2,4-Д и НУК в сочетании с кинетином. Инициирован in vitro непрямой морфогенез P. sibirica при культивировании каллусной ткани на МС с добавлением БАП (1 мг/л). Инициирован in vitro ризогенез у размноженных микрорастений истода сибирского при культивировании на МС c добавлением НУК (1 мг/л). Интенсивное in vitro побегообразование у Lilium pilosiusculum наблюдается при культивировании на МС с добавлением БАП (1 мг/л). При пересадке микропобегов L. pilosiusculum на МС с добавлением TDZ (5 мг/л) наблюдается побегообразование с появлением рыхлой каллусной массы. При добавлении в МС БАП (1 мг/л) и НУК (0,5 мг/л) наблюдается побегообразование без листьев и развитие от 5 до 10 шт. корней. При варианте культивирования на МС с добавлением БАП (1 мг/л) и НУК (1 мг/л) у микропобегов лилии кудреватой наблюдается развитие корневой системы с образованием множественных молодых побегов в количестве 10-20 шт. При культивировании микрорастений L. pilosiusculum на МС с добавлением НУК (0,5 мг/л) наблюдается инициация образования корней, образуются тонкие и укороченные корни. Интенсивное образование корней наблюдается при культивировании микрорастений L. pilosiusculum на МС с добавлением НУК (1 мг/л). При культивировании микрорастений на МС с добавлением ИМК (1 мг/л) наблюдаются интенсивное корнеобразование, побегообразование (до 20–30 шт.) и рост листьев. Изучается влияние суспензии оксида графена на развитие микропобегов L. pilosiusculum. При этом микропобеги, полученные на МС с добавлением ИМК (1 мг/л) были пересажены на питательную среду с таким же составом, но с добавлением суспензии оксида графена (0,5; 1; 1,5; 2; 2,5; 3 мг/л). При дальнейшем культивировании пересаженных микропобегов в условиях фитостеллажа наблюдается развитие побегов и листьев. Укорененные микрорастения L. pilosiusculum пересажены в почвенные субстраты для изучения первого этапа адаптации и содержатся в инсталлированных мини-парниках в условиях фитостеллажа с фотопериодом 16/8. Наибольшая частота in vitro индукции образования микропобегов Artemisia martjanovii наблюдается при культивировании кусочков каллусной ткани на МС с добавлением БАП (1 мг/л). Изучали in vitro инициацию корнеобразования у микропобегов A. martjanovii при культивировании на МС с добавлением ИМК (0,5/1 мг/л) и НУК(0,5/1 мг/л). Интенсивное корнеобразование наблюдается у микропобегов A. martjanovii при культивировании с добавлением НУК (1 мг/л). Масштабирован рост микрорастений A. martjanovii с укоренением. Микрорастения имеет длину корней от 3 до 12 см. Выполнена пересадка укорененных микрорастений A. martjanovii в почвенный субстрат, пересаженные микрорастения содержатся в инсталлированных мини-парниках в условиях фитостеллажа с фотопериодом 16/8. Проведен сравнительный анализ генетической стабильности образцов полученных in vitro стерильных проростков, дикорастущих и интродуцированных растений Dracocephalum jacutense. Выявлен коэффициент сходства в 0.666 (KJ) между образцами стерильных пророcтков и дикорастущего змееголовника якутского. Получены результаты сравнительного анализа генетической стабильности образцов микрорастений Lilium pilosiusculum и Artemisia martjanovii на основе RAPD-анализа при сравнении с образцами дикорастущих растений и проростками, культивируемыми in vitro. По данным анализа выявлена устойчивая генетическая стабильность между получаемыми микрорастениями Lilium pilosiusculum со значением коэффициента сходства в 1 (KJ). По результатам сравнительного анализа коэффициента сходства для образцов Artemisia martjanovii выявлено отличие во фрагментах ДНК в вариантах образцов стерильного проростка и микрорастений, полученных на МС с добавлением НУК. Среди образцов микрорастений A. martjanovii наибольшая величина в 1 (KJ) выявлена среди образцов микрорастений, полученных на МС с добавлением НУК и БАП. Экстракты надземной фитомассы Polygala sibirica были проанализированы с помощью ВЭЖХ-MС/MС с ионной ловушкой. Предварительно идентифицировано 74 индивидуальных соединения, включая 43 полифенольных соединения и 31 соединение других химических групп. На основе анализа полученных данных можно заключить, что Polygala sibirica центрально-якутской популяции имеет весьма большие возможности применения в медицине. Наибольший интерес вызывает изучение целого комплекса биологически активных соединений полифенольной группы, впервые обнаруженных в семействе Polygalaceae: Isoformononetin; Jaceosidin; Syringetin; Apigenin-7-O-glucoside; Herbacetin; Myricetin; Quercetin-3-O-hexoside; Afzelechin; Hesperitin; Eriocitrin; Delphinidin 3-O-glucoside; Malvidin 3-O-glucoside и др. С помощью UPLC-ESI-MS был проведен фитохимический анализ стерильных проростков Artemisia martjanovii, полученных in vitro. Установлено, что в экстрактах A. martjanovii присутствует не менее 4 полярных соединений, которые элюируются с хроматографической колонки в пределах 1–4 минут анализа. Обнаруженные соединения являются производными (фенилпропаноидными эфирами) хинной и хлорогеновой кислоты. Был проведен полуколичественный анализ мажорных эфиров хинной кислоты в экстрактах образцов стерильных проростков A. martjanovii. С помощью UPLC-ESI-MS была проведена структурная идентификация соединений в образцах корней, чешуек луковиц и микрорастений Lilium pilosiusculum. Установлено, что в экстрактах L. pilosiusculum присутствует не менее 5 полярных соединений, которые элюируются с хроматографической колонки в пределах 0,1–4 минут анализа. Обнаруженные соединения являются производными сахарозы, в т.ч. фенилпропаноидные эфиры сахарозы. Был проведен полуколичественный анализ мажорных эфиров сахарозы в экстрактах образцов L. pilosiusculum. Укорененные микрорастения объектов исследования после прохождения 2-3-х недельной адаптации в почвенном субстрате в условиях мини-парника в лаборатории передавались для исследований в условиях ботанического сада. Для этих работ в ботаническом саду была устроена мини-теплица. Осуществляется уход за растениями-регенерантами с поливом и подкормкой. Еженедельно проводится учет морфометрических показателей наблюдаемых растений-регенерантов. Выполнена пересадка растений-регенерантов на открытый грунт, на зиму посадки укрыты лутрасилом и скошенной травой. Были организованы и выполнены экспедиционные работы по сбору растительного материала к выполнению задач проекта на территории Хангаласского района (19.06.2023), Нюрбинского района (03-07.07.2023), Кобяйского района (03-06.08.2023) РС(Я). Информация о выполняемых работах со ссылкой на грант РНФ была опубликована в «Улус Медиа» (17.09.2023) https://xn--80aaaaaqpp6as1cq2a.xn--p1ai/polyn-martyanova-istod-sibirskij-uchyonye-izuchayut-rasteniya-elanki/, газете «Ньурба (Огни Нюрбы)» (24.09.2023, №36(12060), С. 8), газете «Хангалас» (29.09.2023, №38(12384), С.5), газете «Кобяйский Вестник» (20.10.2023, №41 (9325), С. 6). С результатами исследования члены научного коллектива приняли участие в 7 научно-практических конференциях регионального, всероссийского и международного уровней с устными онлайн докладами, с заочным и онлайн участием. По результатам работы опубликованы 3 научные статьи в российском и зарубежных журналах, рецензируемых в БД WoS, Scopus.